Nghiên cứu bài thuốc chữa huyết khối tĩnh mạch chi về thực vật, hóa học và thăm dò tác dụng in vitro

Nghiên cứu ảnh hưởng in vitro của bài thuốc trên quá trình đông máu và trên sự ngưng tập tiểu cầu ..... Bảng 3: Kết quả định tính các nhóm chất trong 3 dược liệu của bài thuốc bằng phản

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp, tôi đã nhận được rất nhiều sự hướng dẫn và giúp đỡ của thầy cô, gia đình và bạn bè

Tôi xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc của mình đến TS Nguyễn

Thu Hằng và TS Nguyễn Hoàng Tuấn hai thầy cô đã tận tình hướng dẫn và

động viên tôi giúp tôi hoàn thành tốt khóa luận

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Dược liệu đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực hiện khóa luận này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến các thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy bảo, dìu dắt tôi trong suốt những năm học vừa qua

Lời cảm ơn cuối cùng tôi xin gửi đến gia đình, bạn bè những người luôn quan tâm, động viên và là chỗ dựa tinh thần vững chắc cho tôi hoàn thành khóa luận này

Hà Nội, ngày 15 tháng 5 năm 2013

Sinh viên

Phạm Thị Nhung

Chương 1 TỔNG QUAN Error! Bookmark not defined

1.1 Bài thuốc chữa huyết khối tĩnh mạch chiError! Bookmark not defined

1.2 Cây cau Error! Bookmark not defined

1.3 Cây dừa Error! Bookmark not defined

1.4 Cây chuối Error! Bookmark not defined

1.5 Giới thiệu chung về quá trình đông máu và bệnh huyết khối tĩnh

mạch chi Error! Bookmark not defined

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUError! Bookmark no

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị Error! Bookmark not defined

2.1.1 Nguyên liệu Error! Bookmark not defined

2.1.2 Hóa chất, dụng cụ Error! Bookmark not defined

2.1.3 Thiết bị nghiên cứu Error! Bookmark not defined

2.2 Nội dung nghiên cứu Error! Bookmark not defined

2.2.1 Nghiên cứu về thực vật Error! Bookmark not defined

2.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học Error! Bookmark not defined

2.2.3.Thăm dò ảnh hưởng in vitro của bài thuốc trên quá trình đông

máu………19

2.2.4 Thăm dò ảnh hưởng in vitro của bài thuốc trên sự ngưng tập tiểu

cầu Error! Bookmark not defined

2.3 Phương pháp nghiên cứu Error! Bookmark not defined

2.3.1 Xác định tên khoa học Error! Bookmark not defined

2.3.2 Nghiên cứu đặc điểm vi học Error! Bookmark not defined

2.3.3 Nghiên cứu về hóa học 20

2.3.4 Đánh giá ảnh hưởng in vitro của bài thuốc trên quá trình đông

máu Error! Bookmark not defined

2.3.5 Đánh giá ảnh hưởng in vitro của bài thuốc trên sự ngưng tập tiểu

cầu 20

Chương 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬNError! Bookmark not defi 3.1 Xác định tên khoa học và nghiên cứu đặc điểm vi học của mẫu nghiên cứu Error! Bookmark not defined 3.1.1 Cau Error! Bookmark not defined 3.1.2 Dừa 27

3.1.3 Chuối 32

3.2 Nghiên cứu thành phần hóa học 38

3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng in vitro của bài thuốc trên quá trình đông máu và trên sự ngưng tập tiểu cầu 45

3.4 Bàn luận 51

Chương 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 54

4.1 Kết luận 54

4.2 Đề xuất 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

APTT Thời gian Cephlin – kaolin

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1: Một số loài thuộc chi Musa ở Việt Nam

Bảng 2: Các yếu tố đông máu

Bảng 3: Kết quả định tính các nhóm chất trong 3 dược liệu của bài

thuốc bằng phản ứng hóa học Bảng 4: Kết quả định tính các nhóm chất của bài thuốc bằng phản ứng

hóa học Bảng 5: Thành phần các mẫu trong quy trình thử nghiệm đánh giá ảnh

hưởng của bài thuốc trên quá trình đông máu Bảng 6: Kết quả đánh giá ảnh hưởng in vitro của bài thuốc trên các

thời gian PT, APTT, TT Bảng 7: Thành phần các mẫu trong quy trình thử nghiệm đánh giá ảnh

hưởng của bài thuốc trên sự ngưng tập tiểu cầu Bảng 8: Kết quả đánh giá ảnh hưởng in vitro của bài thuốc trên sự

ngưng tập tiểu cầu

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1 Sơ đồ quá trình đông máu với 2 con đường nội sinh và ngoại

sinh Hình 1.1 Ảnh chụp cây cau tại thực địa

Hình 1.2 Ảnh chụp các đặc điểm cây cau

Hình 1.3 Ảnh chụp dược liệu rễ cau

Hình 1.4 Ảnh chụp vi phẫu rễ cau dưới kính hiển vi

Hình 1.5 Ảnh chụp đặc điểm bột rễ cau dưới kính hiển vi

Hình 2.1 Ảnh chụp cây dừa

Hình 2.2 Ảnh chụp dược liệu rễ dừa

Hình 2.3 Ảnh chụp vi phẫu rễ dừa duới kính hiển vi

Hình 2.4 Ảnh chụp đặc điểm bột rễ dừa dưới kính hiển vi

Hình 3.1 Ảnh chụp cây chuối tiêu tại thực địa Hình 3.2 Ảnh chụp các đặc điểm của cây chuối tiêu

Hình 3.3 Ảnh chụp dược liệu rễ chuối tiêu

Hình 3.4 Ảnh chụp vi phẫu rễ chuối tiêu dưới kính hiển vi

Hình 3.5 Ảnh chụp đặc điểm bột rễ chuối tiêu dưới kính hiển vi

ĐẶT VẤN ĐỀ

Huyết khối tĩnh mạch là tắc nghẽn một hay nhiều đoạn tĩnh mạch nông hoặc sâu do cục máu đông cấu tạo bởi fibrin và huyết cầu Huyết khối tĩnh mạch có thể gặp ở nhiều nơi nhưng hay gặp nhất là ở chi dưới [6]

Huyết khối ở chi dưới có thể theo máu đến phổi gây tắc động mạch phổi

- gọi là thuyên tắc phổi, là một bệnh lý nặng nề, có thể dẫn đến tử vong đột ngột 80% huyết khối tĩnh mạch sâu không có triệu chứng cho đến khi xảy ra biến chứng nghiêm trọng là thuyên tắc phổi Nếu bệnh nhân không gặp biến chứng thuyên tắc phổi thì có đến 20-50% sau này bị hội chứng hậu huyết khối

với biểu hiện loét, đau nhức và giới hạn vận động chi dưới [15]

Theo các thông tin được đưa ra trong '' Hướng dẫn chẩn đoán, điều trị và

dự phòng Thuyên tắc - huyết khối tĩnh mạch '' của Hội tim mạch Việt Nam

năm 2011, ở Mỹ mỗi năm có khoảng 600.000 ca mới mắc thuyên tắc huyết khối tĩnh mạch và dự đoán có khoảng 180.000 trường hợp tử vong do biến chứng thuyên tắc phổi của bệnh huyết khối tĩnh mạch sâu [19], [35] Nghiên cứu INCIMEDI là nghiên cứu tầm soát huyết khối tĩnh mạch sâu chi dưới không triệu chứng tại Việt Nam trên bệnh nhân nội khoa nhập viện bằng siêu

âm Doppler do GS Đặng Vạn Phước, GS Phạm Gia Khải và GS Nguyễn Lân Việt cùng cộng sự thực hiện tại các bệnh viện lớn ở phía Nam và Bắc cho thấy có 22% bệnh nhân được phát hiện có huyết khối tĩnh mạch sâu bằng siêu

âm Doppler , mặc dù không có triệu chứng gì Kết quả này đã chứng minh

rằng tỷ lệ huyết khối tĩnh mạch sâu không hiếm gặp ở nước ta [15]

Thuốc thường được chỉ định để điều trị bệnh huyết khối tĩnh mạch chi là heparin và các thuốc chống đông đường uống, nhưng nhược điểm của các thuốc này là có thể gây tai biến chảy máu [4] Một xu hướng khác điều trị huyết khối tĩnh mạch chi là sử dụng các thuốc từ dược liệu Trong số các bài

thuốc dân gian chữa bệnh huyết khối tĩnh mạch chi thì bài thuốc gồm rễ cau,

rễ dừa, rễ chuối đã được nhân dân ở Hưng Yên sử dụng cho hiệu quả tương đối tốt Ở nước ta, cây cau, cây dừa, cây chuối được trồng phổ biến ở nhiều nơi, được sử dụng rộng rãi trong đời sống và trong y học Với mong muốn kế thừa và tiếp tục phát huy bài thuốc dân gian ở Hưng Yên, chúng tôi tiến hành

đề tài “ Nghiên cứu bài thuốc chữa huyết khối tĩnh mạch chi về thực vật, hóa

học và thăm dò tác dụng in vitro.” với các mục tiêu sau:

1- Nghiên cứu đặc điểm thực vật và đặc điểm vi học của 3 dược liệu

trong bài thuốc

2- Định tính thành phần hóa học của 3 dược liệu và của bài thuốc

3- Thăm dò một số tác dụng in vitro của bài thuốc

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Bài thuốc chữa huyết khối tĩnh mạch chi

Bài thuốc được nhân dân ở huyện Khoái Châu, tỉnh Hưng Yên sử dụng gồm 3 vị dược liệu rễ cau nổi, rễ dừa nổi, rễ chuối tiêu Các loại rễ này khi còn tươi đều rất giòn, dễ dàng bẻ được bằng tay Dược liệu thu về được rửa sạch, để ráo, cắt thành từng đoạn 2 cm, lấy 9 đoạn mỗi loại, đem giã nát, cho vào hãm trong một phích nước nóng hoặc có thể cho vào ấm đun sôi, uống thay nước trong ngày Người bệnh uống liên tục trong 1 tuần, sau đó nghỉ 1 tuần tiếp theo, rồi uống tiếp 1 tuần thì dừng thuốc

1.2 Cây cau

1.2.1 Về thực vật

-Tên khoa học: Areca catechu L., họ Cau (Arecaceae) [16], [41]

-Tên khác: tân lang, binh lang, may làng (Tày), pơ lang (K’ Ho) [16]

-Tên nước ngoài: Areca-nut palm, betel – nut palm, areca palm, catechu palm (Anh), aréquier, noxi d’arec (Pháp) [16]

1.2.1.1 Đặc điểm thực vật loài Areca catechu L

Thân đơn độc, mọc đứng, cao đến 20 m, đường kính 10- 20 cm, màu xám, có nhiều vòng đốt thấy rõ Lá có bẹ hơi phồng lên, ôm lấy thân, dài tới 1m; cuống lá dài không quá 5 cm; gân chính dài đến 2 m; mỗi bên gân chính mang 20-30 lá chét xếp đều đặn dạng lông chim, dựng thẳng đứng; trung bình

lá chét dài 30- 60 cm, phần giữa lá rộng 3-7 cm Cụm hoa là một bông mo, phân nhánh; có nhiều nhánh hoa nhỏ, ngoằn ngoèo, màu vàng lục; hoa đực đơn độc, xếp xen kẽ thành 2 hàng trên một nhánh hoa, nhỏ, rất thơm gồm 3 lá

đài, ba cánh màu trắng, 6 nhị [16]; hoa cái to hơn, mọc ở gốc của nhánh hoa,

to hơn đực, bao hoa không phân hóa, bầu trên 3 ô [16] Quả màu vàng, vàng cam, hoặc màu đỏ, hình trứng, kích thước 8 x 6 cm [16], [41]

1.2.1.2 Phân bố

Trên thế giới: Cau có nguồn gốc từ Malaysia [41], hiện nay được trồng nhiều nhất ở các nước nhiệt đới ở châu Á, Đông Phi và đảo Thái Bình Dương [37] Tại Việt Nam: Cau là cây trồng lâu đời và quen thuộc ở Việt Nam Cây được trồng ở khắp nơi nhất là vùng trung du và đồng bằng Các tỉnh phía nam trồng nhiều cau hơn các tỉnh phía bắc [16]

Tác giả Lê Thanh Phước và Bành Nguyễn Anh Hào đã phân lập được 2 triterpen là lupeol, lupeol acetat và đường α,α-D-trehalose từ các phân đoạn dịch chiết Ether dầu hỏa và Ethyl acetat của rễ cau trồng tại huyện Phong Điền, thành phố Cần Thơ [13], [14]

1.2.3 Tác dụng sinh học

Nghiên cứu về tác dụng chống oxi hóa của dịch chiết methanol rễ cau, sử dụng chất chuẩn đối chiếu là trolox có IC50=10,14385 µg Kết quả cho thấy dịch chiết methanol rễ cau có tác dụng chống oxi hóa với IC50=21.1417 µg,

khả năng chống oxi hóa tương ứng với chất chuẩn trolox là 0,5998, nếu coi khả năng chống oxi hóa của trolox là 1, độ tin cậy của kết quả thử nghiệm là p< 0,01 [38]

1.2.4 Công dụng

Quả cau chia thành từng miếng nhỏ được, nhai cùng với lá trầu không như một chất kích thích Theo tài liệu [19] có tới 5% dân số thế giới có thói quen nhai trầu cau Việc sử dụng trầu cau trong các nghi lễ truyền thống là nét

văn hóa của nhiều quốc gia châu Á và Thái Bình Dương [37]

Vỏ quả (đại phúc bì) có vị cay, tính hơi ôn, quy 5 kinh tỳ, phế, vị, tiểu tràng, đại tràng, có tác dụng khoan trung, hành thủy, tiêu thũng Đại phúc bì dùng chữa thấp trệ, khí trệ, phù toàn thân, bụng đầy trướng, đại tiện không thông, tiểu tiện khó khăn Liều 6-9 g sắc uống cùng các vị thuốc khác [16]

Hạt cau (binh lang) có vị đắng, chát, tính ôn, quy kinh tỳ, vị, đại tràng,

có tác dụng diệt trùng, tiêu tích, hành khí, lợi thủy Hạt cau thường dùng làm thuốc trị bệnh giun sán cho gia súc, gia cầm như dùng liều 4-10 g để diệt sán

ở chó Đối với người, hạt cau phối hợp với hạt bí ngô làm thuốc diệt gián [16], [12] Làm thuốc giúp sự tiêu hóa, chữa viêm ruột, lỵ, liều 0,5-4 g hạt cau khô [12]

Rễ cau nổi có tác dụng bổ dương, phối hợp với các dược liệu khác để chữa thận hư, liệt dương, đái dắt, hen suyễn, chữa phù thũng [40]

1.3 Cây dừa

1.3.1 Về thực vật

-Tên khoa học: Cocos nucifera L., họ Cau (Arecaceae) [41]

-Tên đồng nghĩa: Cocos indica Royle; C nana Griffith

-Tên nước ngoài: coconut palm, coconut tree, cocopalm (Anh), cocotier

(Pháp) [16]

1.3.1.1 Đặc điểm thực vật loài Cocos nucifera L

Cây thân trụ, thẳng đứng, cao đến 20 m, đường kính 30 cm hoặc hơn Thân nhẵn, không phân nhánh, có nhiều vết sẹo do bẹ lá rụng Lá to dạng lông chim, mọc tập trung ở ngọn thân, bẹ dày, có đến 100 lá chét ở mỗi bên gân chính, lá chét hẹp dài, nhẵn bóng, xếp thành 2 dãy đều đặn, xòe rộng trên cùng một mặt phẳng Cụm hoa bông mo, mọc ở kẽ lá, hoa đơn tính, hoa đực ở trên, có 6 mảnh xếp thành hai vòng, 6 nhị; hoa cái ở dưới có bao hoa giống hoa đực, 3 lá noãn dính nhau Quả màu xanh lục đến nâu đỏ, hình trừng, đôi khi có hình cầu, kích thước 30 20 cm, vỏ quả ngoài nhẵn, màu lục bóng, vỏ quả giữa có nhiều sợi (gọi là xơ) và vỏ quả trong cứng rắn (sọ dừa) có 3 lỗ ở phía gốc, trong chứa nước; hạt có nội nhũ đặc dần lại thành cùi màu trắng (cùi dừa) [16], [41]

1.3.1.2 Phân bố

Trên thế giới: Dừa có nguồn gốc ở đảo Andaman (Vịnh Bengal Ấn Độ) [16], được trồng phổ biến khắp các vùng nhiệt đới, vùng trồng nhiều dừa nhất của thế giới là một số nước Nam Á, Đông Nam Á: Srilanca, Malaysia, Philippin, Ấn Độ và một số đảo ở Nam Thái Bình Dương [12] ,[16], [21] Tại Việt Nam: Dừa là cây trồng quen thuộc nhất là từ Thanh Hóa trở vào Các tỉnh Bình Định, Phú Yên, Khánh Hòa, Bến Tre, Đồng Tháp, Kiên Giang, Long An …là những tỉnh có diện tích trồng dừa lớn [12], [16]

Thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của dịch chiết dichloromethan methanol 700 (1:1) rễ dừa ở các nồng độ 10, 30, 50, 100 µg/ml Kết quả cho

-thấy rễ dừa có tác dụng ức chế các vi khuẩn Escherichia coli, Staphylococcus

aureus, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa và nấm Candida

albicans, Candida tropicalis, Aspergillus niger Trong đó, tác dụng trên vi khuẩn gram dương mạnh hơn trên gram âm, tác dụng kháng nấm, kháng khuẩn của dịch chiết rễ dừa yếu hơn chất chuẩn Cephalexin nồng độ 30 µg/đĩa thạch và Fluconazol nồng độ 10 µg/đĩa thạch [33]

1.3.3.2 Tác dụng trên hệ thần kinh trung ương

Dịch chiết ethanol của rễ dừa có tác dụng kéo dài đáng kể thời gian ngủ gây ra bởi các thuốc phentobarbital natri, diazepam, và meprobamat trên chuột một cách phụ thuộc vào liều Dịch chiết ethanol của rễ dừa làm giảm tác dụng gây đau của dung dịch axit axetic 1,2% ở chuột Đồng thời làm tăng tác dụng giảm đau của morphin và pethidin trên chuột Tiền xử lý với dịch chiết ethanol của rễ dừa chống được tác dụng gây co giật bởi pentylenetetrazol Các nghiên cứu hành vi trên chuột cho thấy tác dụng an dịu hệ thần kinh trung

ương của dịch chiết ethanol rễ dừa C nucifera L [33]

Cùi dừa vị ngọt, tính bình, có tác dụng ích khí bổ dưỡng, nhuận tràng và lợi tiểu, dùng chữa đau vùng thượng vị hoặc ép lấy dầu dừa chữa bỏng, mụn nhọt [16] Cùi dừa còn dùng làm thức ăn, là nguyên liệu ép lấy dầu dừa [21], [41]

Rễ dừa chữa chứng chảy máu, kinh nguyệt không đều [16]

1.4 Cây chuối

1.4.1 Về thực vật

Chuối là các loài thuộc chi Musa, họ Chuối (Musaceae)

1.4.1 1 Đặc điểm thực vật của chi Musa

Cây thảo, sống lâu năm, mọc thành bụi, có thân rễ, có chồi Thân còn lại ngắn cho đến khi ra hoa Thân giả do các bẹ lá úp chặt lên nhau tạo thành, ở gốc hơi phồng lên Lá lớn, cuống lá dài, ở phía gốc cuống lá phình ra tạo thành bẹ, phiến lá hình chữ nhật Cụm hoa là bông ở ngọn của thân khí sinh, mọc thẳng, buông thõng xuống hoặc nằm ngang Lá bắc màu xanh, nâu, tím đậm, hiếm khi màu vàng, phẳng hoặc có nếp nhăn, cuộn lại hay xếp lợp lên nhau khi hoa chưa nở, thường rụng sớm Hoa xếp thành 1 hoặc 2 hàng dưới mỗi lá bắc, rụng sớm; những hoa ở gần lá bắc là hoa cái (nhị hoa tiêu giảm) hoặc hoa lưỡng tính, những hoa ở xa lá bắc là hoa đực (nhụy hoa tiêu giảm) Đài 3, dính với 2 cánh hoa [16] thành hình ống, đỉnh có 5 răng, cánh hoa thứ

3 rời, nằm phía trong và đứng đối diện với các cánh khác Nhị 5, chỉ nhị ngắn, bao phấn dài, 2 ngăn Quả dài, nạc, nhiều hạt (trừ một số dạng không có hạt)

Hạt hình cầu, đôi khi có hình hạt đậu [41]

Trên thế giới chi Musa có khoảng 30 loài, phân bố chủ yếu ở khu vực

Đông Nam Á, ở Trung Quốc có 11 loài.Theo các tài liệu [10], [16], ở nước ta

có 10 loài thuộc chi Musa

Một số loài thuộc chi Musa ở Việt Nam được tóm tắt ở bảng 1 dưới đây:

Bảng 1 Một số loài thuộc chi Musa ở Việt Nam

STT Tên khoa học Tên đồng nghĩa Tên thường

[10],[11],[16], [41]

[1],[10],[11],[16], [41]

chuối lùn [1],[10],[11]

Colla

Chuối rừng, chuối hoang nhọn

đỏ [10],[11]

8 M chilliocarpa

Back

Chuối trăm nải [1],[11]

Hook f

Chuối kiểng

đỏ [11],[41]

1.4.2.2 Đặc điểm thực vật và phân bố của loài Musa paradisiaca L

Tên đồng nghĩa: Musa paradisiaca subsp sapientum (Linnaeus)

Kuntze; M sapientum Linnaeus

Thân giả, mọc thành bụi, có phủ phấn trắng, cao 3-7 m Lá mọc thẳng

đứng hay xiên; cuống lá phủ phấn trắng, dài hơn 30 cm Mặt trên phiến lá

màu xanh đậm, mặt dưới màu xanh sáng hơn và có phấn trắng rõ, hình chữ

nhật, 1,5-3 m × 40-60 cm, gốc phiến lá hình tim đến hình trứng, đối xứng

Cụm hoa rủ xuống, cuống hoa nhẵn không có lông Lá bắc màu đỏ tía hay tím

đậm, hình trứng đến hình trứng mũi mác, dài 15-30 cm hoặc hơn, rụng sớm

Có 2 hàng hoa dưới mỗi lá bắc, cánh hoa đực màu vàng đến vàng nhạt Các

cánh hoa dính liền thành một bản, dài 4-6,5 cm; cánh rời hình tim đến hình

chữ nhật, trong mờ, đỉnh hình tim hoặc hình tròn Buồng quả có 7-8 nải quả

mọng Quả thẳng hoặc hơi cong, hình chữ nhật, dài 10 -20 cm, góc cạnh, thịt

quả ngọt, hoặc ngọt và chua, không phải là rất thơm; cuống dài Hạt không có

hoặc ít 2n = 33 [41]

Phân bố: Thường được trồng lấy quả, phổ biến ở nhiều nước trên thế

giới, nhiều nhất ở vùng Nam Mỹ, Caribe, Đông Nam Á và Nam Phi [16],[41]

1.4.2 Về hóa học

Dịch chiết ethanol của rễ chuối M paradisiaca L có chứa glycosid,

steroid, flavonoid, saponin, đường khử và tanin [20]

1.4.3 Tác dụng sinh học

1.4.3.1.Tác dụng kháng nấm, kháng khuẩn

Nghiên cứu thử nghiệm tác dụng kháng khuẩn của dịch chiết ethanol của

rễ chuối M paradisica L cho thấy phổ ức chế rộng, tác dụng cả vi khuẩn

gram dương B megaterium, B subtilis, S aureus và gram âm E coli, P

aeruginosa, S dysenteriae, S typhi,Vibrio cholerae và S flexneri Ở nồng độ

500 µg/đĩa thạch vùng ức chế có kích thước từ 10.53 ± 0.37 đến 12.42 ± 0.85

mm, trong khi chất đối chứng là Gentamycin ở nồng độ 30 µg/đĩa thạch có

kích thước vùng ức chế từ 23.55 ± 0.76 mm đến 27.10 ± 0.60 mm [20]

1.4.3.2 Tác dụng hạ đường huyết

Dịch chiết nước - methanol (40: 60) rễ chuối M paradisiaca L ở chuối

liều 80 mg/100g (trọng lượng cơ thể / ngày) được chứng minh là có tác dụng

hạ đường huyết trên chuột bị gây tăng đường huyết bởi streptozotocin Lô

chuột mắc bệnh sau khi được uống dịch chiết rễ chuối thấy giảm đáng kể

nồng độ đường trong máu, giảm các enzyme chuyển hóa carbohydrat và

lượng glycogen gan và cơ xương, nồng độ insulin huyết thanh cũng được

phục hồi so với lô chứng là chuột mắc bệnh không được uống dịch chiết dược

liệu (p < 0.05) [27], [28]

1.4.3.3 Tác dụng lợi tiểu

Đánh giá về tác dụng gây lợi tiểu của dịch chiết methanol rễ chuối

M paradisiaca L trên chuột được uống dịch chiết dược liệu ở 2 mức liều 500

và 250 (mg /kg trọng lượng cơ thể) Kết quả cho thấy dịch chiết rễ chuối có

tác dụng làm tăng tổng khối lượng nước tiểu và tăng sự bài tiết các chất điện

giải, đặc biệt ở liều 500 (mg/kg trọng lượng cơ thể) Thử nghiệm cũng chỉ ra

tác dụng lợi tiểu gây ra bởi dịch chiết methanol gần tương tự như tác dụng lợi

tiểu của Furosemid (p < 0,01) [24]

1.4.3.4 Ảnh hưởng đến các thông số chức năng tinh hoàn của chuột đực

Các tác giả Yakubu MT, Oyeyipo TO, Quadri AL và Akanji MA đã tiến

hành đánh giá về tác dụng của dịch chiết nước rễ chuối M paradisiaca L đến

các thông số chức năng tinh hoàn của tinh hoàn chuột đực Nghiên cứu đã cho

thấy dịch chiết nước rễ chuối ở liều 25, 50, và 100 (mg / kg trọng lượng cơ

thể) làm tăng cường các hoạt động phụ thuộc vào testosteron của tinh hoàn, kích thích sự hoạt động bình thường của tinh hoàn và tác động

trên cả hai thuộc tính androgenic và đồng hóa ở động vật thí nghiệm so với

chứng (p < 0,05) [39]

1.4.3.5 Tác dụng chống rối loạn chuyển hóa NH3trên chuột

Nghiên cứu về tác dụng chống rối loạn chuyển hóa NH3 của dịch chiết

ethanol rễ chuối M paradisiaca L cho thấy: Ở liều 300(mg/ kg trọng lượng

cơ thể), dịch chiết ethanol của rễ chuối M paradisiaca L có khả năng chống

lại tác dụng của NH4Cl lên nồng độ NH3 máu, ure huyết tương, hoạt tính của các enzym gan, nhưng không ảnh hưởng lên các thông số này ở cơ thể động vật bình thường (p< 0,05) [23]

1.5.1 Quá trình đông máu

Đông máu là một quá trình trong đó một số máu từ thể lỏng biến thành thể đặc (cục đông) do sự chuyển fibrinogen, một protein hòa tan của huyết tương thành các sợi fibrin, không hòa tan dưới tác dụng của thrombin Các sợi fibrin kết lại với nhau thành mạng lưới giam giữ các tế bào máu và huyết tương tạo ra cục máu đông

Đông máu là một chuỗi các phản ứng hóa học của các yếu tố đông máu

có trong huyết tương, các mô tổn thương và tiểu cầu

Đông máu phát triển trong vòng 15-20 giây nếu là tổn thương nặng và trong 1-2 phút nếu là tổn thương nhẹ [8]

1.5.1.1 Các yếu tố đông máu

Hầu hết các yếu tố đông máu có trong huyết tương dưới dạng tiền chất không hoạt động Một khi được hoạt hóa nó sẽ đóng vai trò enzym xúc tác

cho sự hoạt hóa của yếu tố đông máu khác làm cho các phản ứng của đông máu xảy ra theo kiểu dây chuyền cho đến khi mạng lưới fibrin được tạo thành

Bảng 2 Các yếu tố đông máu

Danh pháp

Yếu tố III Thromboplastin của mô Mô

Yếu tố V Proaccelerin

Yếu tố VII Proconvertin

Yếu tố VIII Yếu tố chống hemophilia A Huyết tương

Yếu tố IX Yếu tố Christmas

Yếu tố chống hemophilia B Huyết tương

Yếu tố X Yếu tố Stuart

Yếu tố Stuart-Prower Huyết tương

Yếu tố XI Tiền thromboplastin huyết tương

Yếu tố chống hemophilia C Huyết tương

Yếu tố XII Yếu tố Hageman

Yếu tố XIII Yếu tố ổn định fibrin Huyết tương

Yếu tố tiểu cầu Yếu tố III của tiểu cầu Tiểu cầu

1.5.1.2 Cơ chế đông máu

Cơ chế quá trình đông máu được tóm tắt ở sơ đồ hình 1

Hình 1 Sơ đồ quá trình đông máu với 2 con đường nội sinh và ngoại sinh

Quá trình đông máu trải qua 3 giai đoạn [8]:

- Giai đoạn tạo prothrombinase: Trong giai đoạn này phức hợp prothrombinase được tạo thành theo 2 con đường nội sinh và ngọai sinh Con đường ngoại sinh được khởi động khi máu tiếp xúc với mô bị tổn thương làm giải phóng yếu tố III của mô Trong khi sự tiếp xúc của yếu tố XII và tiểu cầu với các sợi collagen của thành mạch khởi phát con đường nội sinh

- Giai đoạn chuyển protrombin thành thrombin: Dưới tác động của phức hợp prothrombinase, prothrombin chuyển thành thrombin

- Giai đoạn chuyển fibrinogen thành fibrin: Thrombin chuyển fibrinogen thành sợi fibrin đơn phân, sau đó các fibrin đơn phân tự trùng hợp tạo thành mạng fibrin không hòa tan, giam giữ các tế bào máu tạo cục máu đông bịt kín tổn thương

1.5.1.3 Một số thông số đánh giá quá trình đông máu

Để phát hiện những bất thường trong quá trình đông máu trong lâm sàng thường làm xét nghiệm đánh giá một số thông số sau:

- Thời gian prothrombin (Thời gian Quick, PT) (giây): Đây là xét nghiệm nhằm đánh giá các yếu tố đông máu của con đường ngoại sinh (các yếu tố II,

V, VII, X) Thời gian Quick kéo dài trong các trường hợp rối loạn con đường đông máu ngoại sinh (suy giảm chức năng gan, thiếu viatamin K, điều trị chống đông bằng dẫn xuất coumarin…) [7]

- Thời gian thromboplastin từng phần hoạt hóa (thời gian Cephalin Kaolin, APTT) (giây): Xét nghiệm này cho phép đánh giá chính xác các yếu

-tố của con đường đông máu nội sinh Thời gian Cephalin - Kaolin kéo dài thường gặp trong trường hợp rối loạn con đường đông máu nội sinh do thiếu hụt yếu tố đông máu (hemophilia…) hoặc do có chất chống đông lưu hành (bệnh leukemia cấp, điều trị heparin…) [7]

- Thời gian thrombin (TT) (giây): Xét nghiệm này đánh giá giai đoạn chuyển fibrinogen thành fibrin Thời gian thrombin kéo dài trong trường hợp thiếu hụt fibrinogen, bất thường về cấu trúc phân tử fibrinogen, có mặt các chất ức chế thrombin (heparin) hoặc chất ức chế trùng phân fibrin [7]

1.5.2 Bệnh huyết khối tĩnh mạch chi

1.5.2.1 Cơ chế bệnh sinh

Có 3 yếu tố gây nên huyết khối tĩnh mạch:

- Tổn thương nội mô :

Đây là yếu tố quyết định Bình thường các tế bào nội mô chứa nhiều chất tiêu tơ huyết và được che phủ bởi một chất có đặc tính không thấm ướt và điện tích bề mặt ngăn cản không cho các tế bào tự do dính vào Khi nội mô bị tổn thương các tiểu cầu đến dính vào nơi tổn thương đã bị thấm ướt và phân tán điện tích bề mặt, từ đó hình thành nên cục huyết khối [3]

Có nhiều nguyên nhân gây tổn thương: Chấn thương, phẫu thuật, bức xạ ion, thiếu oxy, độc tố vi khuẩn, xơ vữa động mạch, histamin trong viêm,… [3]

- Tăng tính đông máu :

Bình thường có sự cân bằng giữa yếu tố tạo đông máu và yếu tố chống đông Tình trạnh tăng đông có thể do hoạt động quá mức của các yếu tố tạo đông máu, hoặc thiếu hụt các yếu tố chống đông, hoặc các yếu tố tiền đông máu không bị tiêu hủy bởi các tế bào đơn nhân thực bào như thường lệ [3] Các yếu tố khác nhau gây tăng đông máu gồm: Độ quánh máu tăng sau chảy máu nặng hoặc sau mất nước, đa tiểu cầu gặp trong chấn thương, mất nước, sau mổ tắc mạch phổi Các bệnh miễn dịch, nhiễm khuẩn nặng thường kèm theo tăng fibrin, tăng khả năng kết dính các tế bào máu Các chất có khả năng gây khuyết khối như thuốc tránh thai, catecholamin quá liều….[3]

- Rối loạn huyết động :

Bình thường máu chảy rất nhanh, khi máu đọng, huyết lưu chậm, dễ gây huyết khối do các tế bào máu gần nhau nên dễ kết dính, tiểu cầu và bạch cầu sát vào thành mạch, tình trạng thiếu oxy làm tổn thương tế bào nội mô dính tế bào vào vách mạch và giải phóng các chất tạo huyết khối [3]

Nguyên nhân gây ứ máu: Chèn ép tĩnh mạch, suy thành tĩnh mạch, suy tim bất động quá lâu, cản trở dòng máu về tim, v.v….[3]

1.5.2.2 Điều trị bệnh huyết khối tĩnh mạch chi

Mục tiêu điều trị là cải thiện các triệu chứng viêm như sưng, nóng, đỏ, đau, tránh sự lan rộng của huyết khối, tránh nhiễm khuẩn, tránh tái phát [4] Các nhóm thuốc thường dùng trong điều trị huyết khối tĩnh mạch chi :

- Các thuốc chống đông để làm loãng máu khiến máu khó đông, ngăn ngừa hình thành huyết khối và tăng trưởng của huyết khối đã có Heparin và các thuốc chống đông đường uống (thuốc kháng vitamin K (wafarin,…) ) được sử dụng nhiều nhất Khi dùng các thuốc này cần xét nghiệm chức năng đông máu thường xuyên tránh quá liều gây tai biến chảy máu

- Có thể dụng thuốc tan cục máu đông như streptokinase, urokinase,…

- Kháng sinh mạnh phổ rộng khi có nhiễm khuẩn

- Thuốc giảm đau, chống viêm (NSAIDs) [4], [6]

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị

Hóa chất dùng cho nghiên cứu đạt chuẩn phân tích:

Các dung môi: ethanol, chloroform, ethyl acetat, ete dầu hỏa, nước cất,… Các thuốc thử định tính thường dùng

Hóa chất vô cơ: NaOH, HCl, H2SO4,…

Bình định mức, ống nghiệm, bình nón, cốc có mỏ, ống đong, pipet các loại

2.1.3 Thiết bị nghiên cứu

- Cân phân tích Mettler Toledo AB204-S9 (Thụy Sĩ)

- Máy đo độ ẩm Precisa HA60 tại bộ môn Dược liệu ĐH Dược Hà Nội

- Tủ sấy Memmert (Đức)

- Kính hiển vi Leica (Đức)

- Máy ảnh CANON

- Máy li tâm Universal 320 (Đức)

- Máy CA 1500 tại khoa huyết học bệnh viện Bạch Mai

- Máy đo độ ngưng tập tiểu cầu Chronolog (Mỹ) tại khoa huyết học bệnh viện Bạch Mai

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Nghiên cứu về thực vật

Nghiên cứu đặc điểm vi phẫu và đặc điểm bột của rễ cau, rễ dừa, rễ

chuối trong bài thuốc chữa huyết khối tĩnh mạch chi

2.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học

Định tính 3 dược liệu và bài thuốc bằng phản ứng hóa học

2.2.3 Thăm dò ảnh hưởng in vitro của bài thuốc trên quá trình đông máu 2.2.4 Thăm dò ảnh hưởng in vitro của bài thuốc trên sự ngưng tập tiểu cầu

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Xác định tên khoa học

- Mô tả đặc điểm hình thái của mẫu nghiên cứu, đối chiếu với các đặc

điểm được mô tả trong các tài liệu [12], [16], [41] để xác định tên khoa học

2.3.2 Nghiên cứu đặc điểm vi học

- Mô tả đặc điểm vi học của 3 dược liệu trong bài thuốc gồm: Vi phẫu rễ

cau, vi phẫu rễ dừa, vi phẫu rễ chuối, bột rễ cau, bột rễ dừa và bột rễ chuối

- Chụp ảnh vi phẫu và đặc điểm bột của các dược liệu bằng máy ảnh

Canon, xử lý ảnh bằng phần mềm Microsoft office picture manager

2.3.3 Nghiên cứu về hóa học

- Định tính 3 dược liệu trong bài thuốc bằng phản ứng hóa học theo

phương pháp ghi trong các tài liệu [2]

- Chiết xuất bài thuốc với dung môi là nước cất, một phần dịch chiết nước đem tiến hành các phản ứng định saponin, tanin, đường khử Phần dịch chiết nước còn lại đem lắc với Ethyl acetat, bốc hơi dung môi đến cắn, hòa tan cắn vào cồn 900 , tiến hành các phản ứng định tính flavonoid Tiến hành theo phương pháp ghi trong tài liệu [2]

2.3.4 Đánh giá ảnh hưởng in vitro của bài thuốc trên quá trình đông máu

- Chuẩn bị dịch chiết đem thử: Dịch chiết nước bài thuốc

- Đánh giá ảnh hưởng in vitro của bài thuốc trên quá trình đông máu

theo phương pháp ghi trong tài liệu [22], [29], [30] dựa trên một số chỉ tiêu đông máu: thời gian Prothrombin (thời gian Quick) (PT), thời gian Cephalin-kaolin (APTT), thời gian thrombin (TT)

Lấy máu của một người tình nguyện khỏe mạnh vào buổi sáng cho vào ống nghiệm có vạch định mức 2ml đã có sẵn chất chống đông Natri citrat 3,8% với tỉ lệ 9 thể tích máu : 1 thể tích chống đông trộn đều, ly tâm thu huyết tương

Mẫu thử : Huyết tương trộn với dịch chiết dược liệu với tỉ lệ 1 thể tích huyết tương : 1 thể tích dịch chiết dược liệu

Mẫu chứng : Huyết tương trộn với nước cất với tỉ lệ 1 thể tích huyết tương : 1 thể tích nước cất

- Đo thời gian PT, APTT, TT trên máy CA1500 tại khoa Huyết học bệnh viện Bạch Mai

- Xử lý kết quả: Các kết quả nghiên cứu được xử lý bằng thuật toán thống kê sinh học Test T- student, có sự trợ giúp của phần mềm Microsoft Excel 2003 Với độ tin cậy 95%, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p<0,05,

và không có ý nghĩa thống kê với p > 0,05 [5]

2.3.5 Đánh giá ảnh hưởng in vitro của bài thuốc trên sự ngưng tập tiểu cầu

- Chuẩn bị dịch chiết đem thử : Dịch chiết nước bài thuốc được cô thành cắn khô, đem hòa tan cắn vào dung dịch NaCl 0,9 % để thử tác dụng

- Đánh giá ảnh hưởng in vitro của bài thuốc trên sự ngưng tập tiểu cầu

theo phương pháp ghi trong tài liệu [31], [32], [34], [36]

Cho dịch chiết nước bài thuốc vào huyết tương giàu tiểu cầu, ủ ở 370

C

trong 10 phút, thêm chất kích thích ngưng tập tiểu cầu Adenosin diphosphat (ADP) Theo dõi sự ngưng tập tiểu cầu theo phương pháp của Born (1963) [17] bằng máy đo độ ngưng tập tiểu cầu tại khoa Huyết học bệnh viện Bạch Mai Mẫu chứng tiến hành tương tự mẫu thử nhưng thay dịch chiết bài thuốc bằng dung dịch NaCl 0,9% Đánh giá tác dụng ức chế ngưng tập tiểu cầu của mẫu thử bằng cách so sánh độ ngưng tập tiểu cầu giữa mẫu thử và mẫu chứng

(% Độ ngưng tập của chứng - % Độ ngưng tập của thử)

% Độ ngưng tập của mẫu chứng

- Xử lý kết quả: Các kết quả nghiên cứu được xử lý bằng thuật toán thống kê sinh học Test T- student, có sự trợ giúp của phần mềm Microsoft Excel 2003 Với độ tin cậy 95%, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p<0,05,

và không có ý nghĩa thống kê với p > 0,05 [5]

Chương 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Xác định tên khoa học của mẫu nghiên cứu

3.1.1 Cau

3.1.1.1 Đặc điểm hình thái

Quan sát tại thực địa, cây cau có đặc điểm hình thái như sau:

Cây có thân mọc đứng, cao 10-20 m, đường kính 10- 20 cm, màu xám,

có nhiều vòng đốt là vết tích của những tàu lá rụng, gốc thân mang nhiều rễ nổi trên mặt đất Lá có bẹ to ôm lấy thân, dài đến 1 m; cuống lá to; gân chính dài đến 2 m; mỗi bên gân chính mang 20-30 lá chét xếp đều đặn dạng lông chim, dựng thẳng đứng; trung bình lá chét dài 30 - 60 cm, phần giữa lá rộng 3-7 cm, màu lục bóng Cụm hoa là một bông mo phân nhánh, bao bọc bởi một

mo rụng sớm; có nhiều nhánh hoa nhỏ, ngoằn ngoèo; hoa đực đơn độc, xếp xen kẽ thành 2 hàng trên một nhánh hoa, nhỏ, rất thơm gồm 3 lá đài màu xanh, 3 cánh màu trắng, 6 nhị rời, xếp thành 2 vòng; hoa cái to hơn, mọc ở gốc của nhánh hoa, lớn hơn đực, bao hoa không phân hóa, màu xanh, bầu trên

3 ô Quả hạch, hình trứng, kích thước 8 x 6 cm, nhẵn bóng, khi chín có màu vàng cam Hạt màu nâu nhạt

Mùa ra hoa: Tháng 5

Mùa ra quả: Tháng 10

Ảnh chụp các đặc điểm cây cau được trình bày ở hình 1.1 và hình 1.2 3.1.1.2 Xác định tên khoa học

Căn cứ vào đặc điểm hình thái của mẫu nghiên cứu tại thực địa, đối

chiếu với các đặc điểm của loài Areca catechu L được mô tả theo các tài liệu

[12], [16], [41], chúng tôi đã xác định tên khoa học của loài cau trồng ở huyện

Khoái Châu, tỉnh Hưng Yên là Areca catechu L., họ Cau (Arecaceae)

3.1.1.3 Đặc điểm dược liệu rễ cau

Dược liệu có màu vàng nhạt đến nâu đỏ, hình trụ, có nhiều rễ nhỏ, dai,

có xơ, không mùi, vị chát nhẹ

Ảnh chụp dược liệu rễ cau được trình bày ở hình 1.3

là một lớp tế bào xếp đều đặn, vách dày, hóa bần tạo thành khung hình chữ U gọi là đai Caspari (6) Nằm phía trong, sát nội bì là 2-3 lớp tế bào trụ bì, một số

tế bào trụ bì có thành mỏng, bắt màu hồng, một số bắt màu xanh do thành tế bào hóa gỗ (7) Libe bắt màu hồng (8) nằm xen kẽ với gỗ bắt màu xanh (9), mạch gỗ lớn (10) Trong cùng là mô mềm ruột gồm các tế bào thành mỏng, xếp xít nhau thành một khối tròn ở tâm, bắt màu hồng (11)

Ảnh chụp vi phẫu rễ cau dưới kính hiển vi được trình bày ở hình 1.4 3.1.1.5 Bột rễ cau

Bột rễ cau màu vàng nhạt, không mùi, vị chát nhẹ, soi dưới kính hiển vi thấy các đặc điểm sau: Mảnh bần gồm các tế bào hình chữ nhật xếp đều đặn (1) Nhiều mảnh mang màu đỏ nâu (2) Mô mềm là các tế bào thành mỏng, tròn ở góc (3) Các tế bào sợi dài nằm riêng rẽ (5) hay tạo thành bó sợi (4)

Tinh thể hình khối, nhiều góc cạnh (6) Đám tế bào cứng có nhiều ống trao

đổi nhỏ (7) Rải rác có các mạch vạch (8), mạch điểm (9)

Ảnh chụp các đặc điểm của bột rễ cau dưới kính hiển vi được trình bày ở hình 1.5

Hình 1.1 Ảnh chụp cây cau tại thực địa

Hình 1.2: Ảnh chụp các đặc điểm cây cau

Hình1.3 Ảnh chụp dược liệu rễ cau

Hình 1.4: Ảnh chụp vi phẫu rễ cau dưới kính hiển vi

Ghi chú: 1 Bần; 2 Ngoại bì; 3 Tế bào mô cứng; 4 Mô mềm vỏ; 5 Đám tễ bào

mô cứng; 6 Nội bì; 7 Trụ bì; 8 Libe; 9.Gỗ; 10 Mạch gỗ; 11 Mô mềm ruột