máu và trên sự ngưng tập tiểu cầu
3.3.1. Chuẩn bị cắn dược liệu
- Cân chính xác 20g dược liệu khô (5,2g bột rễ cau, 10,1g bột rễ dừa, 4,7g bột rễ chuối tiêu).
- Chiết dược liệu bằng nước cất, 2 lần, mỗi lần đun sôi trong 30 phút. Gộp dịch chiết đem cô cách thủy ở 700 đến cắn khô.
3.3.2. Chuẩn bị mẫu máu
- Đối tượng lấy máu là người bình thường tuổi từ 18 đến 55 tuổi, không mắc các bệnh về đông máu, không sử dụng bất kì chất nào có ảnh hưởng đến quá trình đông máu và chức năng tiểu cầu.
- Lấy máu tĩnh mạch vào buổi sáng, máu được lấy vào trong các ống ngiệm có sẵn chất chống đông natri citrat 3,8% theo tỉ lệ 9 thể tích máu : 1 thể tích chất chống đông, trộn đều.
3.3.3. Đánh giá ảnh hưởng in vitro cuả bài thuốc trên thời gian Quick (PT), thời gian Cephalin – kaolin (APTT), thời gian thrombin (TT)
- Máu được ly tâm với tốc độ 3000 vòng/phút trên máy ly tâm Universad 320 (Đức) trong thời gian 10 phút thu huyết tương nghèo tiểu cầu (PPP).
- Lấy chính xác 1,00g cắn cho vào bình định mức 100ml, thêm nước đến vạch đủ 100ml, hòa tan cắn, lọc, thu được dịch chiết có nồng độ 1 mg/ml (khối lượng cắn/thể tích dung dịch).
- Từ dung dịch trên pha loãng với nước cất thành các nồng độ thích hợp để thử tác dụng.
- Trộn huyết tương với dịch chiết và các hóa chất thích hợp theo bảng 5. - Đo thời gian PT, APTT,TT trên máy CA1500 tại khoa Huyết học bệnh viện Bạch Mai.
- Mẫu chứng là mẫu chứa nước cất thay cho dịch chiết, tiến hành song song trong cùng điều kiện với mẫu thử.
- Tiến hành đo trên 3 mẫu chứng và 3 mẫu thử/ 1nồng độ của dịch chiết dược liệu.
Bảng 5: Thành phần các mẫu trong quy trình thử nghiệm đánh giá ảnh hưởng của bài thuốc trên quá trình đông máu
- Kết quả : Kết quả đánh giá ảnh hưởng in vitro của bài thuốc trên thời gian PT, APTT, TT được trình bày trong bảng 6 sau đây:
Mẫu Thành phần Xét nghiệm các chỉ số đông máu
PT APTT TT
Thử
Huyết tương 50µl 50µl 50µl Dịch chiết dược liệu 50µl 50µl 50µl
Thromboplastin 50µl 0 0
Cephalin-kaolin 0 50µl 0
Dd CaCl2 0.025M 0 50µl 0
Thrombin 0 0 50µl
Bảng 6: Kết quả đánh giá ảnh hưởng in vitro của bài thuốc trên các thời gian PT, APTT, TT Mẫu Nồng độ (mg/ml) PT (s) APTT (s) TT (s) Thử 1,0 17,3± 0,36* 102,43 ± 11,75* Không đông (>100s) 0,5 16,40 ± 0,26* 64,10 ± 2,89* 38,33 ± 1,94* 0,25 16,33 ± 0,06* 58,23 ± 2,14* 20,13 ± 0,50* 0,1 16,53 ± 0,15* 55,90 ± 1,77* 16,67 ± 0,12* 0,05 16,43 ± 0,06* 50,43 ± 0,65* 15,80 ± 0,20** 0,025 16,23 ± 0,15* 45,77 ± 0,45* 15,67± 0,31** 0,01 16,40 ± 0,2* 43,73 ±0,45** 15,56± 0,42** 0,005 16,30 ± 0,26* 44,17± 1,29** 15,73± 0,61** Chứng 0 15,67 ± 0,29 41,53 ± 1,37 15,67 ± 0,50 * : p < 0,05 ** : p > 0,05
Nhận xét : Kết quả thử nghiệm cho thấy ở dịch chiết nước bài thuốc có ảnh hưởng đến cả 3 thông số thời gian PT, APTT, TT so với mẫu chứng một cách phụ thuộc vào nồng độ. Ở các nồng độ 0,1 mg/ml; 0,25 mg/ml; 0,5 mg/ml; 1 mg/ml dịch chiết bài thuốc làm kéo dài cả 3 thời gian PT, APPT, TT so với mẫu chứng, trong đó nồng độ 1mg/ml thể hiện tác dụng rõ rệt nhất. Thời gian PT của mẫu chứng là 15,67 ± 0,29(s), của mẫu thử là 17,3± 0,36(s); thời gian APTT của chứng là 41,53 ± 1,37(s), dưới ảnh hưởng của dịch chiết nồng độ 1mg/ml thời gian này tăng lên gần gấp 3 lần so với chứng là 102,43 ± 11,75(s); thời gian TT của chứng là 15,67 ± 0,50(s), còn của thử tăng hơn 6 lần lên tới > 100(s). Như vậy, kết quả thử nghiệm cho thấy ở cùng một nồng độ dịch chiết có mức độ ảnh hưởng khác nhau lên 3 thông số, dịch chiết ảnh hưởng rõ rệt lên thời gian APTT và TT hơn so với thời gian PT.
Từ nồng độ ≤ 0,05 mg/ml dịch chiết không còn tác dụng trên thời gian TT so với chứng. Ở nồng độ ≤ 0,01 mg/ml kết quả cho thấy dịch chiết không còn tác dụng kéo dài thời gian APTT so với chứng. Trong khi đó ngay ở nồng độ nhỏ nhất được khảo sát trong thử nghiệm là 0,005 mg/ml dịch chiết bài thuốc vẫn có tác dụng kéo dài thời gian PT so với mẫu chứng (p < 0,05).
3.3.4. Đánh giá ảnh hưởng in vitro của bài thuốc trên sự ngưng tập tiểu cầu
- Chuẩn bị huyết tương giàu tiểu cầu:
Máu đem ly tâm với tốc độ 500 vòng/ phút trong thời gian 10 phút,thu huyết tương giàu tiểu cầu (PRP), tiếp tục ly tâm phần máu còn lại với tốc độ 3000 vòng/ phút trong thời gian 10 phút, thu huyết tương nghèo tiểu cầu (PPP),thực hiện trên máy ly tâm Universad 320 (Đức).
- Lấy chính xác 1,00g cắn cho vào bình định mức 50ml, thêm dung dịch NaCl 0,9% đến vạch đủ 50ml, hòa tan cắn, lọc, thu được dịch chiết có nồng độ 2 mg/ml (khối lượng cắn/thể tích dung dịch). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Từ dung dịch trên pha loãng với dung dịch NaCl 0,9% thành các nồng độ thích hợp để thử tác dụng.
- Tiến hành:
Lấy chính xác 450µl PRP, thêm 50µl dịch chiết,vào cuvet của máy đo độ ngưng tập tiểu cầu,ủ trong 10 phút ở 370C. Thêm chất kích tập ADP 10µmol/l với thể tích là 5µl.
Đo độ ngưng tập tiểu cầu trên máy đo Chronolog (Mỹ) tại khoa huyết học bệnh viện Bạch Mai.
Mẫu chứng là mẫu có 50µl dung dịch NaCl 0,9% thay cho dịch chiết, tiến hành song song trong cùng điều kiện với mẫu thử.
Tiến hành đo trên 3 mẫu chứng và 3 mẫu thử/1nồng độ của dịch chiết dược liệu.
Bảng 7. Thành phần các mẫu trong quy trình thử nghiệm đánh giá ảnh hưởng của bài thuốc trên sự ngưng tập tiểu cầu
- Kết quả : Kết quả đánh giá ảnh hưởng in vitro của bài thuốc trên sự ngưng tập tiểu cầu được trình bày trong bảng 8 sau đây:
Bảng 8: Kết quả thử nghiệm đánh giá ảnh hưởng in vitro của bài thuốc
trên sự ngưng tập tiểu cầu
Mẫu Nồng độ (mg/ml) Độ ngưng tập tiểu cầu (%) % Ức chế ngưng tập tiểu cầu (%) Thử 2,00 11,00±2,65* 84,58 1,00 23,00±7,55* 67,76 0,50 34,33±13,43* 51,87 0,25 65,00±2,65* 8,87 Chứng 0,00 71,33±2,31 0,00 * : p < 0,05
Nhận xét: Kết quả cho thấy ở 4 nồng độ thử nghiệm là 2 mg/ml,1 mg/ml, 0,5 mg/ml và 0,25 mg/ml, dịch chiết bài thuốc đều có tác dụng ức chế kết tập tiểu cầu so với mẫu chứng (p < 0,05). Tác dụng giảm dần từ nống độ 2mg/ml đến 0,25
Mẫu Thành phần Xét nghiệm đo độ ngưng tập tiểu cầu Thử
Huyết tương 450µl
Dịch chiết dược liệu 50µl Chất gây kích tập
ADP 10µmol/l
5µl
Chứng Tương tự như mẫu thử, dịch chiết dược liệu được thay thế bằng dung dịch NaCl 0,9 %
mg/ml, nếu coi mẫu chứng không xảy ra hiện tượng ức chế ngưng tập tiểu cầu hay % ức chế ngưng tập tiểu cầu bằng 0% thì dịch chiết bài thuốc nồng độ 1 mg/ml có % ức chế ngưng tập tiểu cầu là 67,76%, và của mẫu thử nồng độ 2 mg/ml có thể ức chế ngưng tập tiểu cầu tới 84,58% so với mẫu chứng (p < 0,05).