3.3.1. Chuẩn bị chế phẩm
Nguyên tắc tính liều: Theo liều phương thuốc cổ truyền là 1 thang thuốc/người (50kg)/ngày.
Suy ra liều cao đặc bài thuốc cho 1 người (50kg)/ngày như sau: - Cao sắc nước: 14,75g cao/người (50kg)/ngày [27].
- Cao chiết ethanol: 8,80g cao/người (50kg)/ngày [27].
Ngoại suy: Hệ số ngoại suy liều có hiệu quả tương đương giữa người và động vật thí nghiệm - chuột nhắt trắng là 12 [9].
Suy ra liều tương đương ngoại suy trên chuột nhắt trắng là:
- Liều tương đương tác dụng của cao chiết ethanol: 2,11g cao/kg TT/ngày.
Từ đó làm cơ sở tính toán liều thử tác dụng sinh học: Thử ở các mức liều sau:
- Cao sắc nước:
Liều thấp: bằng liều tương đương: 3,54g cao/kg TT/ngày. Liều cao: gấp ba liều tương đương: 10,62g cao/kg TT/ngày. - Cao chiết ethanol:
Liều thấp: bằng liều tương đương: 2,11g cao/kg TT/ngày. Liều cao: gấp ba liều tương đương: 6,33g cao/kg TT/ngày. - Thuốc đối chiếu:
Liều methylprednisolon chống dị ứng trên chuột trong thực nghiệm là 12mg/kg, 6 mg/kg.
Liều ketotifen chống dị ứng trên chuột trong thực nghiệm là 1mg/kg
3.3.2. Khảo sát tác dụng chống dị ứng bằng phương pháp gây shock phản vệ vệ
- Động vật thí nghiệm: chuột nhắt trắng chủng Swiss, cả hai giống, khỏe mạnh, trọng lượng 25 ± 2 g.
- Tiến hành: 60 chuột nhắt trắng được chia ngẫu nhiên thành 6 lô, mỗi lô 10 con.
Lô 1 (Mô hình): Gây mô hình bằng Compound 48/80 liều 8mg/kg tiêm màng bụng.
Lô 2 (Methylprednisolon): Gây mô hình bằng Compound 48/80 liều 8mg/kg tiêm màng bụng. 1 giờ trước khi tiêm Compound 48/80, chuột được uống methylprednisolon liều 12 mg/kg.
Lô 3 (Thử EZ-H1): chuột được uống thuốc thử EZ chiết nước liều 3,54g/kg 1 giờ trước khi gây mô hình shock bằng Compound 48/80 liều 8mg/kg.
Lô 4 (Thử EZ-H2): chuột được uống thuốc thử EZ chiết nước liều 10,62g/kg 1 giờ trước khi gây mô hình shock bằng Compound 48/80 liều 8 mg/kg
Lô 5 (Thử EZ-E1): chuột được uống thuốc thử EZ chiết cồn liều 2,11g/kg 1 giờ trước khi gây mô hình shock bằng Compound 48/80 liều 8mg/kg.
Lô 6 (Thử EZ-E2): chuột được uống thuốc thử EZ chiết cồn liều 6,33g/kg 1 giờ trước khi gây mô hình shock bằng Compound 48/80 liều 8mg/kg.
Tác nhân gây sốc phản vệ là dung dịch Compound 48/80 0,4% (mg/ml) pha trong nước muối sinh lý 0,9%.
Cách pha: pha 4mg Compound 48/80 trong 10ml nước muối sinh lý, như vậy trong 0,2ml có chứa 0,08mg Compound 48/80.
Quy trình:
Chuột được uống thuốc thử. 1 giờ sau khi uống thuốc, toàn bộ chuột được gây mô hình shock phản vệ bằng tiêm màng bụng Compound 48/80 liều 8mg/kg với thể tích 0,2 ml/10g chuột.
Theo dõi số lượng chuột chết ở các lô trong 1 giờ, cứ 10 phút đếm số lượng chuột chết ở mỗi lô kể từ khi tiêm Compound 48/80 và ghi vào sổ ghi chép.
Bảng 3.6. Tác dụng của cao EZ trên mô hình gây shock phản vệ
STT Lô n Thuốc thử Liều
(g/kg) Số chuột chết Tỷ lệ chuột chết (%) Tỷ lệ ức chế shock phản vệ (%) 1 Mô hình 10 Compound 48/80 0,008 10 100 0 2 Chứng dương 10 Methylprednisolon 0,012 3 30 70
3 Thử EZ-H1 10 Cao EZ chiết nước 3,54 2 20 80
4 Thử EZ-H2 10 Cao EZ chiết nước 10,62 5 50 50
5 Thử EZ-E1 10 Cao EZ chiết ethanol 2,11 8 80 20
6 Thử EZ-E2 10 Cao EZ chiết ethanol 6,33 5 50 50
0 70 80 50 20 50 0 10 20 30 40 50 60 70 80 M Ứ C Đ Ộ Ứ C C H Ế S H O C K ( % ) thuốc thử mô hình chứng dương CN liều thấp CN liều cao CC liều thấp CC liều cao
Hình 3.7: Biểu đồ thể hiện tác dụng ức chế shock phản vệ
Nhận xét :
Ở lô mô hình: Compound 48/80 liều 8 mg/kg tiêm màng bụng sau 1 giờ gây tình trạng shock phản vệ và 100% chuột chết. Kết quả này chứng tỏ mô hình gây shock phản vệ bằng Compound 48/80 trên chuột nhắt trắng được thực hiện thành công.
Ở lô sử dụng methylprednisolon liều cao 12 mg/kg, chỉ có 30% chuột, cho thấy Methylprednisolon có tác dụng ngăn cản shock phản vệ và tỷ lệ ức chế shock phản vệ là 70%.
Cao EZ chiết nước cả hai liều đều làm giảm tỷ lệ tử vong của chuột so với lô mô hình, tuy nhiên liều 3,54 g cao/kg làm giảm tỷ lệ chết nhiều hơn
liều 10,62 g cao/kg. Tương ứng với tỷ lệ ức chế shock phản vệ lần lượt là 80% và 50%.
Cao EZ chiết cồn làm giảm tỷ lệ tử vong so với lô mô hình, tuy nhiên mức độ giảm ít hơn so với cao EZ chiết nước.
3.3.3. Khảo sát tác dụng chống dị ứng bằng phương pháp gây ngứa
- Động vật thí nghiệm: chuột nhắt trắng chủng Swiss, cả hai giống, khỏe mạnh, trọng lượng 25 ± 2 g.
- Tiến hành: 60 chuột nhắt trắng được chia làm 6 lô, mỗi lô 10 con: Nghiên cứu được tiến hành trong 5 ngày như sau:
Lô 1 (Chứng sinh học): Uống nước lọc hàng ngày 0,2 ml/10g chuột, tiêm dưới da nước muối sinh lý 0,1 ml/10g chuột tương ứng vị trí tiêm Compound 48/80 ở những lô khác.
Lô 2 (Lô mô hình): Uống nước lọc hàng ngày 0,2 ml/10g chuột, tiêm dưới da cổ Compound 48/80 liều 4 mg/kg với thể tích 0,1 ml/10g chuột để gây mô hình gây ngứa.
Lô 3 (Methylprednisolon): 4 ngày đầu chuột được uống methylprednisolon 6 mg/kg. Ngày thứ 5, sau khi uống methylprednisolon 1 giờ, chuột được gây mô hình bằng Compound 48/80 4 mg/kg tiêm dưới da cổ.
Lô 4 (Ketotifen): 4 ngày đầu chuột được uống ketotifen 1 mg/kg. Ngày thứ 5, sau khi uống ketotifen 1 giờ, chuột được gây mô hình bằng Compound 48/80 4 mg/kg tiêm dưới da cổ.
Lô 5 (Thử EZ-H1): 4 ngày đầu chuột được uống thuốc nghiên cứu EZ chiết nước với liều 3,54 g cao/kg/ngày. Vào ngày thứ 5, 1 giờ sau khi uống thuốc nghiên cứu liều lượng như trên, chuột được tiêm dưới da cổ Compound 48/80 liều 4 mg/kg.
Lô 6 (Thử EZ-H2): 4 ngày đầu chuột được uống thuốc nghiên cứu EZ chiết nước với liều 10,62 g cao/kg/ngày. Vào ngày thứ 5, 1 giờ sau khi uống
thuốc nghiên cứu liều lượng như trên, chuột được tiêm dưới da cổ Compound 48/80 liều 4 mg/kg.
Lô 7 (Thử EZ-E1): 4 ngày đầu chuột được uống thuốc nghiên cứu EZ chiết cồn với liều 2,11 g cao/kg/ngày. Vào ngày thứ 5, 1 giờ sau khi uống thuốc nghiên cứu liều lượng như trên, chuột được tiêm dưới da cổ Compound 48/80 liều 4 mg/kg.
Lô 8 (Thử EZ-E2): 4 ngày đầu chuột được uống thuốc nghiên cứu EZ chiết cồn với liều 6,33 g cao/kg/ngày. Vào ngày thứ 5, 1 giờ sau khi uống thuốc nghiên cứu liều lượng như trên, chuột được tiêm dưới da cổ Compound 48/80 liều 4 mg/kg.
Quy trình: chuột được cho uống thuốc trong 4 ngày liên tục. Đến ngày thứ 5, sau khi uống thuốc 1 giờ gây mô hình bằng cách tiêm dưới da cổ Compound 48/80 liều 4mg/kg với thể tích 0,1ml/10g chuột.
Tác nhân gây ngứa là dung dịch Compound 48/80 0,4% pha trong nước muối sinh lý 0,9%.
Theo dõi phản ứng gãi của từng chuột ở các lô tại các thời điểm 0-5 phút, 5-10 phút, 10-15 phút, 15-20 phút sau khi tiêm Compound 48/80, ghi vào sổ ghi chép.
Bảng 3.7. Tác dụng của cao EZ lên mô hình gây ngứa
STT Lô Thuốc thử Liều
Số phản xạ gãi trung bình (X± SD, số lần) 0-5 phút 5-10 phút 10-15 phút 15-20 phút Tổng số 1 Chứng sinh học NaCl 0,9% 0,1ml/10g 0 0 0 0 0 2 Mô hình C 48/80 4mg/kg 4,4 ± 2,6 9,6 ± 5,2 9,1 ± 4,9 9,7 ± 4,5 32,8 ±10,9 3 Chứng dương 1 Methyl 6mg/kg 3,1 ± 2,1 7,7 ± 5,0 6,1 ± 2,9 4.3 ± 3,4 21,2 ± 9,3 P3-2 > 0,05 > 0,05 > 0,05 < 0,05 < 0,05 4 Chứng dương 2 Ketotifen 1mg/kg 4,2 ± 3,5 7,4 ± 3,4 6,5 ± 1,8 5,8 ± 2,2 23,9 ± 4,8 P4-2 > 0,05 > 0,05 > 0,05 < 0,05 < 0,05 5 Thử EZ-H1 CN EZ 3,54g/kg 3,4 ± 2,6 4,8 ± 2,3 5,1 ± 3,7 3,8 ± 3,4 17,1 ±9,0 P5-2 > 0,05 < 0,05 > 0,05 < 0,01 < 0,01 P5-3 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 P5-4 > 0,05 > 0,05 > 0,05 < 0,05 > 0,05 6 Thử EZ-H2 CN EZ 10,62g/kg 4,0 ± 4,0 2,8 ± 2,3 5,2 ± 4,3 3,7 ± 3,1 15,7 ± 9,6 P6-2 > 0,05 < 0,05 >0,05 < 0,001 < 0,01 P6-3 > 0,05 < 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 P6-4 > 0,05 < 0,05 > 0,05 > 0,05 < 0,05 6 5 P >0,05 7 Thử EZ-E1 CC EZ 2,11g/kg 4,8 ± 2,5 6,4 ± 2,7 4,8 ± 3,8 3,6 ± 2,6 19,1 ± 9,1 P7-2 > 0,05 > 0,05 < 0,05 < 0,01 < 0,01 P7-3 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 P7-4 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 8 Thử EZ-E2 CC EZ 6,33g/kg 3,4 ± 2,7 4,3 ± 3,1 4,1 ± 3,8 4,3 ± 1,9 16,1 ± 8,6 P8-2 > 0,05 < 0,05 < 0,05 < 0,01 < 0,01 P8-3 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 P8-4 > 0,05 < 0,05 > 0,05 > 0,05 < 0,05 P8-7 >0,05
0 5 10 15 20 25 30 35 S Ố L Ầ N G Ã I mô hình methylprednisolon ketotifen CC liều thấp CN liều cao CC liều thấp CC liều cao
Hình 3.8: biểu đồ thể hiện tác dụng ức chế ngứa trong 20 phút. Nhận xét:
Ở lô chứng sinh học không sử dụng chất gây dị ứng Compound 48/80: Không có chuột nào có phản xạ gãi điển hình trong 20 phút.
Ở lô mô hình: Compound 48/80 liều 4 mg/kg tiêm dưới da cổ chuột cho thấy tác dụng gây dị ứng điển hình thông qua chỉ số phản xạ gãi trong từng thời điểm và tổng số sau 20 phút.
Lô 3,4: Thuốc chứng dương methylprednisolon liều 6 mg/kg và ketotifen 1 mg/kg cho thấy tác dụng chống dị ứng: số phản xạ gãi trung bình trong 20 phút giảm rõ rệt có ý nghĩa thống kê so với lô mô hình.
Ở lô 5: uống cao EZ chiết nước liều 3,54 g/kg. Số lần gãi trung bình trong cả 20 phút giảm rõ rệt có ý nghĩa thống kê so với lô 2 mô hình. Tác dụng giảm ngứa chủ yếu tại 2 thời điểm: 5-10 phút và 15-20 phút. Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa tổng số lần gãi trong 20 phút ở lô uống cao EZ chiết nước liều 3,54 g/kg so với lô uống methylprednisolon 6 mg/kg và lô uống ketotifen 1 mg/kg.
Ở lô 6: uống cao EZ chiết nước liều 10,62 g/kg. Số lần gãi trung bình trong cả 20 phút giảm rõ rệt có ý nghĩa thống kê so với lô 2 mô hình. Tác dụng giảm ngứa chủ yếu cũng tại 2 thời điểm: 5-10 phút và 15-20 phút. Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa tổng số lần gãi trong 20 phút ở lô uống EZ chiết nước liều 10,62 g/kg so với lô uống methylprednisolon 6 mg/kg. Tác dụng của EZ chiết nước liều 10,62 g/kg khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô uống ketotifen 1 mg/kg. Chưa có sự khác biệt giữa cao EZ chiết nước hai liều 3,54 g/kg và 10,62 g/kg.
Ở lô 7: uống cao EZ chiết cồn liều 2,11 g/kg. Số lần gãi trung bình trong cả 20 phút giảm rõ rệt có ý nghĩa thống kê so với lô 2 mô hình. Tác dụng giảm ngứa chủ yếu tại 2 thời điểm: 10-15 phút và 15-20 phút. Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa tổng số lần gãi trong 20 phút ở lô uống cao EZ chiết cồn liều 2,11 g/kg so với lô uống methylprednisolon 6 mg/kg và lô uống ketotifen 1 mg/kg.
Ở lô 8: uống cao EZ chiết cồn liều 6,33 g/kg. Số lần gãi trung bình trong cả 20 phút giảm rõ rệt có ý nghĩa thống kê so với lô 2 mô hình. Tác dụng giảm ngứa chủ yếu tại 3 thời điểm: 5-10 phút, 10-15 phút và 15-20 phút. Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa tổng số lần gãi trong 20 phút ở lô uống cao EZ chiết nước liều 6,33 g/kg so với lô uống methylprednisolon 6 mg/kg. Tác dụng của EZ chiết cồn liều 6,33 g/kg khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô uống ketotifen 1 mg/kg. Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa tổng số lần gãi trong 20 phút giữa 2 lô uống cao EZ chiết cồn liều 2,11 g/kg và 6,33 g/kg.
3.3.4. Nghiên cứu tác dụng chống dị ứng bằng mô hình gây viêm cấp tính trên chân chuột nhắt trắng
- Động vật thí nghiệm: chuột nhắt trắng chủng Swiss, cả hai giống, khỏe mạnh, trọng lượng 25 ± 2 g.
Tiến hành:
80 chuột nhắt trắng được chia làm 8 lô, mỗi lô 10 con: Mô hình được gây bằng cách tiêm Compound 48/80 dưới da vùng gan bàn chân chuột ở tất cả các chuột, sử dụng chân bên phải (P). Nghiên cứu được tiến hành trong 5 ngày như sau:
Lô 1 (Chứng sinh học): Uống nước lọc hàng ngày 0,2 ml/10g chuột, tiêm nước muối sinh lý thể tích 0,02 ml gan bàn chân phải chuột.
Lô 2 (Lô mô hình): Uống nước lọc hàng ngày 0,2 ml/10g chuột, tiêm dưới da gan bàn chân chuột dung dịch Compound 48/80 0,4% thể tích 0,02 mL để gây mô hình phù gan bàn chân bên phải.
Lô 3 (Methylprednisolon): 4 ngày đầu chuột được uống methylprednisolon 6 mg/kg. Ngày thứ 5, sau khi uống methylprednisolon 1 giờ, chuột được gây mô hình bằng dung dịch Compound 48/80 0,4% 0,02 ml tiêm dưới da gan bàn chân bên phải.
Lô 4 (Ketotifen): 4 ngày đầu chuột được uống ketotifen 1 mg/kg. Ngày thứ 5, sau khi uống ketotifen 1 giờ, chuột được gây mô hình bằng dung dịch Compound 48/80 0,4% 0,02 ml tiêm dưới da gan bàn chân bên phải.
Lô 5 (Thử EZ-H1): 4 ngày đầu chuột được uống thuốc nghiên cứu EZ chiết nước với liều 3,54 g cao/kg/ngày. Vào ngày thứ 5, 1 giờ sau khi uống thuốc nghiên cứu liều lượng như trên, chuột được gây mô hình bằng dung dịch Compound 48/80 0,4% 0,02 ml tiêm dưới da gan bàn chân bên phải.
Lô 6 (Thử EZ-H2): 4 ngày đầu chuột được uống thuốc nghiên cứu EZ chiết nước với liều 10,62 g cao/kg/ngày. Vào ngày thứ 5, 1 giờ sau khi uống thuốc nghiên cứu liều lượng như trên, chuột được gây mô hình bằng dung dịch Compound 48/80 0,4% 0,02 ml tiêm dưới da gan bàn chân bên phải.
Lô 7 (Thử EZ-E1): 4 ngày đầu chuột được uống thuốc nghiên cứu EZ chiết cồn với liều 2,11 g cao/kg/ngày. Vào ngày thứ 5, 1 giờ sau khi uống
thuốc nghiên cứu liều lượng như trên, chuột được gây mô hình bằng dung dịch Compound 48/80 0,4% 0,02 ml tiêm dưới da gan bàn chân bên phải.
Lô 8 (Thử EZ-E2): 4 ngày đầu chuột được uống thuốc nghiên cứu EZ chiết cồn với liều 6,33 g cao/kg/ngày. Vào ngày thứ 5, 1 giờ sau khi uống thuốc nghiên cứu liều lượng như trên, chuột được gây mô hình bằng dung dịch Compound 48/80 0,4% 0,02 ml tiêm dưới da gan bàn chân bên phải.
Quy trình: chuột được cho uống thuốc trong 4 ngày liên tục. Đến ngày thứ 5, sau khi cho uống thuốc 1 giờ, đo độ dày và thể tích bàn chân chuột. Sau đó tiêm dưới da gan bàn chân bên phải Compound 48/80 liều 0,8mg/kg với thể tích 0,02ml/10g chuột. Đo độ dày và thể tích bàn chân chuột ở thời điểm 30 phút và 1 giờ sau khi tiêm Compound 48/80 và ghi vào sổ ghi chép.
Tác nhân gây viêm cấp tính là dung dịch Compound 48/80 0,4% pha trong nước muối sinh lý 0,9%.
Bảng 3.8: Kết quả của cao EZ trên mô hình gây viêm cấp tính