PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM

Cao đặc bài thuốc EZ được bào chế bằng hai phương pháp: sắc nước và chiết bằng ethanol 70%.

2.2.1.1. Sắc

Các dược liệu được rửa sạch, sấy khô ở 60ºC đạt tiêu chuẩn DĐVN IV, trộn đều các dược liệu và chiết xuất bằng phương pháp sắc với nước. Cô dịch chiết thu được dưới áp suất giảm đến thể chất quy định.

2.2.1.2. Chiết bằng ethanol

Các dược liệu được rửa sạch, sấy khô ở 60ºC đạt tiêu chuẩn DĐVN IV, chiết xuất riêng từng dược liệu bằng phương pháp chiết ethanol. Cô dịch chiết của từng dược liệu thu được đến cao lỏng 1: 1, sau đó trộn đều các cao lỏng rồi cô dưới áp suất giảm đến thể chất quy định.

2.2.2. Đính tính rutin trong cao đặc bằng phương pháp TLC

Đối chiếu dung dịch rutin chuẩn với dịch chiết bài thuốc bằng TLC: Triển khai trên một số hệ dung môi, chọn hệ có vết rõ, dễ nhận biết được rutin trong cao đặc bài thuốc để ghi lại kết quả.

2.2.3. Định lượng rutin trong cao đặc bằng HPLC

Xác định hàm ẩm trong cao chiết ethanol 70% và cao chiết nước theo phương pháp mất khối lượng do làm khô (DĐVN IV).

Tham khảo các phương pháp định lượng rutin bằng HPLC.

Dựa vào công thức cấu tạo và tính chất lý hóa của rutin cũng như điều kiện thực nghiệm ở nước ta hiện nay để xây dựng quy trình kỹ thuật định lượng rutin bằng phương pháp HPLC.

Bằng thực nghiệm nghiên cứu các điều kiện tiến hành để xây dựng phương pháp tiến hành:

- Khảo sát điều kiện sắc ký: chọn cột, pha động, bước sóng, thể tích tiêm mẫu, tốc độ dòng thích hợp để định lượng.

2.2.4. Khảo sát tác dụng chống dị ứng của cao đặc EZ

2.2.4.1. Nghiên cứu tác dụng chống dị ứng trên mô hình gây shock phản vệ trên chuột nhắt trắng

Chuột nhắt trắng chủng Swiss, thuần chủng, cả hai giống, khỏe mạnh, nặng 25  2 g.

Phương pháp: nghiên cứu theo phương pháp thực nghiệm trên mô hình gây shock phản vệ bằng Compound 48/80.

Tác nhân gây shock phản vệ là Compound 48/80. Compound 48/80 được tiêm vào màng bụng của chuột nhắt trắng sau 2 giờ uống thuốc. Quan sát tỷ lệ chuột chết ở các lô trong 1 giờ.

Chỉ tiêu quan sát: số chuột chết

Chỉ tiêu đánh giá: Tỷ lệ phần trăm chuột chết trong 1 giờ sau khi tiêm Compound 48/80.

X(%) =

^B 100

A^

Trong đó:

X(%): tỷ lệ chuột chết [33], [38], [41], [47]. B là số chuột chết của từng lô sau 1 giờ A là tổng số chuột nghiên cứu của từng lô

2.2.4.2. Nghiên cứu tác dụng chống dị ứng trên mô hình gây ngứa trên chuột nhắt trắng.

Chuột nhắt trắng chủng Swiss, thuần chủng, cả hai giống, khỏe mạnh, nặng 25  2 g.

Phương pháp: sử dụng Copound 48/80 liều 4mg/kg để gây tình trạng dị ứng biểu hiện bằng triệu chứng ngứa trên da chuột. Gây ngứa bằng cách tiêm dung dịch Compound 48/80 dưới da cổ. Theo dõi phản xạ gãi trên toàn bộ cơ

thể (tại các thời điểm 0-5, 5-10, 10-15, 15-20 phút). Các lô chuột được đánh giá bằng toàn bộ các nghiên cứu viên tham gia để tránh sai số.

Chỉ tiêu quan sát: số lần phản xạ gãi trên toàn bộ cơ thể chuột.

Chỉ tiêu đánh giá: Số lần gãi trung bình giữa các lô ở từng thời điểm và tổng số lần gãi trung bình trong 20 phút được so sánh giữa các lô để đánh giá tác dụng chống dị ứng.

2.2.4.3. Nghiên cứu tác dụng chống dị ứng bằng mô hình gây viêm cấp tính trên chân chuột

Chuột nhắt trắng chủng Swiss, thuần chủng, cả hai giống, khỏe mạnh, nặng 25  2 g.

Phương pháp: Sử dụng Compound 48/80 để gây tình trạng dị ứng trên da gan bàn chân chuột, đánh giá mức độ dị ứng thông qua chiều dày và sự gia tăng thể tích chân chuột. Gây mô hình bằng cách tiêm dưới da gan bàn chân dung dịch Compound 48/80 0,4%. Đo độ dày và thể tích bàn chân trước và sau khi tiêm ( 30 phút và 1 giờ). Tính kết quả trung bình và so sánh.

Chỉ tiêu quan sát:

- Chiều dày chân bên phải. - Thay đổi thể tích chân chuột.

Chỉ tiêu đánh giá: Độ gia tăng thể tích và chiều dày chân chuột ở 2 thời điểm 30, 60 phút so với ban đầu. So sánh giá trị trung bình về mức độ gia tăng thể tích và chiều dày giữa các lô để đánh giá tác dụng chống dị ứng.

Tính kết quả theo công thức của Fontaine + Độ gia tăng thể tích chân của từng chuột:

Trong đó: Vt: Thể tích chân chuột sau khi gây dị ứng. Vo: Thể tích chân chuột trước khi gây dị ứng.

+ Tác dụng chống dị ứng của thuốc được đánh giá bằng khả năng ức chế gia tăng thể tích chân chuột (I%):

^{% % %} % c t o V V I V      Trong đó: % c V

 : Trung bình độ tăng thể tích chân chuột ở lô đối chứng.

%

t

V

 : Trung bình độ tăng thể tích chân chuột ở lô uống thuốc.

%

o

V

 : Trung bình thể tích chân chuột trước khi gây viêm I%: Mức độ ức chế phù [23], [30], [35], [46].

+ Khả năng ức chế gia tăng chiều dày chân chuột

(%)

100

d d

X

d

 

 



X là mức độ ức chế gia tăng chiều dày [33], [41], [55].

,

c t

d d

 

hình của lô đối chứng và lô thuốc thử.

2.2.5. Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu được nhập bằng phần mềm Excel 2007 - Microsolf, xử lý bằng phương pháp thống kê y sinh học theo T test-Student. Số liệu được biểu diễn dưới dạng X SE.

Xác định giá trị trung bình, độ lệch chuẩn và khoảng tin cậy theo công thức:

Giá trị trung bình:

Sai số chuẩn:

Khoảng tin cậy:

Trong đó:

SD: Độ lệch chuẩn SE: Sai số chuẩn Cl: Khoảng tin cậy n: Số mẫu thí nghiệm k=n-1

tα: Hằng số student với α=0,05.

CHƯƠNG III. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1. BÀO CHẾ CAO ĐẶC TỪ BÀI THUỐC EZ 3.1.1. Sắc

Hình 3.1. Sơ đồ bào chế cao đặc EZ bằng phương pháp chiết nước - Chuẩn bị dược liệu

Cô áp suất giảm

Dược liệu được rửa sạch, được sấy khô ở 60ºC theo tiêu chuẩn DĐVN IV.

Chiết xuất 15 thang thuốc, cân khối lượng theo công thức sau:

Kim ngân đằng 300g Núc nác 225g

Hòe hoa 150g Đơn lá đỏ 75g

Thương nhĩ tử 105g Hoàng bá 45g

- Chiết xuất

Các dược liệu được cân theo công thức trên, trộn đều, thấm ẩm 30 phút bằng nước, sau đó cho vào ấm đun thuốc Hàn Quốc, thêm lượng nước gấp 6 lần dược liệu. Bật ấm đun, sắc nóng trong 1 giờ. Sắc thuốc 3 lần. Thêm nước để duy trì lượng nước không đổi trong quá trình sắc.

Rút dịch chiết, dịch chiết 1 để riêng, dịch chiết 2, 3 gộp chung. Lọc nóng các dịch chiết qua vải gạc để loại tạp cơ học. Để nguội, lắng và lọc dịch chiết lần 2 qua bông để loại tạp không tan [27].

- Cô cao

Cô cao bằng hệ thống cô cao dưới áp suất giảm. Dịch chiết 2, 3 cô trước đến cao lỏng 1:1 thì gộp dịch chiết 1 vào cô tiếp đến thể chất quy định trong DĐVN IV [27].

3.1.2. Chiết bằng ethanol

- Chuẩn bị dược liệu

Các dược liệu được rửa sạch, sấy ở 60ºC theo tiêu chuẩn DĐVN IV. Chia nhỏ dược liệu: các dược liệu được chia nhỏ đến kích thước thích hợp, xay thô.

Chiết xuất 15 thang thuốc, khối lượng các vị thuốc được cân theo khối lượng:

Kim ngân đằng 300g Núc nác 225g Hòe hoa 150g Đơn lá đỏ 75g

Thương nhĩ tử 105g Hoàng bá 45g

Dung môi chiết ethanol 70%: ethanol thực phẩm tuyệt đối thêm nước cất vừa đủ để được ethanol 70%.

Hình 3.2. Sơ đồ bào chế cao đặc EZ bằng phương pháp chiết ethanol - Chiết xuất

Các dược liệu được cân khối lượng theo công thức trên, các dược liệu được chiết riêng. Các dược liệu được cho vào các bình cầu có nút mài 500 ml hoặc 1000 ml tùy theo trọng lượng. Thêm dung môi ethanol 70% gấp 7 lần dược liệu. Lắp bình cầu vào sinh hàn. Chiết nóng theo phương pháp hồi lưu cách thủy trên bếp cách thủy 3 lần, mỗi lần 2 giờ,

Phối hợp các vị, cô áp suất giảm Cô áp suất giảm

Rút dịch chiết sau 2 giờ. Để nguội, lắng, lọc qua bông để loại tạp không tan. Dịch chiết 1 để riêng, dịch chiết 2 và 3 gộp chung.

Cất thu hồi dung môi bằng máy cất quay. Ly tâm dịch chiết để loại tạp nhựa lơ lửng [27].

- Cô cao

Quá trình cô cao diễn ra ở áp suất giảm sử dụng máy cất quay chân không. Dịch chiết của các vị được cô riêng. Dịch chiết 2, 3 cô trước, dịch chiết 1 cô sau. Cô dịch chiết 2, 3 rồi gộp dịch chiết 1 vào cô đến cao lỏng 1:1. Gộp cao lỏng của các vị và cô đến độ ẩm nhỏ hơn 20% [27].

3.2. ĐỊNH TÍNH RUTIN BẰNG TLC

Chuẩn bị dịch chấm sắc ký cao đặc: Lấy riêng 1g cao nước và 2g cao cồn cho vào bình nón có nắp đậy, thêm 10ml methanol đung sôi cách thủy 10 phút, lọc vào bình định mức 10ml, thêm methanol vừa đủ 10ml được dịch chấm sắc ký của các bài thuốc.

Chuẩn bị dung dịch rutin chuẩn: lấy 0,1g rutin chuẩn hòa tan trong 10ml methanol, lọc vào bình định mức 10ml và bổ sung methanol vừa đủ 10ml được dịch chấm sắc ký của rutin chuẩn đối chiếu.

Bản mỏng sillicagel GF254 hoạt hóa ở 110ºC trong 1 giờ. Hệ dung môi khai triển bao gồm [4], [8]:

- Hệ 1: Ethylacetat: acid acetic băng: acid formic: nước (100:11:11:25) - Hệ 2: Ethylacetat: methanol: nước (10:1,7:1,3)

- Hệ 3: n-butanol: acid acetic: nước (4:5:1) - Hệ 4: toluen : ethylacetat: acid formic (8:6:1)

Triển khai sắc ký: chấm 3 vết dung dịch rutin chuẩn, dung dịch cao cồn, cao nước trên cùng một bản mỏng, chạy cùng trên một hệ dung môi. Hiện vết dưới ánh sáng tử ngoại 254, 366 và hiện màu bằng hơi ammoniac đặc.

Kết quả TLC được ghi dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254nm và 366nm , thể hiện ở hình

Hình 3.3. sắc ký đồ rutin, cao cồn, cao nước EZ ở 366nm và 254nm. Nhận xét: trong dịch chiết cao cồn và cao nước có vết tương đương với vết rutin chuẩn bắt màu đen dưới bước sóng 254nm, giá trị Rf của 3 vết rutin lần lượt là: rutin chuẩn Rf = 0,280; cao cồn Rf= 0,279 và cao nước Rf = 0,275.

3.3. ĐỊNH LƯỢNG RUTIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC 3.3.1. Xác định hàm ẩm cao đặc 3.3.1. Xác định hàm ẩm cao đặc

- Tiến hành: Xác định độ ẩm bằng phương pháp mất khối lượng do làm khô. Đĩa sấy khô ở 90oC trong 1 giờ, cho vào bình hút ẩm 30 phút, cân đĩa được m_đ. Trừ bì, cân chính xác khoảng 1,000g cao vào đĩa, dàn mỏng cao

chiều dày không quá 5mm được mcao. Đem sấy đĩa cao ở 110oC trong 3 giờ, lấy ra cho vào bình hút ẩm 30 phút. Cân được mt. Tiến hành 3 lần, lấy giá trị trung bình [8].

P: độ ẩm của cao

Bảng 3.1. Kết quả xác định độ ẩm của cao cồn

Mẫu cao cồn Khối lượng cao (g) Độ ẩm (%)

1 1,0701 13,21

2 0,9173 13,34

3 1,0095 13,05

Trung bình 13,20

Bảng 3.2. Kết quả xác định độ ẩm của cao nước

Mẫu cao nước Khối lượng cao (g) Độ ẩm (%)

1 0,9235 10,49 2 1,0626 10,57 3 1,0321 10,75 Trung bình 10,60 3.2.2.2. Định lượng rutin bằng HPLC Tiến hành:

- Cho một lượng cao nước vào cối nghiền nhỏ bằng chày (thao tác nhanh tránh hút ẩm). Chia cao cồn thành từng mẫu nhỏ.

- Chuẩn bị mẫu chuẩn: cân chính xác 20mg rutin chuẩn cho vào bình định mức 100ml có nút mài, cho methanol khoảng 2/3 thể tích bình,

hòa tan bằng siêu âm trong 20 phút. Bổ sung methanol vừa đủ 100ml và lắc đều. Lấy chính xác 5ml thành 50ml bằng methanol và lắc đều. - Chuẩn bị mẫu thử: cân chính xác 0,1g cao, mỗi mẫu cao cân 3 mẫu vào

3 bình định mức 100ml có nút mài. Thấm ẩm các mẫu cao bằng một ít nước cất và lắc nhẹ cho các mẫu cao tan rã nhanh. Thêm methanol đến 2/3 thể tích bình, hòa tan bằng siêu âm trong 20 phút. Bổ sung methanol vừa đủ 100ml và lắc đều. Làm nguội các dịch dưới vòi nước, sau đó lọc các dịch qua giấy lọc thường (bỏ dịch lọc đầu). Pha loãng 7ml cao nước thành 10ml bằng methanol và lắc đều. Pha loãng 5ml cao cồn thành 50ml bằng methanol và lắc đều.

- Tất cả các mẫu chuẩn và thử đều được lọc qua màng lọc 0,45µm trước khi chạy sắc ký. Dung dịch lọc tiêm sắc ký.

- Chuẩn bị pha động: dung dịch acid acetic 1/25: nước cất 2 lần được lọc hút chân không. Lấy chính xác 500ml nước cất và 20ml acid acetic băng cho vào bình thủy tinh đựng pha động và lắc đều.

- Chương trình chạy sắc ký:

 Máy Shimadzu LC solution 20A

 Cột C18 Phenomenex Luna (250mm x 4,6mm; 5µm)  Detector UV, λ = 360nm.

 Thể tích tiêm mẫu 20µl  Tốc độ dòng: 1ml/ phút.

 Nhiệt độ thích hợp: nhiệt độ phòng  Pha động: chế độ gradient dung môi

Bảng 3.3: Chế độ gradient dung môi định lượng rutin trong cao đặc EZ Thời gian (phút) A (methanol) B (acid acetic/ nước = 1/25)

0 0 100

0-4 0-50 100-50

4-14 50-80 50-20

14-16 80-0 20-100

16-18 0 100

- Kiểm tra tính thích hợp của hệ thống: tiến hành trên mẫu rutin chuẩn 6 lần với các điều kiện sắc ký như trên. Ghi kết quả: thời gian lưu, diện tích peak, hệ số bất đối xứng.

- Tiến hành định lượng với các mẫu cao cồn và cao nước. Ghi kết quả: thời gian lưu, diện tích peak.

- Tính kết quả và lấy giá trị trung bình: Hàm lượng rutin được tính theo công thức sau:

(%) 100

(1 )

m s

X h f

s m p



   

  

X1, X là hàm lượng rutin trong mẫu cao EZ và cao EZ khô tuyệt đối

;

c t

m m _{lần lượt là khối lượng cân của rutin chuẩn và cao (g).}

,

t c

S S lần lượt là diện tích peak của mẫu thử và mẫu chuẩn (mAU.min) h là hàm lượng rutin chuẩn (%)

f là tỷ lệ hệ số pha loãng giữa mẫu cao và rutin chuẩn p là hàm ẩm của chế phẩm cao (%)

Với chương trình chạy sắc ký như trên, sắc ký đồ thu được của rutin với peak cân đối, không bị doãng, thời gian lưu là 11,473 phút.

Hình 3.4: sắc ký đồ của rutin chuẩn

Bảng 3.4: Kết quả kiểm tra tính thích hợp hệ thống sắc ký lỏng

STT mẫu chuẩn ^{Thời gian lưu} (min) Diện tích peak (mAU.min) ^{Hệ số bất đối xứng} 1 11.485 837305 1.148 2 11.473 837318 1.129 3 11.467 837037 1.142 4 11.470 837536 1.160 5 11.468 837250 1.139 6 11.476 839549 1.151 Trung bình 11.473 837666 RSD (%) 0.059 0.112

Nhận xét: kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống HPLC cho thấy độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu và diện tích peak nhỏ hơn 2% và hệ số bất đối xứng AF nằm trong khoảng cho phép 0,9 ≤ AF ≤ 2. Điều này chứng tỏ hệ thống HPLC được sử dụng là thích hợp và đảm bảo sự ổn định cho phép phân tích định lượng rutin

Bảng 3.5: Kết quả định lượng rutin trong mẫu cao cồn và cao nước EZ

Tên mẫu m (g) p (%) h (%) f Spic X1 X X

Rutin 0,0256 87,12 1000 837666 CN 1 0,1506 10,60 1000/7 762650 1,93 1,88 2,15 2,09 CN 2 0,1522 10,60 1000/7 756386 1,89 2,11 CN 3 0,1527 10,60 1000/7 724959 1,81 2,02 CC 1 0,2114 13,2 1000 990282 12,47 12,61 14,37 14,53 CC 2 0,2253 13,2 1000 1074274 12,7 14,63 CC 3 0,2143 13,2 1000 1019158 12,66 14,59 Nhận xét:

Hàm lượng rutin trong cao sắc nước là 1,88% và tính theo cao khô tuyệt đối là 2,09%.

Hàm lượng rutin trong cao chiết ethanol 70% là 12,61% và tính theo cao khô tuyệt đối là 14,53%.

3.3. NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CHỐNG DỊ ỨNG CỦA CAO ĐẶC EZ 3.3.1. Chuẩn bị chế phẩm 3.3.1. Chuẩn bị chế phẩm

Nguyên tắc tính liều: Theo liều phương thuốc cổ truyền là 1 thang