3.2.1. Định tính 3 dược liệu trong bài thuốc
Tiến hành chiết xuất dịch chiết cồn để định tính Flavonoid và
Coumarin như sau: Cho 10g dược liệu vào bình nón (200ml), thêm 100ml cồn 900, đun cách thủy 10 phút, lọc nóng. Dùng dịch chiết làm các phản ứng : 3.2.1.1. Định tính Flavonoid
Phản ứng Cyanidin: Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm một ít bột Magiê kim loại và 5 giọt HCl đặc, lắc đều rồi đun nóng cách thủy. Phản ứng (+) nếu xuất hiện màu đỏ.
Phản ứng với NH3: Nhỏ 1-2 giọt dịch chiết lên một mảnh giấy lọc, sấy nhẹ đến khô. Quan sát dưới ánh sáng thường thấy có màu vàng nhạt. Hơ mảnh giấy lên miệng lọ amoniac thấy màu vàng của dịch chiết đậm lên.
Phản ứng với NaOH: Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết, thêm vài giọt NaOH 10% thấy xuất hiện tủa vàng, thêm 1ml nước cất thấy tủa tan và màu vàng của dung dịch tăng lên.
Phản ứng với FeCl3 5%:Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết, thêm 2- 3 giọt FeCl35% thấy xuất hiện màu xanh đen.
3.2.1.2. Định tính Coumarin
Phản ứng mở đóng vòng lacton: Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 1ml dịch chiết.
Ống 1: Thêm 0,5ml NaOH 10%. Ống 2: Để yên.
Đun cả 2 ống nghiệm đến sôi, để nguội. Quan sát thấy: Ống 1: Tủa màu vàng.
Ống 2: Trong.
Thêm vào cả 2 ống nghiệm, mỗi ống 2ml nước cất, lắc đều thấy: Ống 1: Trong.
Ống 2: Có tủa đục.
Thêm vài giọt HCl đặc, ống 1 trở lại đục như ống 2.
Quan sát hiện tượng huỳnh quang: Nhỏ 2-3 giọt dịch chiết cồn lên một khoanh giấy lọc, nhỏ tiếp 2-3 giọt dung dịch NaOH 5%. Sấy nhẹ. Che một phần diện tích dịch chiết trên giấy lọc bằng một miếng kim loại, rồi chiếu tia tử ngoại trong một vài phút. Bỏ miếng kim loại ra, quan sát tiếp dưới đèn tử ngoại sẽ thấy: Phần không bị che có huỳnh quang sáng hơn phần bị che. Nếu tiếp tục chiếu tia tử ngoại, phần bị che sẽ sáng dần lên, sau vài phút cả hai phần đều phát quang như nhau.
3.2.1.3. Định tính Glycosid tim
Cho 10g bột dược liệu vào bình nón, thêm 80ml cồn 250, lắc đều, để qua đêm. Gạn lấy dịch chiết vào cốc có mỏ. Thêm vào dịch chiết 3ml chì acetat 30%, khuấy đều. Lọc qua giấy gấp nếp vào một cốc có mỏ. Nhỏ vài giọt dịch lọc đầu tiên vào một ống nghiệm, thêm một giọt chì acetat. Nếu xuất hiện tủa thì ngừng lọc, thêm khoảng 1ml chì acetat 30% vào dịch chiết, khuấy đều, lọc lại và tiếp tục thử cho đến khi dịch lọc không còn tủa với chì acetat. Chuyển toàn bộ dịch lọc vào bình gạn. Lắc kĩ 2 lần với Chloroform : Ethanol (4:1), mỗi lần với 8ml. Gạn dịch chiết chloroform vào cốc có mỏ, loại nước bằng natri sulfat khan. Chia đều dịch chiết vào 3 ống nghiệm nhỏ đã được sấy khô và bốc hơi trên nồi cách thủy đến khô. Cắn thu được đem tiến hành các phản ứng sau:
Phản ứng Liebermann- Burchardt: Cho vào ống nghiệm chứa cắn 1ml anhydrid acetic, lắc đều cho tan hết cắn. Nghiêng ống 450. Nhỏ từ từ theo thành ống 0,5ml H2SO4 đặc, tránh xáo trộn, dịch lỏng trong ống nghiệm chia thành 2 lớp. Ở giữa 2 lớp chất lỏng thấy xuất hiện vòng tím đỏ.
Phản ứng Legal: Cho vào ống nghiệm có chứa cắn glycosid tim 0,5ml ethanol 900. Lắc đều cho tan hết cắn. Nhỏ 1 giọt thuốc thử Natri nitroprussiat 0,5% và 2 giọt dung dịch NaOH 10%. Lắc đều sẽ xuất hiện màu
đỏ cam. Phản ứng Baliet: Cho vào ống nghiệm có chứa cắn glycosid tim
0,5ml ethanol 900. Lắc đều cho tan hết cắn. Nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet mới pha (1 phần dung dịch acid picric 1% và 9 phần dung dịch NaOH 10%) cho đến khi xuất hiện màu đỏ da cam.
Phản ứng Keller – Kiliani: Cho vào ống nghiệm chứa cắn glycosid tim 0,5ml ethanol 90%. Lắc đều cho tan hết cắn. Thêm vài giọt dung dịch sắt (III) clorid 5% pha trong acid acetic. Lắc đều. Nghiêng ống 450. Cho từ từ
theo thành ống 0,5ml acid sulphuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống. Ở mặt tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng sẽ xuất hiện 1 vòng màu tím đỏ. Lắc nhẹ, lớp chất lỏng phía trên sẽ có màu xanh lá.
3.2.1.4. Định tính Alcaloid
Cho 3g bột dược liệu vào bình nón, thấm ẩm dược liệu bằng dung dịch H2SO4 1N. Đun sôi, để nguội. Lọc dịch lọc vào bình gạn. Kiềm hóa dịch lọc bằng dung dịch NH3 đến pH 9-10 (thử bằng chỉ thị vạn năng). Chiết alkaloid base bằng CHCl330ml/lần × 3 lần. Gộp các dịch chiết CHCl3, loại nước bằng Na2SO4 khan. Dịch chiết đem lắc với dung dịch H2SO41N 2 lần, 20ml/lần. Gộp các dịch chiết acid để làm các phản ứng với thuốc thử chung của alcaloid. Cho vào mỗi ống nghiệm 1ml dịch chiết acid rồi thêm vào từng ống 2-3 giọt lần lượt các thuốc thử sau:
- Ống 1: thuốc thử Mayer, cho tủa màu từ trắng đến vàng - Ống 2: thuốc thử Bouchardat, cho tủa nâu đến đỏ nâu - Ống 3: thuốc thử Dragendorff, cho tủa vàng cam đến đỏ. 3.2.1.5. Định tính Anthranoid
Phản ứng Borntrager: Lấy 3 g bột dược liệu cho vào bình nón, thêm 40ml dung dịch H2SO4 1N, đun sôi cách thủy trong 15 phút. Để nguội, lọc. Cho dịch lọc vào bình gạn, lắc với 5ml ether, gạn lấy phần ether, lấy 1ml cho vào ống nghiệm, thêm 1ml dung dịch NaOH 10%, lắc nhẹ. Lớp nước sẽ có màu đỏ sim.
Tiến hành chiết xuất dịch chiết nước để làm các phản ứng định tính
saponin, tanin, acid hữu cơ, acid amin, đường khử, polysaccharid như sau:
Cân 20g bột dược liệu cho vào bình nón, thêm 80ml nước cất, đun sôi cách thủy 10 phút, lọc nóng. Dùng dịch lọc làm các phản ứng: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Quan sát hiện tượng tạo bọt: Cho vào ống nghiệm to 2ml dịch chiết nước, thêm 10ml nước cất. Lắc mạnh trong 5 phút theo chiều dọc của ống nghiệm, để yên, quan sát hiện tượng tạo bọt. Nếu bọt còn bền vững sau 15 phút thì sơ bộ kết luận dược liệu có chứa saponin.
3.2.1.7. Định tính tanin
Cho vào 4 ống nghiệm mỗi ống 1ml dịch chiết nước, làm các phản ứng sau : Phản ứng với dung dịch FeCl3 5% : Cho vào ống nghiệm chứa dịch chiết 2-3 giọt dung dịch FeCl35% , xuất hiện tủa xanh đen.
Phản ứng với dung dịch gelantin 1% : Thêm 2-3 giọt dung dịch gelantin 1% vào ống nghiệm có chưa dịch chiết, xuất hiện tủa bông trắng.
Phản ứng với chì acetat: Cho vào ống nghiệm chứa dịch chiết 2-3 giọt dung dịch chì acetat 10%, xuất hiện tủa bông trắng.
Phản ứng với dung dịch đồng acetat : Thêm 2-3 giọt đồng acetat 10% vào ống nghiệm có chứa dịch chiết, xuất hiện tủa nâu.
3.2.1.8. Định tính acid hữu cơ
Cho dịch chiết dược liệu vào một ống nghiệm, thêm một ít tinh thể Na2CO3, thấy có bọt khí.
3.2.1.9. Định tính acid amin
Lấy 2ml dịch chiết nước dược liệu cho vào ống nghiệm sạch, thêm 2-3 giọt thuốc thử Ninhydrin 3%, đun cách thủy sôi 10 phút, thấy chuyển sang màu tím. 3.2.1.10. Định tính đường khử
Lấy 2ml dịch chiết, thêm 3 giọt thuốc thử Fehling A và 3 giọt thuốc thử Fehling B, đun cách thủy 10 phút, thấy có tủa đỏ gạch.
3.2.1.11. Định tính Polysaccharid
Lấy 2 ống nghiệm sạch, cho vào mỗi ống : Ống 1 : 4ml nước cất và 5 giọt thuốc thử Lugol
Ống 2 : 4ml dịch chiết nước dược liệu và cho 5 giọt thuốc thử Lugol Ống 2 sẽ xuất hiện màu nâu đỏ.
Tiến hành chiết xuất dịch chiết ether dầu hỏa để làm các phản ứng
định tính sterol, chất béo, caroten như sau : Cân 10 g dược liệu cho vào bình nón. Đổ ngập ether dầu hỏa, ngâm qua đêm, lọc . Dịch lọc làm các phản ứng sau :
3.2.1.12. Định tính sterol
Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết ether dầu hỏa, bốc hơi dung môi đến khô. Thêm vào ống nghiệm 1ml anhydid acetic, lắc kĩ. Để nghiêng 450, thêm từ từ 1ml H2SO4đặc theo thành ống nghiệm, thấy mặt phân cách có màu đỏ tím. 3.2.1.13. Định tính chất béo
Nhỏ 2 giọt dịch chiết lên giấy lọc, hơ cho bay hơi hết dung môi, thấy để lại vết mờ trên giấy lọc.
3.2.1.14. Định tính caroten
Cho vào ống nghiệm 2ml dịch chiết ether dầu hỏa, bốc hơi cách thủy đến cắn. Thêm 2 giọt H2SO4 đặc vào cắn, thấy xuất hiện màu xanh.
Kết quả định tính các nhóm chất trong 3 dược liệu rễ cau, rễ dừa, rễ chuối bằng phản ứng hóa học được tổng kết trong bảng 3.
Bảng 3 : Kết quả định tính các nhóm chất trong 3 dược liệu của bài thuốc bằng phản ứng hóa học
STT Nhóm chất Phản ứng Rễ Kết quả
cau
Rễ
dừa chuối Rễ
1 Alcaloid Pư. Với TT Mayer - - -
Pư.với TT Dragendorff - - - Pư.với TT Bouchardat - - -
2 Anthranoid Pư. Borntraeger - - - (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3 Flavonoid Pư.Cyanidin ++ +++ +++
Pư. với hơi NH3 +++ +++ +++ Pư.với dd NaOH 10% +++ +++ +++ Pư. Với dd FeCl35% +++ +++ +++ 4 Coumarin Mở, đóng vòng lacton - - -
Quan sát huỳnh quang dưới
ánh sáng tử ngoại - - -
5 Saponin Quan sát hiện tượng tạo bọt + ++ +++ 6 Glycosid tim Pư. Liebermann Burchardt - - -
Pư. Baljet - - -
Pư.Legal - - -
Pư.Keller-Kiliani - - -
7 Tanin Pư. Với dd FeCl35% +++ +++ +++ Pư. Với dd chì acetat 10% +++ +++ +++ Pư. Với dd gelantin 1% ++ ++ + Pư. Với dd đồng acetat 10% ++ ++ +++ 8 Chất béo Vết mờ trên giấy lọc - - - 9 Sterol Pư.Liebermann-Burchardt - +++ +++ 10 Acid hữu cơ Pư với Na2CO3 + + - 11 Đường khử Pư.với TT Fehling ++ +++ +++ 12 Polysaccarid Pư. Với dd Lugol - - - 13 Acid amin Pư.với TT Ninhydrin 3% - - - 14 Caroten Pư.với H2SO4đặc - - -
Ghi chú: - : phản ứng âm tính ++ : phản ứng dương tính rõ + : phản ứng dường tính +++: phản ứng dương tính rất rõ Nhận xét: Từ kết quả định tính ở bảng 3 có thể sơ bộ kết luận:
-Trong rễ cau có flavonoid, tanin, saponin, acid hữu cơ, đường khử. -Trong rễ dừa có flavonoid, tanin, saponin, acid hữu cơ, đường khử, sterol. -Trong rễ chuối tiêu có flavonoid, tanin, saponin, đường khử, sterol.
3.2.2. Định tính một số nhóm chất trong bài thuốc chữa huyết khối tĩnh mạch chi bằng phản ứng hóa học
Cân 5,2g bột rễ cau, 10,1 g bột rễ dừa, 4,7g bột rễ chuối cho vào bình nón to, thêm 300ml nước cất , đun sôi trên bếp hồng ngoại trong 30 phút, lọc nóng thu dịch chiết nước. ½ Dịch chiết nước đem tiến hành các phản ứng định tính tannin, saponin, đường khử như trong mục 2.1.1. Chuyển ½ dịch chiết còn lại vào bình gạn, để nguội. Lắc dịch chiết nước với Ethyl acetat 3
lần, mỗi lần 20ml Ethyl acetat. Gộp dịch chiết Ethyl acetat, đem bốc hơi dung môi thu được cắn khô. Hòa tan cắn bài thuốc trong cồn 900 rồi tiến hành các phản ứng định tính flavonoid như trong mục 2.1.1.
Kết quả định tính một số nhóm chất trong bài thuốc được trình bày ở bảng 4.
Bảng 4: Kết quả định tính các nhóm chất của bài thuốc
STT Nhóm chất Phản ứng Kết quả Kết luận
1 Flavonoid Pư.Cyanidin +++ Có
Pư. Với hơi NH3 +++ Pư.với dd NaOH 10% +++ Pư. Với dd FeCl35%
2 Saponin Quan sát hiện tượng tạo bọt +++ Có 3 Tanin Pư. Với dd FeCl35% +++ Có
Pư. Với dd chì acetat 10% +++ Pư. Với dd gelantin 1% ++ Pư. Với dd đồng acetat 10% ++
4 Đường khử Pư.với TT Fehling +++ Có
Ghi chú: ++ : phản ứng dương tính rõ +++: phản ứng dương tính rất rõ Nhận xét: Từ kết quả định tính ở bảng 4 cho thấy trong thành phần hóa học của bài thuốc có các nhóm chất : flavonoid, tanin, saponin, đường khử, tương tự như các nhóm chất có trong thành phần hóa học của 3 dược liệu.