Góp phần nghiên cứu về thực vật ,hóa học và một số tác dụng sinh học của cây nhó đông (cephaelis sp rubiaceae)

TRẦN PHI HÙNG GÓP PHẦN NGHIÊN c ú u VỀ THựC VẬT, HOÁ HỌC VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CÂY NHÓ ĐÔNG HÀ NỘI - 1999... TRẦN PHI HÙNG GÓP PHẦN NGHIÊN c ú ư VỀ THựC VẬT, HOÁ HỌC VÀ MỘT SỐ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

DS TRẦN PHI HÙNG

GÓP PHẦN NGHIÊN c ú u VỀ THựC VẬT, HOÁ HỌC VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CÂY NHÓ ĐÔNG

HÀ NỘI - 1999

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

DS TRẦN PHI HÙNG

GÓP PHẦN NGHIÊN c ú ư VỀ THựC VẬT, HOÁ HỌC VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CÂY NHÓ ĐÔNG

TS Nguyễn Duy Thuần

LỜI CẢM ƠN

ợ tỉ/í írỉ/i/t /iợ/ừỂ/i eứu tùì ều tàti ỉ/íà/i/i /í/ự// ííỉ/ *tàự, tó / đ a ttAậềt đ ititie sư’ ụùỉp đô’ ít/iỉê/ tỉ/i/i, ờ/tư tTíín tú ì ỉ*íổc f/êp eủa f//fỉự: C/rị’ Aơe £7rầ/ỉ <7Jă/i 0/uu tA ; Ĩ7S rfỉợưụj/i (Du// (77///fĩ/ỉ.

r o ,í/ Sà/tợ 6/rt/i írữttợ íịà /ù ẻỉ f//ỉ xâu ẨO£, tó t se//i ợử/ đề/t cứ/ĩ í/íầự /r)/ eá/tt ứ/ỉ e/íâ/i /t/ỉâí.

^/ẢỈf/ự t/u& đ ễ /tnà/i í/ùê/i /uậỉi ấ/1 ỉfùf/, tó/ i f}//ự /i/rậ/í đí/ịXe Jí/' (///íp

/fírĩ eủ a ĩ @ /uỉựềfi; £7cị’ ^XYtíUí /ffU ' £7/<ầ/t

3 £ /iá ỉt/i; Ĩ7<rị f J ế ự //ụ /'/ỉ ^Ỡ cêỉ Q Y iừ/i; & (£ ẽ a ữ ^ Ả ĩ/t ^7 //ỉf {'////ự íU Í/ l o ' ợ /ỉỉ/j

đ ã ớ iỉa eá n f//tỉ/y , ờA /ỉ'rt/f Ợ (Bậ ftiâ fi fflu 'tfe //ê i/, e iậ lý ^J//r)ỉỉỢ

ỉựá ư/fỉ đ ạ / /tợe íxà eáe cá/i Á í eửa (Xtỉ’ ê /1 ffla'ờ’ e £iêu &rufiự tứữtợ,

J7 £ /ê ỷ /i / tự / / /i'm ^ 7 r //í/f/ ( Z tìê /1 £ ĩả / //Ợ íỉự ê // tù ì J ỉ / f / / f / u í / ý rờ f’ê //

66

6

6

7714

16

1616

19

19

19

2020

27

2828

2.1.1 Đặc điểm bộ Cà phê Rubiales

2.1.2 Đặc điểm họ Cà phê Rubiaceae

2.1.3 Đặc điểm chi Cephaelis Swatz

2.2 Thành phần hóa học

2.3 Tác dụng sinh học và công dụng của anthranoid

Phần 3 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

3.1 Đối tượng nghiên cứu

3.2 Phương pháp nghiên cứu

4.2 Nghiên cứu về thành phần hóa học

4.2.1 Định tính các nhóm chất chính trong dược liệu

4.2.2 Định lượng anthranoid trong dược liệu

4.2.3 Chiết xuất và phân lập anthranoid

4.3 Thử tác dụng sinh học và khảo sát ứng dụng lâm sàng 59

4.3.3 Khảo sát việc sử dụng rễ Nhó đông chữa viêm đại tràng ở 64

bệnh viện Y học cổ truyền Tỉnh Sơn La

Phần 1 ĐẬT VẤN ĐỂ

Dân tộc ta có một bề dày lịch sử dựng nước và giữ nước, để tồn tại và phát triển, từ ngàn đời nay con người phải chống chọi với thiên nhiên, bệnh tật, trong khi nền y học chưa phát triển, con ngưòi chủ yếu phải dựa vào thiên nhiên, lấy thảo mộc làm thuốc phòng và chữa bệnh là chính Do vậy cây thuốc giữ một vị trí rất quan trọng trong đời sống con người, qua nhiều thế hệ đã đúc kết được nhiều kinh nghiệm quý báu cho nền y học Mặt khác cây thuốc còn là nguồn nguyên liệu quan trọng để phục vụ cho công nghiệp bào chế, chiết xuất và sản xuất thuốc

Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ của khoa học, kỹ thuật, nền y học trên thế giới và trong nước cũng phát triển mạnh, thuốc tổng hợp và bán tổng hợp khá phong phú về chủng loại, mẫu mã đa dạng, tiện lợi, nhưng cũng không thể thay thế hết được các thuốc có nguồn gốc dược liệu Thuốc có nguồn gốc từ dược liệu

có những tính ưu việt như: ít độc, ít tác dụng không mong muốn Vì thế không

những ở nước ta mà còn nhiều nước trên thế giới có xu hướng phát triển sản xuất

thuốc có nguồn gốc dược liệu hoặc bán tổng hợp, tổng hợp các chất theo cấu trúc của các hợp chất tự nhiên

Nước ta nằm ở khu vực Đông Nam Á, chịu ảnh hưởng của địa lý, khí hậu

nhiệt đới gió mùa và khu vực, cùng với sự phát triển của tự nhiên, nhân dân ta

có một kinh nghiệm lâu đời về dùng thuốc dược liệu, điều này đã ăn sâu vào ý thức người dân từ cổ xưa đến nay Trong thời kỳ phong kiến, vào các triều đại: Đinh, Lý, Trần, Lê, Y học Việt Nam khá phát triển, có nhiều danh y nổi tiếng như Tuệ Tĩnh, Hải Thượng Lãn ô ng, đúc rút được nhiều kinh nghiệm chữa bệnh

và đã tổng kết kinh nghiệm viết thành nhiều bộ sách thuốc Sau cách mạng

3

tháng 8, Y học cổ truyền càng được chú trọng và phát triển Ngày nay càng có nhiều cây thuốc được nghiên cứu và sử dụng làm thuốc mà các thuốc tổng hợp không thể thay thế được.

Đời sống kinh tế, xã hội phát triển, thực phẩm phong phú, nhiều chủng loại, thức ăn chín, thức ăn sẵn cũng rất nhiều Trong quá trình chế biến, bảo quản thực phẩm, không tránh khỏi bị ô nhiễm, đôi khi dẫn đến người sử dụng dễ bị nhiễm khuẩn Các bệnh về đường tiêu hoá ngày càng nhiều, trong đó viêm đại tràng là một bệnh thường gặp và điều trị còn khó khăn và phải kéo dài, gây nhiều tác hại cho bệnh nhân, ảnh hưởng đến sức khoẻ, sức lao động Hiện nay trên thị truờng đang lưu hành một số thuốc tân dược điều trị viêm đại tràng như Biseptol, Motilium-M, người bệnh dùng những thuốc này ít khỏi bệnh, hiệu quả điều trị bệnh không cao Dùng những thuốc này nhiều còn có tác dụng ngoài ý muốn là gây rối loạn hệ vi khuẩn đưòng ruột, gây rối loạn tiêu hoá, hay tái phát, ảnh hưởng đến thận Để giải quyết phần nào nỗi khổ của người bệnh và những trăn trở của các thầy thuốc, đã nhiều năm nay chúng tôi tìm hiểu và nghiên cứu áp dụng bài thuốc chữa viêm đại tràng của dân tộc Thái tỉnh Sơn La Bài thuốc gồm

2 vị là cây Hế mọ và cây Nhó đông Bài thuốc này đã được Bệnh viện Y học cổ truyền tỉnh Sơn La áp dụng điều trị từ năm 1990 đến nay đã điều trị khỏi được nhiều bệnh nhân Riêng cây Nhó đông, ngoài tác dụng trong bài thuốc trên còn được dùng trong các bệnh về rối loạn tiêu hoá, viêm gan (thể hoàng đản) suy nhược cơ thể, ăn uống kém, được dùng làm nước uống hàng ngày

Để có cơ sở khoa học trong việc sử dụng cây Nhó đông làm thuốc, chúng tôi chọn đề tài: “Góp phần nghiên cứu về thực vật, hoá học và một số tác dụng sinh học của cây Nhó đông (Cephaelis sp Rubiaceae)”

Với những nội dung nghiên cứu như sau:

1 Mô tả đặc điểm hình thái thực vật, nghiên cứu đặc điểm vi học và góp phần xác định tên khoa học của cây Nhó đông

2 Bước đầu nghiên cứu thành phần hoá học

3 Thử độc tính và tác dụng kháng khuẩn của dược liệu

4 Khảo sát ứng dụng lâm sàng tại bệnh viện Y học cổ truyền Tỉnh Sơn La

5

Phần 2 TỔNG QUAN

2.1.1 Đặc điểm bộ Cà phê Rubỉales

Theo tài liệu [12], bộ Cà phê gồm 2 họ: Dialypentalanthaceae và Rubiaceae

Đặc điểm chung của bộ Cà phê Rubiales: lá đơn, mép lá nguyên, mọc đối

có lá kèm, tràng hợp, đều, 5 nhị ít khi nhiều hơn, nhị trước cánh hoa, bao phấn 2

ô, rời, mở dọc Bầu hạ, nhiều noãn có khi giảm chỉ còn 1 noãn, đính noãn trung trụ, ít khi đính noãn bên, hạt có nội nhũ

2.1.2 Đặc điểm họ cà phê Rubiaceae

Theo tài liệu [9], [12], họ Cà phê gồm có 450 chi, trên 7000 loài chủ yếu

phân bố ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới.

ở Việt Nam có trên 90 chi và khoảng 430 loài [11], [12]

Họ cà phê rất phong phú về dạng sống, có đủ các loại từ cây gỗ lớn đến cây bụi, dây leo, cây phụ sinh, cây thảo, nhưng thưòng là cây gỗ, cây bụi, ít khi là cây thảo Lá mọc đối hoặc mọc vòng, nguyên hoặc ít khi có răng cưa, đơn, lá kèm thường ở phía trong cuống hay ở giữa 2 cuống lá, rời hoặc dính, đôi khi có dạng lá và rất khó phân biệt với lá Hoa phần lớn lưỡng tính, hoa đều, hãn hữu gần như không đều Hoa mọc riêng lẻ hoặc dạng đầu, 4-5 đài, 4-5 tràng hàn liền thành ống, tiền khai vặn, lợp hoặc van Số nhị nhiều bằng số cánh hoa và mọc xen kẽ với cánh hoa, nhị đính vào ống hoặc họng tràng, bao phấn rời, 2 ô, mở

Vòi nhuỵ thường mảnh dẻ, chia thuỳ theo nhiều cách khác nhau, noãn một tới nhiều Quả nang, mọng, hạch Hạt ít khi có cánh, phần lớn có nội nhũ, phôi thẳng hoặc cong.

2.1.3 Đặc điểm chi Cephaelis Swartz

Theo tài liệu [46], chi Cephaelis gồm các cây bụi, cây gỗ nhỏ, sống dai, thường mọc đứng, lá hình trái xoan ngược hay thuôn dài, lá kèm nhiều khi hợp sinh Cụm hoa hình đầu, bao bọc bởi một bao chung, 4 - 5 lá đài, 4 - 5 cánh hoa, mọc đứng hay trải ra, tiền khai van, họng tràng trần hay có lông, 4 - 5 nhị, chỉ nhị đính ở họng của tràng, phần nhiều thò ra ngoài Bao phấn thuôn dài hay hẹp dài, đính lưng Bầu có 2 ô, ít khi 3 - 4 ô, vòi dài hay ngắn, một noãn trong mỗi ô, quả khô hay nạc, hai hạch Hạt phẳng, lồi, vỏ ngoài dạng màng, cây mầm nhỏ, lá mầm dạng lá, nội nhũ thịt

2.2.Thành phần hoá học

Theo Ngô Văn Thu [36], thành phần hoá học của các cây họ Cà phê rất phức tạp Trong quá trình nghiên cứu và thăm dò, chúng tôi phát hiện các cây thuộc chi Cephaelis có chứa tetoquinon, anthragallon, chrysophanol, anthraquinon Trong cây Nhó đông (Cephaelis sp Rubiaceae) có anthranoid

Do vậy trong mục tổng quan này, chúng tôi xin điểm lại một số vấn đề liên quan đến hợp chất anthranoid

Anthranoid nằm trong nhóm lớn hydroxyquinon [36] Anthranoid khi tổn tại dưới dạng glycosid thì được gọi là anthraglycosid hay anthracenosid Cũng như các loại glycosid khác, anthraglycosid khi bị thuỷ phân thì giải phóng ra phần aglycon và phần đường Phần aglycon là dẫn chất 9,10-anthracendion Vì trong tự nhiên hầu như chưa gặp các dẫn chất 1, 2 hoặc 1, 4 anthracendion nên

7

khi nói đến dẫn chất anthraquinon trong tự nhiên người ta hiểu rằng đó là những chất 9, 10-anthracendion có công thức chung:

* Trong nhóm phẩm nhuộm có:

- Indigo (Trong cây Indigofera argentica L.)

- Ramenton và lapachol từ cây Tectona grandis L

- Alkalin từ cây Alkanna tinctoria L

Theo Ngô Văn Thu [36]: Sự tạo thành dẫn chất anthraquinon có 2 con đường nhưng con đường tạo thành các dẫn chất anthraquinon trong một số họ thực vật và chủ yếu trong họ cà phê (Rubiaceae) thì chủ yếu từ tiền chất là acid shikimic Sau khi acid này ngưng tụ với 1 acid a-cetoglutaric thì tạo thành một dẫn chất naphtalen, chất này lại gắn thêm 1 gốc isopteryl để rồi đóng vòng tạo ra các dẫn chất anthraquinon

OH

Các dẫn chất anthranoid được chia thành các nhóm sau:

+ Nhóm phẩm nhuộm: những dẫn chất thuộc nhóm này có màu từ đỏ cam đến tía, trong cấu trúc có 2 nhóm -OH kế cận ở vị trí a và p và hay gặp trong

9

một số chi thuộc họ Cà phê Rubiaceae (Chi Rubia coprosma ) Ví dụ alizarin (1 , 2 dihydroxy anthraquinon) acid ruberythric (2-primeverosid của alizarin), purpurin (1,2,4-trihydroxy anthraquinon).

+ Nhóm nhuận tẩy: Những dẫn chất thuộc nhóm này thường có 2 nhóm

- OH đính ở vị trí 1,8 và ở vị trí 3 thường là nhóm - CH3; - CHoOH; - CHO hoặc

- COOH nên còn được gọi là nhóm oxymethyl-anthraquinon, người ta hay gặp các dẫn chất có cùng cấu trúc, chỉ khác nhau ở mức độ oxy hoá ở C3 trong cùng một loài Ví dụ: Trong Đại hoàng, Chút chít, Thảo quyết minh thì có cả 3 chất:

nhóm chức ceton của anthraquinon sẽ cho một dẫn chất anthron hoặc đồng phân

hỗ biến của chất này là anthranol (dạng enol) Nếu khử tiếp thì dẫn đến dẫn chất dihydro anthranol

+ H2 „ -

+ Nhóm dimer: Một số dẫn chất anthranoid dimer do 2 phân tử ở dạng

anthron bị oxy hoá rồi trùng hợp với nhau tạo thành dianthron, như sự tạo thành hypericin là chất có trong cây Hyperycum perforatum, có tác dung kháng khuẩn, dùng chữa viêm dạ dầy, ruột, răng, miệng

11

2 phân tử emodin anthron Diemodin anthron

' S s

1 1

Các dẫn chất anthranoid được phân bố trong khoảng 30 họ thực vật khác nhau, chủ yếu những cây 2 lá mầm, các họ hay gặp Caesalpiniaceae, Rhamnaceae, Rubiaceae, Polygonaceae [36].

trong đó một số chất có trong họ cà phê như sau:

+ 2- hydroxyanthraquinon 2-OH có trong chi Oldenlandia thuộc họ Cà phêRubiaceae

+ 2-hydroxy, 3-methyl, 2-OH, 3-CH3 có trong chi Coprosma

+ Alizarin 1,2-OH có trong chi Oldenlandia, Rubia, Galium, Asperula, Crucianella

+ Alizarin 1-methyl ether l-OCH3, -20H có trong chi Oldenlandria, Morinda, Rubia

+ Rubiadin methyl ether 2-OH, 3-CH3, 4-OCH3 có trong chi Morinda, Coprosma

+ Lucidin 2,4-OH, 3-CH2OH có trong chi Coprosma

+ Munjistin 2,4-OH, 3-COOH có trong chi Rubia

1 3

+ Soranjidiol 4,7-OH, 3-CH3 có trong chi Morinda, Coprosma.

+ Purpurin 1,2,4-OH có trong chi Rubia, Relbunium

+ Copareolatin 4,6,7,8-OH, 3-CH3 có trong chi Corposma

Trên đây chỉ là một số ví dụ mà chúng tôi nêu ra trong khoảng gần 30 chất có trong một số chi thuộc họ Rubiaceae

2.3 Tác dụng sinh học và công dụng của anthranoid

Theo các tài liệu [29]; [30]; [31]; [36], các dẫn chất anthranoid chủ yếu là các Ị3-glycosid dễ hoà tan trong nước, không bị hấp thu cũng như bị thuỷ phân ở ruột non Khi đến ruột già, dưới tác dụng của P-glycosidase trong hệ vi khuẩn đường ruột thì các glycosid bị thuỷ phân và các dẫn chất anthraquinon bị khử tạo thành dạng anthron và anthranol, dạng này có tác dụng tẩy xổ Do đó có thể giải thích lý do tác dụng đến chậm sau khi uống thuốc Dạng genin bị hấp thu ở ruột non nên không có tác dụng

Do tác dụng làm tăng nhu động ruột nên chỉ với liều nhỏ các dẫn chất 1,8 hydroxy an thraquinon dưới dạng heterosid giúp cho sự tiêu hoá được dễ dàng, ở liều vừa phải thuốc có tác dụng nhuận, ở liều cao thuốc có tác dụng gây xổ, thuốc có tác dụng chậm, 1 0 giờ sau khi uống thuốc mới có hiệu lực, vì còn có tác dụng lên cơ nhẩn của bàng quang và tử cung nên khi dùng phải thận trọng với người có thai, viêm bàng quang và viêm tử cung Thuốc được bài tiết qua sữa nên khi dùng cần chú ý đối với các bà mẹ đang cho con bú Vì thuốc được bài xuất qua nước tiểu nên nước tiểu có thể có màu hồng

Các dẫn chất anthraglycosid còn có tác dụng thông mật, lợi gan Hỗn hợp

và có tác dụng tan sỏi thận Ở Liên xô (cũ) đã có một số chế phẩm được bào chế

từ dược liệu này ở Sapa, Nghĩa Lộ, Lai Châu có cây Thiên thảo (Rubia cordiflora) cũng có những dẫn chất anthraquinon tương tự cây trên [36]

Có nhiều chất có tác dụng kháng khuẩn, tác dụng nhiều nhất đối với các vi khuẩn Gram (+) Các dẫn chất này có tác dụng kháng khuẩn là do ức chế các enzym nhờ các phản ứng cộng với các nhóm thiol hay amin đó là các chất trị nấm, đôi khi trị giun [31]

Chrysophanol có tác dụng kháng nấm nên được dùng để điều trị nấm, hắc lào, lang ben

Các hợp chất khác là các chất tạo ra meteroglobin Joglon kết hợp với các protein của da, làm bóng da nên có tác dụng tốt đối với các bệnh ngoài da [31].Theo một số tác giả Nga thì các dẫn chất quinon, đặc biệt là các dẫn chất anthraquinon có tác dụng kích thích miễn dịch chống ung thư Xuất phát từ acid chrysophanic và một số dẫn chất anthraquinon khác người ta đã bán tổng hợp một số dẫn chất có N-S và gốc halogen có hoạt tính chống ung thư [36]

Ngoài ra các dẫn chất anthranoid là nhóm dược liệu mang màu nên nó còn được dùng trong nhân dân làm phẩm nhuộm, hoặc các chất nhuộm trong công nghiệp thực phẩm, dược phẩm vì không độc

15

Phần 3 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

3.1 Đôi tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là cây Nhó đông (Cephaelis sp Rubiaceae) mọc

hoang ở rừng núi Sơn La.

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Lấy mẫu và xử lý mẫu

- Mẫu được thu hái vào thời kỳ có hoa, mẫu tiêu bản được ép trong bìa, giấy báo và được lưu trữ tại Bộ môn Dược liệu Trường đại học Dược Hà Nội, nguyên liệu được đóng trong túi polyethylen có đánh số và ghi ngày, tháng, năm, nơi thu hái

- Xử lý mẫu: Rễ, thân, lá cây Nhó đông được thái mỏng, phơi (sấy) khô Trong đó bộ phận chính đang được nghiên cứu tác dụng sinh học là rễ cây Nhó đông

3.2.2 Nghiên cứu về thực vật

3.2.2.1 Nghiên cứu về đặc điểm hình thái

Tiến hành khảo sát thực địa, quan sát, đo đạc, mô tả đặc điểm hình thái cây, ghi lại các đặc điểm quan sát được, đối chiếu với các tài liệu [8], [24], [26]

3.2.2.2 Nghiên cứu đặc điểm về giải phẫu

Theo phương pháp ghi trong các tài liệu [4], [8], [14], [24], [25], [26], [44], [45], cắt, tẩy, nhuộm kép, làm tiêu bản: Rễ, thân, lá, soi dưới kính hiển vi OKRŨSS optronic của Bộ môn Dược liệu với độ phóng đại (10, 40, 100) X 10,

mô tả các đặc điểm giải phẫu, chụp ảnh chúng và ghi lại các đặc điểm quan sát được

32.2.3 Nghiên cứu về đặc điểm vi học bột dược liệu theo phương pháp ghi trong tài liệu [4]:

Dược liệu được lấy riêng từng bộ phận, sấy khô, tán nhỏ, soi dưới kính hiển

vi OKRŨSS optronic, quan sát và chụp ảnh chúng

3.22.4 Xác định tên khoa học

Dựa vào các đặc điểm hình thái, đối chiếu với các đặc điểm được mô tả trong khoá phân loại thực vật và so sánh với các tiêu bản mẫu tại các phòng tiêu bản thực vật, tại Viện tài nguyên và sinh thái - Viện khoa học Việt Nam và Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Viện Dược liệu Trung ương, tra tìm và đối chiếu trong các tài liệu [7], [10], [13], [14], [15], [20], [21], [22], [25], [27], [28], [29], [39], [41], [46], [48] để xác định tên khoa học của cây Nhó đông

3.2.3 Nghiên cứu vê hoá học

- Định tính thành phần hoá học: Dựa vào phương pháp ghi trong các tài liệu

- Định lượng anthranoid toàn phần bằng phương pháp cân theo [6], [36]

- Sắc ký lớp mỏng với chất hấp phụ là silicagel G của Viện Kiểm nghiệm cỡ hạt 5 - 40ịj.ĩĩi, pH=7, bột bó 15% [6], [34], [40]

- Sắc ký cột dùng chất hấp phụ là silicagel dùng cho sắc ký cột của ViệnKiểm nghiệm [18], [40]

- Đo nhiệt độ nóng chảy trên máy số hiệu Osi (Pháp) tại phòng Tổng hợphữu cơ - Trường Đại học Dược Hà Nội [18]

- Phổ tử ngoại được đo trên máy BECKMAN DU-600 tại phòng nghiên cứu trung tâm - Trường Đại học Dược Hà Nội.

- Phổ hồng ngoại được đo dưới dạng viên nén KBr trên máy BECKMAN tại phòng nghiên cứu trung tâm - Trường Đại học Dược Hà Nội

- Đo phổ khối (MS) tại phòng khối phổ của Viện Hoá - Viện Khoa học Việt Nam

3.2.4 Nghiên cứu về tác dụng sinh học và ứng dụng

So sánh 2 giá trị trung bình theo giả thiết trung bình cộng (Test T), chấp nhận ở 2 mức ý nghĩa của oc (được qui ước là P) ở 0,05 và 0,01

Phần 4 THỰC NGHIỆM VÀ KÊT QUẢ

4.1 Nghiên cúti vể đặc điểm thực vật

Để nghiên cứu về đặc điểm thực vật, chúng tôi tiến hành khảo sát tại thực địa xã Chiềng An, Thị xã Sơn La, Tỉnh Sơn La, đo đạc, quan sát, chụp ảnh cây tại thực địa, cây mẫu được trồng tại Vườn thực vật Trường Đại học Dược Hà Nội

và thu mẫu khô, bảo quản tại Bộ môn Dược liệu

Cây có tên địa phương là Nhó đông (theo tiếng Dân tộc Thái)

4.1.1 Đặc điểm hình thái

Thân gỗ, nhỏ, cao 2-3m, đường kính 3-5cm

- Cành: Thiết diện vuông góc, đường kính 0,5-lcm , gióng dài 5-12cm, ngoài mặt có khía dọc, không lông, màu vàng đỏ đến màu đen ở mẫu khô, có lá kèm, cuống lá hình tam giác, rộng 15mm, cao 15mm, khi rụng để lại vết sẹo

- Lá mọc đối, hình mũi mác, dài 29 - 37cm, cuống lá dài từ 3 - 6cm, lá rộng

1 0 - 13cm, chóp lá và gốc lá đều nhọn, mép lá nguyên , mặt trên lá không có lông, mặt dưới lá có lông nhỏ (soi dưới kính hiển vi) màu xanh lục, trên mẫu khô thì mặt trên lá sẫm hơn mặt dưới Gân lá hình lông chim, 10 đôi gân phụ Ngọn các gân phụ khi gần mép lá thì cong lên và song song với mép lá tới gân phụ ở trên

- Hoa: cụm hoa hình đầu ở ngọn cành, số lượng hoa từ 10-15 hoa Cuống cụm hoa dài l-2cm Hoa không cuống, đài hình tuyến, có 4 răng cao 0,2mm Tràng hình ống dài 7mm, có 4 thuỳ, mỗi thuỳ dài 2mm và thắt lại ở phía trên, phần thắt lại dài 0,5mm, tiền khai van, 4 nhị đính ở 1/3 phía dưới của ống tràng,

19

phần chỉ nhị tách khỏi tràng dài lmm Chỉ nhị đính lưng, bao phấn chia 2 phần, phần trên dài 3,5mm, phần dưới dài l,5mm Bầu hạ cao 2 mm, rộng 3 mm, vòi dài 5,2 mm chia làm 2 thuỳ dài 1,2 mm.

- Quả hạch, màu trắng, khi chín chuyển sang màu tím đen, hình tròn, đỉnh mang vết tích của đài, cụm quả mang từ 1 - 3 quả khi trưởng thành riêng lẻ không dính lại thành khối như ở chi Morinda (cây Mặt quỷ, cây Nhàu)

Hạt màu đen, kích thước 2mm, hạt tròn

Trên ảnh 1 (trang 22) là ảnh chụp cành, lá mang hoa và quả của cây Nhó đông

4.1.2 Trồng trọt

Hiện nay cây chủ yếu mọc hoang trên miền rừng núi ở Sơn La, chưa có qui hoạch trồng Tuy nhiên, Bệnh viện Y học cổ truyền Tỉnh Sơn La đã trồng cây này tại vườn dược liệu của bệnh viện, cây phát triển tốt Có hai cách trồng để nhân giống là:

- Trồng bằng hạt: Gieo hạt vào mùa xuân (tháng 3 hoặc tháng 4), sau 7 ngày, hạt nẩy mầm, sau 1 0 - 1 5 ngày thành cây con

- Trồng bằng thân rễ, cắt từng đoạn 10cm có từ 1 - 3 mắt ngủ, đem đặt nghiêng 45° xuống đất, nén chặt đất và tưới nước đều cho ẩm, luôn giữ ẩm để dễ sinh chồi Trồng theo phương pháp này thì cây phát triển tốt, nhanh hơn trồng bằng hat

4.1.3 Cấu tạo giải phẫu

+ Vi phẫu lá, thân, rễ Nhó đông:

- Vi phẫu lá Nhó đông:

Trên vi phẫu lá Nhó đông có các phần sau

• Phần gân chính: Gân lá lồi cả trên và dưới Biểu bì trên được cấu tạo bởi một hàng tế bào hình chữ nhật, xếp đứng Biểu bì dưới là các tế bào gần vuông, rải rác có các lông che chở nhỏ Sát biểu bì trên và dưới là mô dày khoảng 5-6 hàng tế bào Bó libe-gỗ gân chính có cung libe bao phía ngoài cung gỗ, phía đầu cung libe-gỗ gập vào, trong mô mềm rải rác có các bó tinh thể calci oxalat hình kim

• Phần phiến lá: Phiến lá dầy khoảng 0,2 mm Biểu bì trên và biểu bì dưới tương tự như phần gân lá Dưới biểu bì trên là mô dậu gồm một hàng tế bào Dưới mô dậu rải rác có các bó tinh thể calci oxalat hình kim (ảnh 2; 3 trang 22)

• Sơ đồ tổng quát vi phẫu lá Nhó đông gồm:

9-Mô mềm

- Vi phẫu thân Nhó đông:

Mặt cắt ngang thân từ ngoài vào trong gồm: Biểu bì là một hàng tế bào hình chữ nhật không đều nhau, xếp đứng, sát lớp biểu bì gồm 14-15 hàng tế bào mô mềm vỏ ngoài hình tròn không đều, xếp xen kẽ để hở những khoảng gian bào nhỏ, phía trong gồm 6-7 hàng tế bào mô mềm vỏ trong thành mỏng, xếp xít nhau, giữa hai phần mô mềm vỏ là 2-3 hàng tế bào có thành mỏng hoá gỗ (bắt màu xanh), xếp thành vòng đồng tâm và dãy xuyên tâm, trong cùng phần vỏ rải rác có những đám sợi Libe cấp II gồm 7-8 hàng tế bào nhỏ xếp liên tục Tầng phát sinh libe-gỗ xếp thành vòng bao quanh phần gỗ cấp II Gỗ cấp II gồm nhiều hàng tế bào có thành hoá gỗ được xếp không liên tục và thành từng mạch nhỏ Ruột gồm nhiều tế bào hình tròn, thành mỏng, xếp xít nhau Tia ruột chỉ có một hàng tế bào nhỏ xếp xen kẽ với các mạch gỗ cấp II Trong mô mềm ruột rải rác

có các ống dẫn (ảnh 4, trang 22)

21

- Vi phẫu rễ Nhó đông:

Mặt cắt rễ từ ngoài vào trong có: Lớp bần gồm 6 - 8 hàng tế bào hình chữ nhật xếp đều đặn Mô mềm vỏ gồm những tế bào thành mỏng xếp xen kẽ nhau Libe chia thành từng bó xếp sát nhau, các bó libe rất phát triển tiến sát gần tới lớp bần, chiếm 2 phần 3 tiết diện mặt cắt của rễ cây Tầng phát sinh libe-gỗ gồm

3 - 5 lớp tế bào tạo thành vòng liên tục, gỗ gồm các mạch gỗ xếp thành dải và mô mềm gỗ, sợi gỗ, tia ruột gồm 1 - 8 hàng tế bào hình tròn kích thước không đều nhau (ảnh 5 trang 24)

+ Đặc điểm vi học bột lá, thân, rễ Nhó đông

- Bột lá Nhó đông: Bột lá màu vàng nâu, không mùi, vị đắng, soi dưới kính hiển vi thấy các mảnh phiến lá có gân lá phân nhánh, các bó tinh thể calci oxalat hình kim, đôi khi có thể thấy lớp mô dậu gồm một hàng tế bào, các mảnh biểu bì mang lông che chở hình tam giác, các mảnh mạch, lỗ khí

Các đặc điểm của bột lá Nhó đông được thể hiện trong ảnh 6 (trang 24) gồm có:

1, 2-Các mảnh phiến lá có tinh thể Calci oxalat, mô dậu, gân lá

3-Mảnh biểu bì mang lông che chở

4-Mảnh mạch

5-Tinh thể calci oxalat

6-Lỗ khí

2 3

- Bột thân Nhó đông:

Bột màu trắng ngà, hơi nâu, không mùi, không vị Soi dưới kính hiển vi thấy: mảnh mô mềm gồm nhiều tế bào hình tròn, thành mỏng, mảnh bần gồm những tế bào hình chữ nhật xếp thành hàng có màu vàng tối, các sợi riêng lẻ hoặc thành bó sợi, đám tế bào mô cứng và mảnh mạch điểm (ảnh 7, trang 26)

- Bột rễ Nhó đông:

Bột màu vàng sẫm, không mùi, không vị

Soi dưới kính hiển vi thấy: những mảnh mô mềm mang tinh bột hoặc các bó tinh thể calci oxalat hình kim, mảnh bần, mảnh mạch điểm Sợi dài, ngắn, có thành dày, mỏng khác nhau đứng riêng lẻ hay xếp thành đám Hạt tinh bột đơn, kép đôi, kép ba, kích thước 0,02-0,04mm Tinh thể calci oxalat hình kim kích thước 0,07-0,lm m đứng riêng lẻ hoặc xếp thành bó (ảnh 8 trang 26)

2 5

- Dựa vào các đặc điểm hình thái, giải phẫu, đặc điểm vi học, đối chiếu với các đặc điểm được mô tả trong khoá phân loại thực vật, tra tìm và đối chiếu trong các tài liệu thuộc mục 3.2.2.4 với mục đích tìm những mẫu cây có những đặc điểm về hình thái gần giống cây thuốc nghiên cứu.

Tra cứu và đối chứng mẫu tại Phòng Sưu tập tài nguyên, Viện Dược liệu Trung ương, trong họ Cà phê có 94 chi gồm 366 mẫu Chúng tôi lưu ý tới 96 mẫu thuộc 4 chi có đặc điểm gần giống với mẫu nghiên cứu đó là:

- Có 11 mẫu cây thuộc chi Lasianthus

- Có 63 mẫu cây thuộc chi Morinda

- Có 22 mẫu cây thuộc chi Prychotria

- Chi Cephaelis không có mẫu

Tại Phòng Bảo tàng Thực vật, Bộ môn Thực vật, Khoa Sinh học Trường Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội, họ Cà phê được mang số 244 trong lô từ 161-169

có 83 chi Chúng tôi lưu ý tới 54 mẫu trong 4 chi sau:

- Có 3 mẫu cây thuộc chi Lasianthus

- Có 22 mẫu cây thuộc chi Morinda

- Có 26 mẫu cây thuộc chi Prychotria

- Có 3 mẫu cây thuộc chi Cephaelis

Tại Phòng Bảo tàng Thực vật, Viện Tài nguyên và sinh thái, họ Cà phê có

76 chi gồm 2837 mẫu Chúng tôi lưu ý tới 178 mẫu trong 4 chi sau:

- Có 24 mẫu cây thuộc chi Lasianthus

- Có 61 mẫu cây thuộc chi Morinda

- Có 95 mẫu cây thuộc chi Prychotria

- Có 8 mẫu cây thuộc chi Cephaelis

4.1.4 Xác định tên khoa học:

2 7

Sau khi tra cứu các tài liệu trong mục (3.2.2.4.), đối chiếu mẫu tại 3 phòng tiêu bản ở trên nhưng không thấy mẫu tiêu bản nào có đặc điểm hình thái giống với mẫu cây thuốc mà chúng tôi nghiên cứu.

Căn cứ vào các đặc điểm hình thái và các kết quả kiểm tra đối chiếu, mẫu cây mà chúng tôi nghiên cứu, đã được GS Vũ Văn Chuyên và PGS TS Khoa học Trần Công Khánh xác định tên khoa học của cây Nhó đông mọc ở Sơn La là Cephaelis sp Rubiaceae

4.2 Nghiên cứu về thành phần hoá học

4.2.1 Định tính các nhóm chất chính trong dược liệu

Chúng tôi tiến hành định tính các nhóm chất chính trong rễ, thân và lá cây Nhó đông theo phương pháp ghi trong các tài liệu [1], [2], [3], [18], [34], [35], [40]

42.1.1 Định tính anthranoỉd

+ Nguyên tắc của phản ứng: Dẫn chất 1,8 dihydro anthraxen khi tác dụng

+ Định tính dạng glycosid: lấy khoảng lg bột dược liệu cho vào ốngnghiệm dung tích 10ml, thêm 5ml nước cất Đun trực tiếp với nguồn nhiệt chođến sôi Lọc qua giấy lọc, lấy dịch lọc

Lấy lm l dịch lọc, thêm vào lm l NaOH 10%, lắc nhẹ, lớp nước có màu đỏsim

+ Định tính dạng tự do: lấy khoảng lg bột dược liệu cho vào ốngnghiệm dung tích 10ml, thêm 5ml nước cất, đun trực tiếp với nguồn nhiệt cho đến sôi,

lọc nóng qua lớp bông mỏng cho vào bình gạn dung tích 50ml, làm nuôi dịch lọc, them 5ml ether, lắc nhẹ, gạn lấy lớp ether.

Lấy lm l dịch chiết ether, thêm vào lm l NH4OH 10%, lóp nước có màu đỏsim

Lấy lm l dịch chiết ether, thêm vào lm l NaOH 10%, lắc nhẹ, lớp nước có màu đỏ sim

+ Định tính anthranoid toàn phần: Lấy khoảng lg dược liệu cho vào ống nghiệm dung tích 10ml thêm 5ml dung dịch acid HC1 0,1N, đun trực tiếp với nguồn nhiệt cho đến sôi đều Lọc nóng qua một lớp bông mỏng và cho vào bình gạn, làm nguội dịch lọc, thêm 5ml ether, lắc nhẹ, gạn lấy lớp ether Sau đó lấy

lm l dịch chiết thêm lm l NH4OH 10%, lắc nhẹ, lớp nước có màu đỏ sim

- Phản ứng vi thăng hoa

Đặt khoảng 1 g bột dược liệu trong một nắp chai bằng nhôm, hơ nhẹ trên nguồn nhiệt để bay hết hơi nước trong dược liệu Đặt lên nắp nhôm một lam kính, trên lam kính có để một miếng bông tẩm nước lạnh Sau đó 5-10 phút lấy lam kính để nguội, soi dưới kính hiển vi thấy từng đám tinh thể hình kim màu vàng nhạt

Kết quả: Rễ : (+); Thân: (+); Lá (+)

- Phản ứng vi hoá

+ Cắt một lát mỏng dược liệu (bằng lưỡi dao cạo), không tẩy rửa và không nhuộm kép, đặt lát cắt vào hộp petri có chứa hơi amoniac Soi dưới kính hiển vi, các tổ chức có màu nâu đỏ, chứng tỏ trong dược liệu có anthranoid

Kết quả: Rễ : (+); Thân: (+); Lá (+)

+ Sắc ký lớp mỏng:

2 9

Chuẩn bị bản mỏng: Cân lOg silicagel G của Viện Kiểm nghiệm cho vào cối sứ, thêm nước vừa đủ rồi nghiền kỹ thành hỗn dịch mịn Tráng lên kính có kích thước 5 X 15cm để khô tự nhiên, rồi hoạt hoá ở 110°c trong 1 giờ Để nguội

và bảo quản trong bình hút ẩm

Hoặc dùng bản mỏng tráng sẵn bằng thiếc của hãng Mecrk, hoạt hoá ở

1 1 0°c trong 1 giờ trước khi chấm mẫu thử

+ Chuẩn bị dịch chấm sắc ký: Lấy 10ml dịch chiết dược liệu trongmethanol cô cách thuỷ đến cạn Thêm 10ml nước cất, đun cách thuỷ 30 phút Lọc lấy dịch nưóc, cho vào bình gạn 50ml, chiết với lOml chloroform, cô dịch chloroform đến khô Hoà tan cắn với lm l methanol để chấm sắc ký

+ Tiến hành: Chấm dịch methanol trên bản mỏng Sấy nhẹ khoảng 5 phút cho khô Triển khai sắc ký bằng các hệ dung môi sau:

- Hệ I: Methanol: chloroform (1:7)

- Hệ II: Toluen: ethylacetat: acid formic (5:4: 1)

- Hệ III: Ethylacetat: n-propanol: nước (4: 4: 5)

- Hệ IV: Chloroform: methanol: ethanol (9: 1: 5)

- Hệ V: Ethylacetat: methanol: nước (25: 5: 2,5)

Sau khi triển khai lấy bản mỏng ra khỏi bình sắc ký, sấy nhẹ 10 phút cho bay hết hơi dung môi

- Quan sát dưới ánh sáng thường trước khi phun thuốc thử cũng có những vết màu rõ Sau khi hơ trên hơi amoniac đặc thì màu của các vết trên sắc ký trở nên rõ rệt hơn

- Quan sát khi soi dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254 và 366nm,

chúng tôi nhận thấy huỳnh quang sáng xanh ở bước sóng 366 rõ hơn còn ở bước

sóng 254nm thì màu tối hơn

Kết quả cho thấy anthraniod trong các mẫu dịch chiết rễ, thân, lá đều có các vết trên sắc ký đồ như nhau đối với từng hệ dung môi Chúng tôi nhận thấy hệ dung môi 1 có khả năng tách tốt nhất vì hệ này cho nhiều vết hơn và các vết cách

sắc ký đồ

31

sắc ký đồ 1 Sắc ký đồ 2 Sắc ký đồ 3 sắc ký đồ 4 Sắc ký đồ 5

Bảng 1 Kết quả định tính anthranoid trong dược liệu bằng sắc kỷ lớp mỏng.

84 Đỏ thẫm Đỏ thẫm 6 8 Vàng nâu Vàng nâu 64 Vàng

thẫm

Vàng thẫm

5 92 Đỏ gạch Đỏ vàng 8 8 Nâu đỏ Đỏ nâu

Vàng thẫm

4.2.1.2 Định tính alcaloỉd

Lấy lg bột dược liệu, cho vào bình nón dung tích 50ml, thêm 15ml dung dịch H7S 04 i n đun đến sôi, để nguội, lọc dịch lọc vào bình gạn dung tích 100ml Kiềm hoá bằng dung dịch amoniac 6N (khoảng 8ml) đến phản ứng kiềm, lắc nhẹ với chloroform 3 lần, mỗi lần 5ml và gộp dịch chiết lại, cho vào bình gạn đem lắc với H2S 04 10%, lắc 2-3 phút, gạn lấy lớp acid để làm các phản ứng sau

Cho vào 3 ống nghiệm, mỗi ống lm l dịch chiết acid rồi thêm vào:

- Ống 1: 2-3 giọt TT Mayer

- Ống 2: 2-3 giọt TT Dragendorff

- Ống 3: 2-3 giọt TT Bouchardat

K ết quả:

- Ống 1: không xuất hiện tủa vàng nhạt (-)

- Ống 2 : không xuất hiện tủa vàng nâu (-)

- Ống 3: không xuất hiện tủa vàng cam (-)

Điều này chứng tỏ trong rễ, thân, lá của mẫu thử không có alcaloid

4.2.1.3 Định tính flavonoid.

Cân lOg bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 100ml Thêm 50ml cồn, lắc đều, đun sôi lọc lấy dịch lọc và cô cách thuỷ còn khoảng 15ml Dịch này để làm các phản ứng sau:

- Phản ứng Cyanidin: Cho 2ml dịch chiết vào ống nghiệm, cho thêm một ít bột Mg và vài giọt HC1 đặc, để yên sau vài phút, màu của dung dịch sẽ thay đổi

từ vàng sang hồng hoặc màu da cam Làm như vậy với tất cả các dịch chiết rễ, thân, lá Kết quả thu được như sau:

- Phản ứng với dung dịch FeCl3 5%: Cho vào ống nghiêm lm l dịch chiết, thêm vào đó 2-3 giọt FeCl3 5% thấy dung dịch không có màu xanh thẫm Kết quả:

3 4

này dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 366nm không thấy có huỳnh quang màu