Ảnh hưởng của các loại dung môi khác nhau lên tính kháng khuẩn Streptococcus spp. của dịch chiết thảo dược và thử nghiệm khả năng trị bệnh lở loét do Streptococcus spp. trên cá trê lai

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH TRẦN THỊ LAM GIANG ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC LOẠI DUNG MÔI KHÁC NHAU LÊN TÍNH KHÁNG KHUẨN Streptococcus spp. CỦA DỊCH CHIẾT THẢO DƯỢC VÀ THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG TRỊ BỆNH LỞ LOÉT DO Streptococcus spp. TRÊN CÁ TRÊ LAI LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC NGHỆ AN - 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH TRẦN THỊ LAM GIANG ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC LOẠI DUNG MÔI KHÁC NHAU LÊN TÍNH KHÁNG KHUẨN Streptococcus spp. CỦA DỊCH CHIẾT THẢO DƯỢC VÀ THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG TRỊ BỆNH LỞ LOÉT DO Streptococcus spp. TRÊN CÁ TRÊ LAI Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.01.14 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS. TRẦN NGỌC HÙNG NGHỆ AN - 2014 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp này, ngoài sự cố gắng nỗ lực của bản thân, tôi còn nhận được sự giúp đỡ của nhiều tập thể và cá nhân. Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất đến tiến sỹ Trần Ngọc Hùng - Trường Cán bộ Quản lý Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn 1, Bộ Nông Nghiệp và Phát triển Nông thôn, là người đã định hướng và hướng dẫn nhiệt tình, chu đáo trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài tốt nghiệp. Đồng thời tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Trương Thị Thành Vinh, cô giáo Nguyễn Thị Kim Chung và các giáo viên phòng thí nghiệm khoa Nông Lâm Ngư đã tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành đề tài này. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban chủ nhiệm khoa cùng toàn thể các thầy cô giáo Khoa Sinh học, Phòng sau đại học, trường Đại học Vinh đã dạy dỗ, trang bị cho tôi nền tảng kiến thức và giúp đỡ tôi trong suốt những năm học qua. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới tất cả bạn bè, tập thể lớp K20 - Sinh học thực nghiệm những người đã luôn bên cạnh, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập. Cuối cùng với tất cả lòng biết ơn và kính trọng tôi xin gửi tới bố mẹ, các em và toàn thể đại gia đình đã chăm sóc, nuôi dạy và giành cho tôi những tình cảm tốt đẹp nhất! Vinh, tháng 10 năm 2014 Học viên Trần Thị Lam Giang i MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC HÌNH VẼ iv MỞ ĐẦU 1 1. Lý do chọn đề tài 1 2. Mục tiêu nghiên cứu 3 3. Nội dung nghiên cứu 3 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. Vài nét về đối tượng nghiên cứu 4 1.1.1. Cá trê lai 4 1.1.2. Vi khuẩn Streptococcus spp 6 1.1.3. Cây chó đẻ răng cưa Phyllanthus urinaria L 10 1.1.4. Tỏi Allium sativum L 13 1.2. Những hạn chế của việc sử dụng kháng sinh trong phòng, trị bệnh cho ĐVTS 15 1.3. Tình hình nghiên cứu và sử dụng thảo dược trong phòng, trị bệnh nhiễm khuẩn trên động vật thủy sản 17 1.3.1. Tình hình nghiên cứu sử dụng thảo dược trên thế giới 18 1.3.2. Tình hình nghiên cứu và sử dụng thảo dược trong nước 21 Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. 27 2.1. Đối tượng nghiên cứu 27 2.2. Vật liệu nghiên cứu 27 2.3. Phương pháp nghiên cứu 28 2.3.1. Phương pháp thu dịch chiết thảo dược 28 2.3.2. Phương pháp định lượng mật độ vi khuẩn 29 2.3.3. Phương pháp thử kháng sinh đồ 30 2.3.4. Phương pháp bố trí thí nghiệm 31 2.4. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 35 Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 36 3.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các loại dung môi đến khả năng kháng khuẩn của dịch chiết củ tỏi, lá cây chó đẻ răng cưa 36 3.2. Kết quả thử nghiệm khả năng trị bệnh của dịch chiết củ tỏi đối với vi khuẩn Streptococcus spp gây ra trên cá trê lai 46 KẾT LUẬN 54 CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN NỘI DUNG CỦA ĐỀ TÀI 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 PHỤ LỤC a ii Phụ lục 3 g NHẬT KÝ THÍ NGHIỆM g iii DANH MỤC HÌNH VẼ Trang Hình 1.1. Cá trê lai 4 Hình 1.2. Vi khuẩn Streptococcus spp 7 Hình 1.3. Cây Chó đẻ răng cưa 10 Hình 1.4. Củ tỏi 14 Hình 2.1. Sơ đồ khối nghiên cứu 28 Hình 2.2. Các bước pha loãng nồng độ vi khuẩn 29 Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1 31 Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2 32 Hình 2.5. Đường cấy vi khuẩn trên đĩa lồng 34 Bảng 3.1. Ảnh hưởng của các loại dung môi đến khả năng kháng khuẩn của dịch chiết thảo dược 36 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của các loại dung môi đến khả năng kháng khuẩn của dịch chiết củ tỏi 38 Hình 3.1. Ảnh hưởng của các loại dung môi đến khả năng kháng khuẩn của dịch chiết củ tỏi 39 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của các loại dung môi đến khả năng kháng khuẩn của dịch chiết lá cây chó đẻ răng cưa 41 Hình 3.2. Ảnh hưởng của các loại dung môi đến khả năng kháng khuẩn của dịch chiết lá chó đẻ răng cưa 42 Bảng 3.4. Nồng độ ức chế tối thiểu MIC của dịch chiết củ tỏi 44 Hình 3.3. Nồng độ ức chế tối thiểu MIC của dịch chiết củ tỏi 44 Bảng 3.5. Nồng độ ức chế tối thiểu MIC của dịch chiết lá chó đẻ răng cưa45 Hình 3.4. Nồng độ ức chế tối thiểu MIC của dịch chiết lá chó đẻ răng cưa46 Bảng 3.6. Diễn biến bệnh lý của cá sau khi tiêm cảm nhiễm Streptococcus spp 47 iv Hình 3.5. Tỷ lệ sống của cá của ở các công thức trong thí nghiệm trị bệnh48 Hình 3.6. Cá bị gan phù nề 49 Hình 3.7. Phân lập vi khuẩn ở gan, thận 50 Bảng 3.7. Kết quả phân lập vi khuẩn gây bệnh lở loét trên cá trê lai 50 v MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Cá trê lai (Clarias macrocephalus female x Clarias gariepinus male) là loài cá có giá trị kinh tế cao có tốc độ sinh trưởng nhanh, chất lượng thịt thơm ngon và được thị trường trong và ngoài nước chấp nhận. Do có những ưu điểm vượt trội, các trê lai dần trở thành đối tượng nuôi chủ yếu ở nước ta với sản lượng 80 - 100 tấn/ ha/ năm. Nhiều mô hình nuôi cá trê lai ở các tỉnh như Vĩnh Long, Kiên Giang, Ninh Thuận, Quảng Ngãi, Thừa Thiên Huế, Quảng Bình… đã đem lại lợi nhuận rất cao cho người nuôi, thu nhập hàng trăm triệu đồng mỗi năm. Có thể nói nghề nuôi cá trê lai thực sự đã đem lại cuộc sống ấm no cho người dân, đưa họ từng bước thoát nghèo và có cuộc sống ổn định [4]. Nhu cầu về cá trê lai tiếp tục tăng trên toàn thế giới với sản lượng ước đạt 3 triệu tấn trên toàn cầu trong năm 2010 so với 2,6 triệu trong năm 2007. Với doanh thu ước tính lên tới 5 tỉ USD vào năm 2010, ngành nuôi cá trê lai tăng trưởng liên tục với sự đa dạng hóa về sản phẩm [21]. Tuy nhiên, loài cá này rất mẫn cảm với nhiều tác nhân gây bệnh khác nhau trong ao nuôi như virus, vi khuẩn, nấm, kí sinh trùng. Trong đó, bệnh do vi khuẩn Streptococcus spp là tác nhân gây thiệt hại lớn trên các đối tượng cá nước ngọt đặc biệt là trên cá trê lai, ảnh hưởng đến hiệu quả kinh tế của ngành nuôi trồng thuỷ sản thế giới. Ước tính tổng thiệt hại bệnh do vi khuẩn gây ra hàng năm là khoảng 150 triệu USD [30]. Một trong những giải pháp để phòng trị các bệnh do vi khuẩn hiện nay là sử dụng các loại kháng sinh tổng hợp. Tuy nhiên hiện nay có nhiều nguyên nhân dẫn đến việc điều trị không hiệu quả đối với các bệnh nhiễm khuẩn trên động vật thủy sản như: các loại kháng sinh trước đây được sử dụng đặc trị bệnh nhiễm khuẩn trên các nước ngọt không còn hiệu quả do các dòng vi 1 khuẩn kháng thuốc ngày càng tăng, danh mục kháng sinh bị cấm sử dụng trong nuôi trồng thủy hải sản ngày càng nhiều…Mặt khác nếu sử dụng kháng sinh không đúng cách thì không những không chữa được bệnh cho đối tượng nuôi mà còn có thể ảnh hưởng xấu đến sức khỏe, môi trường sinh thái và tạo ra các dòng vi khuẩn kháng thuốc. Ngoài ra việc sử dụng kháng sinh trong điều trị bệnh động vật có thể để lại dư lượng trong sản phẩm sẽ gây hại cho người tiêu dùng và khả năng tiêu thụ sản phẩm. Trước tình hình đó việc nghiên cứu sử dụng các loại kháng sinh có nguồn gốc thảo dược trong phòng và trị bệnh nhiễm khuẩn cho các đối tượng động vật thủy sản được coi là một hướng đi mới, vừa đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm vừa thân thiện với môi trường. Hướng đi này đặc biệt phù hợp với nước ta vì Việt Nam là một trong những quốc gia có tiềm năng đa dạng sinh học cao, có nhiều loại thảo dược quí đã được ghi nhận là có tính kháng khuẩn và đã được ứng dụng vào việc chữa trị các bệnh nhiễm khuẩn trên người và một số loài động vật khác. Trong số các loại thảo dược nghiên cứu thì tỏi (Allium sativum L)và cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthus amarus Schum.et Thonn) là hai loài thảo dược có nhiều ưu điểm, đã được minh chứng có các hoạt chất kháng khuẩn và được sử dụng làm những bài thuốc chữa bệnh cho người. Một số đề tài đã nghiên cứu về khả năng kháng khuẩn của củ tỏi ở dạng dịch ép và dạng bột còn cây chó đẻ răng cưa thì chưa được nghiên cứu nhiều. Tuy nhiên, hầu như các nghiên cứu này chỉ mới dừng ở thử nghiệm tính kháng khuẩn của các loại thảo dược đó. Trên cơ sở đó, chúng tôi nghiên cứu đề tài “Ảnh hưởng của các loại dung môi khác nhau lên tính kháng khuẩn streptococcus spp. của dịch chiết thảo dược và thử nghiệm khả năng trị bệnh lở loét do streptococcus spp. trên cá trê lai”. 2 2. Mục tiêu nghiên cứu - Đánh giá được ảnh hưởng của các loại dung môi khác nhau lên tính kháng khuẩn streptococcus spp. - Đánh giá được khả năng trị bệnh lở loét do streptococcus spp. trên cá trê lai của dịch chiết thảo dược với loại dung môi tối ưu đã được lựa chọn. 3. Nội dung nghiên cứu Để đạt được các mục tiêu nghiên cứu trên, đề tài triển khai các nội dụng sau: - Nghiên cứu ảnh hưởng của các loại dung môi khác nhau đến khả năng kháng khuẩn của dịch chiết củ tỏi, lá cây chó đẻ răng cưa với vi khuẩn Streptococcus spp. - Thử nghiệm khả năng phòng trị bệnh lở loét do vi khuẩn Streptococcus spp gây ra trên cá trê lai (Clarias macrocephalus female x Clarias gariepinus male) của dịch chiết thảo dược. 3 [...]... khuẩn Streptococus spp Dịch chiết thảo dược với loại dung môi có khả năng kháng khuẩn cao nhất Kết luận Thử nghiệm khả năng trị bệnh lở loét do vi khuẩn Streptococus spp gây ra trên cá trê lai Hình 2.1 Sơ đồ khối nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp thu dịch chiết thảo dược + Đối với củ tỏi: Bóc vỏ lụa, lấy các ánh tỏi và nghiền trong các dung môi hữu cơ theo tỷ lệ 1:1 (1g tỏi: 1ml dung môi) , dịch này được bảo... nổi trội của cả 2 loài trên Tuy nhiên cá Trê lai sinh sản kém, không có hiệu quả trong sản xuất Chủ yếu chỉ sử dụng con lai F1 để làm cá thịt Gần đây đã có một số nghiên cứu bệnh lở loét trên cá bống bớp, cá rô phi, cá trắm cỏ Trên đối tượng cá trê lai cũng có một vài nghiên cứu sử dụng dịch ép củ tỏi, củ gừng, lá húng để trị bệnh lở loét do vi khuẩn Streptococcus spp gây ra [26] Thử nghiệm dịch ép... ổi và củ tỏi trong phòng trị bệnh do vi khuẩn Streptococcus spp trên cá Trê lai kết quả cho thấy Dịch ép lá ổi và dịch ép củ tỏi có khả năng phòng bệnh tốt đối với cá trê lai bị bệnh do vi khuẩn Streptococcus spp Sử dụng dịch ép lá ổi với liều lượng 300ml và 400 ml/kg thức ăn cho tỷ lệ sống đạt lần lượt là 83,33% và 86,67% Còn dịch ép củ tỏi với liều lượng 400ml/kg tỷ lệ sống đạt 73,3 % Sử dụng dịch. .. động chống oxy hóa của cá cũng tăng lên Nhìn chung, trên thế giới đã quan tâm tới vấn đề hiệu quả sử dụng thảo dược về khía cạnh kháng khuẩn trên các đối tượng thủy sản nhằm phòng và trị bệnh Tuy nhiên các kết quả nghiên cứu còn hạn chế ở quy mô phòng thí nghiệm, các sản phẩm ra đời trên thị trường từ các kết quả nghiên cứu hiện nay còn hạn chế 1.3.2 Tình hình nghiên cứu và sử dụng thảo dược trong nước... hậu môn của cá * Các dấu hiệu bên trong: Các dấu hiệu bên trong bệnh này có nhiều điểm tương đồng với bệnh nhiễm trùng máu của cá 9 - Cá bỏ ăn: Nhìn chung không có sự hiện diện của thức ăn khô trong dạ dày hoặc ruột của những con cá bị bệnh Tuy nhiên trong các ao nuôi cá thương phẩm khi cá bị bệnh ở giai đoạn đầu bệnh mới bùng phát cá vẫn có thể ăn bằng cách lọc thức ăn Khi ruột và dạ dày của cá trống... dụng chữa trị được nhiều căn bệnh như: các bệnh về tai, mũi, họng; bỏng nhiễm khuẩn và vết thương có mủ; dùng Tỏi để trị các loại giun; dùng nước ép Tỏi để trị viêm âm đạo trùng roi; chữa các bệnh về tim mạch [1] Theo kinh nghiệm của người dân, có thể dùng tỏi trộn vào thức ăn cho cá để trị bệnh viêm ruột ở cá Trắm cỏ 1.2 Những hạn chế của việc sử dụng kháng sinh trong phòng, trị bệnh cho ĐVTS Kháng sinh... Cồn, thuốc thử, thuốc nhuộm Gram - Môi trường nuôi cấy cơ bản NA (Nutrient Agar) - Dụng cụ lấy dịch chiết thảo dược: Máy xay, chai lọ, giấy lọc - Đĩa giấy tẩm nước ép thảo dược đường kính 6mm - Dao, kéo, panh, găng tay… - Thùng xốp, máy sục khí, dây sục khí, đá bọt 28 2.3 Phương pháp nghiên cứu Đánh giá ảnh hưởng của các loại dung môi đến khả năng kháng khuẩn của dịch chiết thảo dược với vi khuẩn Streptococus... khác Thuốc có tác dụng phòng và trị bệnh nhiễm khuẩn như đốm đỏ, thối mang, viêm ruột của cá nuôi lồng hay nuôi ao [12] Từ những nghiên cứu thử nghiệm thảo dược ở các dạng khác nhau, đã có một số loại thảo dược ứng dụng vào sản xuất và tiêu thụ trên thị trường, phục vụ nhu cầu phòng trị bệnh cho các đối tượng thủy sản điển hình như: 26 Thuốc KN-04-12 là sản phẩm phối chế của đề tài cấp nhà nước mã số... sử dụng dạng bột, dịch ép, dịch chiết hay hoạt chất của thảo dược với các nồng độ khác nhau Qua các kết quả nghiên cứu cho thấy một số thảo dược bước 18 đầu có tác dụng trong việc phòng trị bệnh cho vật nuôi hoặc giúp sinh ra kháng thể Bên cạnh đó, có nghiên cứu còn chứng minh được tính vô hại của thảo dược đối với môi trường Mặc dù còn hạn chế nhiều so với nghiên cứu trên người và gia súc nhưng cũng... sativum và Poligonum hidropiper là 3 loại thảo dược dùng để kháng khuẩn Kết quả cho thấy chúng có tác dụng phòng bệnh nhưng không gây ô nhiễm môi trường [36] * Sử dụng thảo dược dạng dịch chiết Các nhà khoa học người Trung Quốc và Ấn Độ đã hợp tác nghiên cứu về hiệu quả của 1 số thảo mộc đối với khả năng kháng lại virus đốm trắng trên tôm Sú (Penaeus monodon) Thí nghiệm được tiến hành như sau: Năm 20 loại . tài Ảnh hưởng của các loại dung môi khác nhau lên tính kháng khuẩn streptococcus spp. của dịch chiết thảo dược và thử nghiệm khả năng trị bệnh lở loét do streptococcus spp. trên cá trê lai . 2 2 được ảnh hưởng của các loại dung môi khác nhau lên tính kháng khuẩn streptococcus spp. - Đánh giá được khả năng trị bệnh lở loét do streptococcus spp. trên cá trê lai của dịch chiết thảo dược. các loại dung môi đến khả năng kháng khuẩn của dịch chiết thảo dược 36 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của các loại dung môi đến khả năng kháng khuẩn của dịch chiết củ tỏi 38 Hình 3.1. Ảnh hưởng của các loại