3.3.1. Xác định hàm ẩm cao đặc
- Tiến hành: Xác định độ ẩm bằng phương pháp mất khối lượng do làm khô. Đĩa sấy khô ở 90oC trong 1 giờ, cho vào bình hút ẩm 30 phút, cân đĩa được mđ. Trừ bì, cân chính xác khoảng 1,000g cao vào đĩa, dàn mỏng cao
chiều dày không quá 5mm được mcao. Đem sấy đĩa cao ở 110oC trong 3 giờ, lấy ra cho vào bình hút ẩm 30 phút. Cân được mt. Tiến hành 3 lần, lấy giá trị trung bình [8].
P: độ ẩm của cao
Bảng 3.1. Kết quả xác định độ ẩm của cao cồn
Mẫu cao cồn Khối lượng cao (g) Độ ẩm (%)
1 1,0701 13,21
2 0,9173 13,34
3 1,0095 13,05
Trung bình 13,20
Bảng 3.2. Kết quả xác định độ ẩm của cao nước
Mẫu cao nước Khối lượng cao (g) Độ ẩm (%)
1 0,9235 10,49 2 1,0626 10,57 3 1,0321 10,75 Trung bình 10,60 3.2.2.2. Định lượng rutin bằng HPLC Tiến hành:
- Cho một lượng cao nước vào cối nghiền nhỏ bằng chày (thao tác nhanh tránh hút ẩm). Chia cao cồn thành từng mẫu nhỏ.
- Chuẩn bị mẫu chuẩn: cân chính xác 20mg rutin chuẩn cho vào bình định mức 100ml có nút mài, cho methanol khoảng 2/3 thể tích bình,
hòa tan bằng siêu âm trong 20 phút. Bổ sung methanol vừa đủ 100ml và lắc đều. Lấy chính xác 5ml thành 50ml bằng methanol và lắc đều. - Chuẩn bị mẫu thử: cân chính xác 0,1g cao, mỗi mẫu cao cân 3 mẫu vào
3 bình định mức 100ml có nút mài. Thấm ẩm các mẫu cao bằng một ít nước cất và lắc nhẹ cho các mẫu cao tan rã nhanh. Thêm methanol đến 2/3 thể tích bình, hòa tan bằng siêu âm trong 20 phút. Bổ sung methanol vừa đủ 100ml và lắc đều. Làm nguội các dịch dưới vòi nước, sau đó lọc các dịch qua giấy lọc thường (bỏ dịch lọc đầu). Pha loãng 7ml cao nước thành 10ml bằng methanol và lắc đều. Pha loãng 5ml cao cồn thành 50ml bằng methanol và lắc đều.
- Tất cả các mẫu chuẩn và thử đều được lọc qua màng lọc 0,45µm trước khi chạy sắc ký. Dung dịch lọc tiêm sắc ký.
- Chuẩn bị pha động: dung dịch acid acetic 1/25: nước cất 2 lần được lọc hút chân không. Lấy chính xác 500ml nước cất và 20ml acid acetic băng cho vào bình thủy tinh đựng pha động và lắc đều.
- Chương trình chạy sắc ký:
Máy Shimadzu LC solution 20A
Cột C18 Phenomenex Luna (250mm x 4,6mm; 5µm) Detector UV, λ = 360nm.
Thể tích tiêm mẫu 20µl Tốc độ dòng: 1ml/ phút.
Nhiệt độ thích hợp: nhiệt độ phòng Pha động: chế độ gradient dung môi
Bảng 3.3: Chế độ gradient dung môi định lượng rutin trong cao đặc EZ Thời gian (phút) A (methanol) B (acid acetic/ nước = 1/25)
0 0 100
0-4 0-50 100-50
4-14 50-80 50-20
14-16 80-0 20-100
16-18 0 100
- Kiểm tra tính thích hợp của hệ thống: tiến hành trên mẫu rutin chuẩn 6 lần với các điều kiện sắc ký như trên. Ghi kết quả: thời gian lưu, diện tích peak, hệ số bất đối xứng. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Tiến hành định lượng với các mẫu cao cồn và cao nước. Ghi kết quả: thời gian lưu, diện tích peak.
- Tính kết quả và lấy giá trị trung bình: Hàm lượng rutin được tính theo công thức sau:
(%) 100 (1 ) c t c t m s X h f s m p Trong đó:
X1, X là hàm lượng rutin trong mẫu cao EZ và cao EZ khô tuyệt đối
;
c t
m m lần lượt là khối lượng cân của rutin chuẩn và cao (g).
,
t c
S S lần lượt là diện tích peak của mẫu thử và mẫu chuẩn (mAU.min) h là hàm lượng rutin chuẩn (%)
f là tỷ lệ hệ số pha loãng giữa mẫu cao và rutin chuẩn p là hàm ẩm của chế phẩm cao (%)
Với chương trình chạy sắc ký như trên, sắc ký đồ thu được của rutin với peak cân đối, không bị doãng, thời gian lưu là 11,473 phút.
Hình 3.4: sắc ký đồ của rutin chuẩn
Bảng 3.4: Kết quả kiểm tra tính thích hợp hệ thống sắc ký lỏng
STT mẫu chuẩn Thời gian lưu (min) Diện tích peak (mAU.min) Hệ số bất đối xứng 1 11.485 837305 1.148 2 11.473 837318 1.129 3 11.467 837037 1.142 4 11.470 837536 1.160 5 11.468 837250 1.139 6 11.476 839549 1.151 Trung bình 11.473 837666 RSD (%) 0.059 0.112
Nhận xét: kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống HPLC cho thấy độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu và diện tích peak nhỏ hơn 2% và hệ số bất đối xứng AF nằm trong khoảng cho phép 0,9 ≤ AF ≤ 2. Điều này chứng tỏ hệ thống HPLC được sử dụng là thích hợp và đảm bảo sự ổn định cho phép phân tích định lượng rutin
Bảng 3.5: Kết quả định lượng rutin trong mẫu cao cồn và cao nước EZ
Tên mẫu m (g) p (%) h (%) f Spic X1 X X
Rutin 0,0256 87,12 1000 837666 CN 1 0,1506 10,60 1000/7 762650 1,93 1,88 2,15 2,09 CN 2 0,1522 10,60 1000/7 756386 1,89 2,11 CN 3 0,1527 10,60 1000/7 724959 1,81 2,02 CC 1 0,2114 13,2 1000 990282 12,47 12,61 14,37 14,53 CC 2 0,2253 13,2 1000 1074274 12,7 14,63 CC 3 0,2143 13,2 1000 1019158 12,66 14,59 Nhận xét:
Hàm lượng rutin trong cao sắc nước là 1,88% và tính theo cao khô tuyệt đối là 2,09%.
Hàm lượng rutin trong cao chiết ethanol 70% là 12,61% và tính theo cao khô tuyệt đối là 14,53%.
3.3. NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CHỐNG DỊ ỨNG CỦA CAO ĐẶC EZ 3.3.1. Chuẩn bị chế phẩm 3.3.1. Chuẩn bị chế phẩm
Nguyên tắc tính liều: Theo liều phương thuốc cổ truyền là 1 thang thuốc/người (50kg)/ngày.
Suy ra liều cao đặc bài thuốc cho 1 người (50kg)/ngày như sau: - Cao sắc nước: 14,75g cao/người (50kg)/ngày [27].
- Cao chiết ethanol: 8,80g cao/người (50kg)/ngày [27].
Ngoại suy: Hệ số ngoại suy liều có hiệu quả tương đương giữa người và động vật thí nghiệm - chuột nhắt trắng là 12 [9].
Suy ra liều tương đương ngoại suy trên chuột nhắt trắng là:
- Liều tương đương tác dụng của cao chiết ethanol: 2,11g cao/kg TT/ngày.
Từ đó làm cơ sở tính toán liều thử tác dụng sinh học: Thử ở các mức liều sau:
- Cao sắc nước: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Liều thấp: bằng liều tương đương: 3,54g cao/kg TT/ngày. Liều cao: gấp ba liều tương đương: 10,62g cao/kg TT/ngày. - Cao chiết ethanol:
Liều thấp: bằng liều tương đương: 2,11g cao/kg TT/ngày. Liều cao: gấp ba liều tương đương: 6,33g cao/kg TT/ngày. - Thuốc đối chiếu:
Liều methylprednisolon chống dị ứng trên chuột trong thực nghiệm là 12mg/kg, 6 mg/kg.
Liều ketotifen chống dị ứng trên chuột trong thực nghiệm là 1mg/kg
3.3.2. Khảo sát tác dụng chống dị ứng bằng phương pháp gây shock phản vệ vệ
- Động vật thí nghiệm: chuột nhắt trắng chủng Swiss, cả hai giống, khỏe mạnh, trọng lượng 25 ± 2 g.
- Tiến hành: 60 chuột nhắt trắng được chia ngẫu nhiên thành 6 lô, mỗi lô 10 con.
Lô 1 (Mô hình): Gây mô hình bằng Compound 48/80 liều 8mg/kg tiêm màng bụng.
Lô 2 (Methylprednisolon): Gây mô hình bằng Compound 48/80 liều 8mg/kg tiêm màng bụng. 1 giờ trước khi tiêm Compound 48/80, chuột được uống methylprednisolon liều 12 mg/kg.
Lô 3 (Thử EZ-H1): chuột được uống thuốc thử EZ chiết nước liều 3,54g/kg 1 giờ trước khi gây mô hình shock bằng Compound 48/80 liều 8mg/kg.
Lô 4 (Thử EZ-H2): chuột được uống thuốc thử EZ chiết nước liều 10,62g/kg 1 giờ trước khi gây mô hình shock bằng Compound 48/80 liều 8 mg/kg
Lô 5 (Thử EZ-E1): chuột được uống thuốc thử EZ chiết cồn liều 2,11g/kg 1 giờ trước khi gây mô hình shock bằng Compound 48/80 liều 8mg/kg.
Lô 6 (Thử EZ-E2): chuột được uống thuốc thử EZ chiết cồn liều 6,33g/kg 1 giờ trước khi gây mô hình shock bằng Compound 48/80 liều 8mg/kg.
Tác nhân gây sốc phản vệ là dung dịch Compound 48/80 0,4% (mg/ml) pha trong nước muối sinh lý 0,9%.
Cách pha: pha 4mg Compound 48/80 trong 10ml nước muối sinh lý, như vậy trong 0,2ml có chứa 0,08mg Compound 48/80.
Quy trình:
Chuột được uống thuốc thử. 1 giờ sau khi uống thuốc, toàn bộ chuột được gây mô hình shock phản vệ bằng tiêm màng bụng Compound 48/80 liều 8mg/kg với thể tích 0,2 ml/10g chuột.
Theo dõi số lượng chuột chết ở các lô trong 1 giờ, cứ 10 phút đếm số lượng chuột chết ở mỗi lô kể từ khi tiêm Compound 48/80 và ghi vào sổ ghi chép.
Bảng 3.6. Tác dụng của cao EZ trên mô hình gây shock phản vệ
STT Lô n Thuốc thử Liều
(g/kg) Số chuột chết Tỷ lệ chuột chết (%) Tỷ lệ ức chế shock phản vệ (%) 1 Mô hình 10 Compound 48/80 0,008 10 100 0 2 Chứng dương 10 Methylprednisolon 0,012 3 30 70
3 Thử EZ-H1 10 Cao EZ chiết nước 3,54 2 20 80
4 Thử EZ-H2 10 Cao EZ chiết nước 10,62 5 50 50
5 Thử EZ-E1 10 Cao EZ chiết ethanol 2,11 8 80 20
6 Thử EZ-E2 10 Cao EZ chiết ethanol 6,33 5 50 50
0 70 80 50 20 50 0 10 20 30 40 50 60 70 80 M Ứ C Đ Ộ Ứ C C H Ế S H O C K ( % ) thuốc thử mô hình chứng dương CN liều thấp CN liều cao CC liều thấp CC liều cao
Hình 3.7: Biểu đồ thể hiện tác dụng ức chế shock phản vệ
Nhận xét :
Ở lô mô hình: Compound 48/80 liều 8 mg/kg tiêm màng bụng sau 1 giờ gây tình trạng shock phản vệ và 100% chuột chết. Kết quả này chứng tỏ mô hình gây shock phản vệ bằng Compound 48/80 trên chuột nhắt trắng được thực hiện thành công.
Ở lô sử dụng methylprednisolon liều cao 12 mg/kg, chỉ có 30% chuột, cho thấy Methylprednisolon có tác dụng ngăn cản shock phản vệ và tỷ lệ ức chế shock phản vệ là 70%. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cao EZ chiết nước cả hai liều đều làm giảm tỷ lệ tử vong của chuột so với lô mô hình, tuy nhiên liều 3,54 g cao/kg làm giảm tỷ lệ chết nhiều hơn
liều 10,62 g cao/kg. Tương ứng với tỷ lệ ức chế shock phản vệ lần lượt là 80% và 50%.
Cao EZ chiết cồn làm giảm tỷ lệ tử vong so với lô mô hình, tuy nhiên mức độ giảm ít hơn so với cao EZ chiết nước.
3.3.3. Khảo sát tác dụng chống dị ứng bằng phương pháp gây ngứa
- Động vật thí nghiệm: chuột nhắt trắng chủng Swiss, cả hai giống, khỏe mạnh, trọng lượng 25 ± 2 g.
- Tiến hành: 60 chuột nhắt trắng được chia làm 6 lô, mỗi lô 10 con: Nghiên cứu được tiến hành trong 5 ngày như sau:
Lô 1 (Chứng sinh học): Uống nước lọc hàng ngày 0,2 ml/10g chuột, tiêm dưới da nước muối sinh lý 0,1 ml/10g chuột tương ứng vị trí tiêm Compound 48/80 ở những lô khác.
Lô 2 (Lô mô hình): Uống nước lọc hàng ngày 0,2 ml/10g chuột, tiêm dưới da cổ Compound 48/80 liều 4 mg/kg với thể tích 0,1 ml/10g chuột để gây mô hình gây ngứa.
Lô 3 (Methylprednisolon): 4 ngày đầu chuột được uống methylprednisolon 6 mg/kg. Ngày thứ 5, sau khi uống methylprednisolon 1 giờ, chuột được gây mô hình bằng Compound 48/80 4 mg/kg tiêm dưới da cổ.
Lô 4 (Ketotifen): 4 ngày đầu chuột được uống ketotifen 1 mg/kg. Ngày thứ 5, sau khi uống ketotifen 1 giờ, chuột được gây mô hình bằng Compound 48/80 4 mg/kg tiêm dưới da cổ.
Lô 5 (Thử EZ-H1): 4 ngày đầu chuột được uống thuốc nghiên cứu EZ chiết nước với liều 3,54 g cao/kg/ngày. Vào ngày thứ 5, 1 giờ sau khi uống thuốc nghiên cứu liều lượng như trên, chuột được tiêm dưới da cổ Compound 48/80 liều 4 mg/kg.
Lô 6 (Thử EZ-H2): 4 ngày đầu chuột được uống thuốc nghiên cứu EZ chiết nước với liều 10,62 g cao/kg/ngày. Vào ngày thứ 5, 1 giờ sau khi uống
thuốc nghiên cứu liều lượng như trên, chuột được tiêm dưới da cổ Compound 48/80 liều 4 mg/kg.
Lô 7 (Thử EZ-E1): 4 ngày đầu chuột được uống thuốc nghiên cứu EZ chiết cồn với liều 2,11 g cao/kg/ngày. Vào ngày thứ 5, 1 giờ sau khi uống thuốc nghiên cứu liều lượng như trên, chuột được tiêm dưới da cổ Compound 48/80 liều 4 mg/kg.
Lô 8 (Thử EZ-E2): 4 ngày đầu chuột được uống thuốc nghiên cứu EZ chiết cồn với liều 6,33 g cao/kg/ngày. Vào ngày thứ 5, 1 giờ sau khi uống thuốc nghiên cứu liều lượng như trên, chuột được tiêm dưới da cổ Compound 48/80 liều 4 mg/kg.
Quy trình: chuột được cho uống thuốc trong 4 ngày liên tục. Đến ngày thứ 5, sau khi uống thuốc 1 giờ gây mô hình bằng cách tiêm dưới da cổ Compound 48/80 liều 4mg/kg với thể tích 0,1ml/10g chuột.
Tác nhân gây ngứa là dung dịch Compound 48/80 0,4% pha trong nước muối sinh lý 0,9%.
Theo dõi phản ứng gãi của từng chuột ở các lô tại các thời điểm 0-5 phút, 5-10 phút, 10-15 phút, 15-20 phút sau khi tiêm Compound 48/80, ghi vào sổ ghi chép.
Bảng 3.7. Tác dụng của cao EZ lên mô hình gây ngứa
STT Lô Thuốc thử Liều
Số phản xạ gãi trung bình (X± SD, số lần) 0-5 phút 5-10 phút 10-15 phút 15-20 phút Tổng số 1 Chứng sinh học NaCl 0,9% 0,1ml/10g 0 0 0 0 0 2 Mô hình C 48/80 4mg/kg 4,4 ± 2,6 9,6 ± 5,2 9,1 ± 4,9 9,7 ± 4,5 32,8 ±10,9 3 Chứng dương 1 Methyl 6mg/kg 3,1 ± 2,1 7,7 ± 5,0 6,1 ± 2,9 4.3 ± 3,4 21,2 ± 9,3 P3-2 > 0,05 > 0,05 > 0,05 < 0,05 < 0,05 4 Chứng dương 2 Ketotifen 1mg/kg 4,2 ± 3,5 7,4 ± 3,4 6,5 ± 1,8 5,8 ± 2,2 23,9 ± 4,8 P4-2 > 0,05 > 0,05 > 0,05 < 0,05 < 0,05 5 Thử EZ-H1 CN EZ 3,54g/kg 3,4 ± 2,6 4,8 ± 2,3 5,1 ± 3,7 3,8 ± 3,4 17,1 ±9,0 P5-2 > 0,05 < 0,05 > 0,05 < 0,01 < 0,01 P5-3 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 P5-4 > 0,05 > 0,05 > 0,05 < 0,05 > 0,05 6 Thử EZ-H2 CN EZ 10,62g/kg 4,0 ± 4,0 2,8 ± 2,3 5,2 ± 4,3 3,7 ± 3,1 15,7 ± 9,6 P6-2 > 0,05 < 0,05 >0,05 < 0,001 < 0,01 P6-3 > 0,05 < 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 P6-4 > 0,05 < 0,05 > 0,05 > 0,05 < 0,05 6 5 P >0,05 7 Thử EZ-E1 CC EZ 2,11g/kg 4,8 ± 2,5 6,4 ± 2,7 4,8 ± 3,8 3,6 ± 2,6 19,1 ± 9,1 P7-2 > 0,05 > 0,05 < 0,05 < 0,01 < 0,01 P7-3 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 P7-4 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 8 Thử EZ-E2 CC EZ 6,33g/kg 3,4 ± 2,7 4,3 ± 3,1 4,1 ± 3,8 4,3 ± 1,9 16,1 ± 8,6 P8-2 > 0,05 < 0,05 < 0,05 < 0,01 < 0,01 P8-3 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 P8-4 > 0,05 < 0,05 > 0,05 > 0,05 < 0,05 P8-7 >0,05
0 5 10 15 20 25 30 35 S Ố L Ầ N G Ã I mô hình methylprednisolon ketotifen CC liều thấp CN liều cao CC liều thấp CC liều cao
Hình 3.8: biểu đồ thể hiện tác dụng ức chế ngứa trong 20 phút. Nhận xét:
Ở lô chứng sinh học không sử dụng chất gây dị ứng Compound 48/80: Không có chuột nào có phản xạ gãi điển hình trong 20 phút.
Ở lô mô hình: Compound 48/80 liều 4 mg/kg tiêm dưới da cổ chuột cho thấy tác dụng gây dị ứng điển hình thông qua chỉ số phản xạ gãi trong từng thời điểm và tổng số sau 20 phút.
Lô 3,4: Thuốc chứng dương methylprednisolon liều 6 mg/kg và ketotifen 1 mg/kg cho thấy tác dụng chống dị ứng: số phản xạ gãi trung bình trong 20 phút giảm rõ rệt có ý nghĩa thống kê so với lô mô hình.
Ở lô 5: uống cao EZ chiết nước liều 3,54 g/kg. Số lần gãi trung bình trong cả 20 phút giảm rõ rệt có ý nghĩa thống kê so với lô 2 mô hình. Tác dụng giảm ngứa chủ yếu tại 2 thời điểm: 5-10 phút và 15-20 phút. Không có