3. Nội dung nghiên cứu
3.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các loại dung môi đến khả năng kháng khuẩn
năng kháng khuẩn của dịch chiết củ tỏi, lá cây chó đẻ răng cưa
Để đánh giá ảnh hưởng của các loại dung môi nước, ethanol, methanol, chloroform lên khả năng kháng khuẩn của dịch chiết củ tỏi và lá cây chó đẻ răng cưa chúng tôi dựa trên đường kính vòng kháng khuẩn vi khuẩn
Streptococus spp của dịch chiết thảo dược với các loại dung môi khác nhau.
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của các loại dung môi đến khả năng kháng khuẩn của dịch chiết thảo dược
Thảo dược Dung môi Đường kính vòng kháng khuẩn (mm) Streptococcus spp Củ tỏi (Allium sativum) Nước 17,75±0,74a Ethanol 21,15±0,15b Methanol 20,12±0,31b Chloroform 18,78±0,25a
Lá cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthus amarus)
Nước 10,23±0,39a
Ethanol 15,55±0,21b
Methanol 16,23±0,3b
Chloroform 9,23 ±0,33a
(Các chữ mũ a, b, c trong cùng một cột biểu thị sự sai khác có ý nghĩa thống kê P < 0,05)
Qua kết quả bảng 3.1 cho thấy dịch chiết của 2 loại thảo dược là củ tỏi và lá cây chó đẻ răng cưa đều có khả năng kháng khuẩn đối với vi khuẩn và
Streptococcus spp khi chiết xuất bới các loại dung môi nước, Ethanol,
Methanol và Chloroform. Tuy nhiên mức độ kháng khuẩn là không giống nhau. Đường kính vòng kháng khuẩn (mm) vi khuẩn Streptococcus spp thu được thấp nhất khi sử dụng dịch chiết lá cây chó đẻ răng cưa với dung môi là Chloroform, đường kính vòng kháng khuẩn đạt 9,23 (mm). Cao nhất khi sử dụng dịch chiết củ tỏi với dung môi Ethanol với đường kính vòng kháng khuẩn đạt 21,15 (mm).
So sánh giữa hai loại thảo dược với nhau chúng ta nhận thấy khi sử dụng củ tỏi trong dịch chiết sẽ cho đường kính vòng kháng khuẩn trong khoảng 17,75 mm đến 21,15 mm lớn hơn khi sử dụng lá cây chó đẻ răng cưa đường kính vòng kháng khuẩn đạt từ 9,23 mm đến 16,23 mm. Điều này được giải thích do trong tỏi có nhiều hoạt chất có tính kháng khuẩn. Trong tỏi tươi có chất allicin, nhờ tác dụng của men allinaza chuyển hóa aliin có sẵn trong tỏi thành allicin, là chất chủ yếu gây tác dụng đối với vi khuẩn. Allicin là chất kháng sinh tự nhiên có tác dụng mạnh hơn cả penicillin. Nước tỏi pha loãng 125.000 lần vẫn có dấu hiệu ức chế nhiều loại vi khuẩn gram âm và gram dương như: Staphylococcus, Streptococcus, samonella, V. cholerae, B. dysenteriae, Mycobacterium tuberculosis. Tỏi cũng ức chế sự phát triển của nhiều loại siêu vi như bại liệt, cúm và một số loại nấm gây bệnh ở da hoặc bộ phận sinh dục nữ như candida. Trong Tỏi còn có liallyl sulfide, chất này tuy không mạnh bằng allicin nhưng có thể tồn tại lâu hơn và giữ nguyên được dược tính khi nấu [13] đã ngoài ra trong tỏi có một chất gọi là allistalin, có tính chất giống như allicin; Machado (1948) cũng chiết xuất từ Tỏi chất garcin, nó là một chất kháng khuẩn màu vàng, không có mùi lưu huỳnh, không độc, có tác dụng đến cả vi khuẩn Gram (-) và Gram (+). Garcin có thể dễ dàng hấp thu qua thành ruột và có thể đi tới dịch não tủy, đã ứng dụng có kết quả trong nhiễm khuẩn Shigella hoặc d o các bệnh ký sinh trùng như giun kim, giun đũa và giun tóc. Các nhà khoa học Mỹ đã tìm thấy chất prostagladin
A trong nước Tỏi có khả năng hạn chế bệnh nhồi máu cơ tim, hạ huyết áp, phòng bệnh xơ vữa động mạch. Theo kinh nghiệm của người dân, có thể dùng tỏi trộn vào thức ăn cho cá để trị bệnh viêm ruột ở cá Trắm cỏ.
Năm 1858, nhà bác học Pháp Louis Pasteur đã chứng minh được công dụng diệt vi khuẩn của tỏi. Năm 1944, nhà hóa học Chester J. Cavallito đã phân tích được hợp chất allicin trong tỏi có công dụng như thuốc kháng sinh. Allicin chỉ có trong tỏi chưa nấu hay chế hóa. Kháng sinh này mạnh bằng 1/5 thuốc penicillin, 1/10 thuốc tetraciline, có tác dụng trên nhiều loại vi khuẩn, xua đuổi hoặc tiêu diệt nhiều sâu bọ, ký sinh trùng, nấm độc. Năm 1948, Marchado cùng cộng sự đã chiết xuất từ tỏi được garcilin, chất này không có mùi lưu huỳnh, không độc, ứng dụng tốt trong bệnh nhiễm trùng Shigella,
Salmonella hoặc các bệnh ký sinh trùng như giun kim, giun đũa, giun tóc. Một số nghiên cứu về dịch chiết củ tỏi trong phòng trị bệnh ở thủy hải sản như: Lê Văn Yến (2006) đã dung dịch chiết củ tỏi, lá trầu không, cây chó đẻ răng cưa, lá muống trâu để trị bệnh đốm vỏ, bệnh đen mang trên cua biển, kết quả cho thấy các dịch chiết đều có hiệu quả, đặc biệt dịch chiết từ tỏi. Nguyễn Thị Ni (2010) đã nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của dịch chiết củ tỏi đối với vi khuẩn gây bệnh trên tôm sú là Vibrio sp. kết quả cho thấy vi khuẩn có tính mẫn cảm cao với đường kính vô khuẩn đạt 26,67 ± 0,58 mm.
Như vậy tính kháng khuẩn của củ tỏi đã được chứng minh và sử dụng để trị bệnh do vi khuẩn gây ra trong nhiều nghiên cứu. Trong nghiên cứu của chúng tôi kết quả cho thấy dịch chiết củ tỏi với các loại dung môi cũng có tính kháng khuẩn vi khuẩn Streptococcus spp mạnh hơn dịch chiết của lá cây chó đẻ răng cưa với các loại dung môi.
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của các loại dung môi đến khả năng kháng khuẩn của dịch chiết củ tỏi
Thảo dược Dung môi
Đường kính vòng kháng khuẩn (mm)
Streptococcus spp
Mức kháng khuẩn (theo tiêu chuẩn Bauer - Kirby, 1997) Củ tỏi (Allium sativum) Nước 17,75±0,74a Trung bình Ethanol 21,15±0,15b Cao Methanol 20,12±0,31b Cao Chloroform 18,78±0,25a Trung bình
(Các chữ mũ a, b, c trong cùng một cột biểu thị sự sai khác có ý nghĩa thống kê P < 0,05)
Hình 3.1. Ảnh hưởng của các loại dung môi đến khả năng
kháng khuẩn của dịch chiết củ tỏi
Qua bảng 3.2 và đồ thị 3.1 ta thấy dịch chiết củ tỏi, sử dụng dung môi ethanol và methanol cho đường kính vòng kháng vi khuẩn Streptococcus spp
Chloroform đường kính vòng kháng khuẩn chỉ đạt trung bình, lần lượt là 17,75 mm; 18,78 mm. Phân tích Anova và kiểm định LSD cho thấy có sự sai khác có ý nghĩa thống kê giữa dung môi Ethanol, Methanol với dung môi nước, Chloroform với P<0,05, sai khác không có ý nghĩa thống kê giữa Ethanol và Methanol, nước và Chloroform, với P>0,05.
Gần đây Trần Ngọc Hùng, Trương Thị Thành Vinh đã tiến hành nghiên cứu sử dụng dịch ép củ tỏi (Allium sativum L) trong phòng trị bệnh do vi khuẩn Streptococcus spp gây ra trên cá trắm cỏ (Ctenopharyngodon idellus). Kết quả thử nghiệm cho thấy dịch ép nguyên chất của củ tỏi (Allium sativum
L) có tính kháng khuẩn đối với vi khuẩn Streptococcus spp và giảm dần ở các mức pha loãng, trong đó kháng khuẩn tốt ở nồng độ 100% với đường kính vòng vô khuẩn đạt 20,75 mm, kháng khuẩn trung bình ở các mức pha loãng 50%; 25%; 12,5% với đường kính vòng vô khuẩn lần lượt đạt 17,13; 12,06; 11,13 mm. Nghiên cứu về tác dụng kháng khuẩn của bột củ tỏi và bột củ gừng trong điều trị bệnh lở loét cho cá bống bớp kết quả cho thấy cả bột tỏi và bột gừng đều có khả năng kháng vi khuẩn Vibrioculnificus. Oqr tỷ lệ pha 1g bột tỏi: 1ml nước cất cho khả năng kháng khuẩn cao nhất (đường kính vòng vô khuẩn là 22,80 mm)[9].
Năm 2013, nhóm tác giả trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội đã thử nghiệm dung môi Ethanol, Methanol chiết xuất dịch tỏi và xác định khả năng kháng khuẩn với E.coli O44 kết quả cho thấy đường kính vòng vô khuẩn đạt lần lượt 19,1 mm và 19,7mm, sai khác không có ý nghĩa thống kê với P>0,05 [10]. Thử nghiệm dịch chiết các giống tỏi tía, tỏi gié, tỏi trắng trung quốc bằng dung môi nước cho thấy khả năng kháng E.coli kém, với đường kính vòng kháng khuẩn chỉ đạt từ 9,2 mm đến 11,3 mm [25]. Sở dĩ có sự khác nhau này là vì trong tỏi, thiosulfide và sulfur tổng số là chỉ tiêu đánh giá chất lượng kháng khuẩn (Yukihiro Kodera và cộng sự, 1995, trích từ [37]). Mà các
thiosulfinate hòa tan mạnh trong các dung môi ethanol, methanol cho nên khi sử dụng hai loại dung môi này dịch chiết tỏi sẽ có được hoạt tính kháng sinh mạnh hơn so với dung môi nước và chloroform [37]. Điều này cũng lý giải tại sao dân gian hay sử dụng tỏi ngâm rượu để tạo thành loại thuốc uống tăng sức đề kháng, chống các bệnh cảm cúm.
Trong kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng cho thấy dịch chiết củ tỏi với dung môi ethanol và methanol có khả năng kháng khuẩn mạnh hơn dịch chiết củ tỏi với nước và chloroform. Như vậy Ethanol và Methanol đã có khả năng kích hoạt được hoạt lực của củ tỏi làm tăng khả năng kháng khuẩn của nó đối với vi khuẩn Streptococcus spp thuộc nhóm gram dương.
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của các loại dung môi đến khả năng kháng khuẩn của dịch chiết lá cây chó đẻ răng
cưa
Thảo dược Dung môi Đường kính vòng kháng khuẩn (mm) Streptococcus spp
Lá cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthus amarus)
Nước 10,23±0,39a
Ethanol 15,55±0,21b
Methanol 16,23±0,3b
Chloroform 9,23 ±0,33a
(Các chữ mũ a, b, c trong cùng một cột biểu thị sự sai khác có ý nghĩa thống kê P < 0,05)
Hình 3.2. Ảnh hưởng của các loại dung môi đến khả năng
kháng khuẩn của dịch chiết lá chó đẻ răng cưa
Đối với dịch chiết lá chó đẻ răng cưa, khi sử dụng cả 4 loại dung môi tách chiết thì đều có khả năng kháng khuẩn với vi khuẩn Streptococcus spp. Khi dùng dung môi Ethanol và Methanol, đường kính vòng kháng vi khuẩn
Streptococcus spp lần lượt là 15,55 mm, 16,23mm. Còn với các dung môi nước và Chloroform khả năng kháng khuẩn kém với đường kính vòng kháng khuẩn dao động từ 9,23 mm đến 11,05 mm. Phân tích Anova và kiểm định LSD cho thấy có sự sai khái có ý nghĩa thống kê P <0,05 giữa dịch chiết lá chó đẻ răng cưa bằng dung môi Ethanol, Methanol với các dung môi còn lại.
Cũng đã có một số nghiên cứu về tính kháng khuẩn của cây Chó đẻ răng cưa khi sử dụng dưới dạng dịch ép nguyên chất. Nghiên cứu của Huỳnh Kim Diệu và Lý Thị Loan Em đánh giá đặc tính thuần chủng và hoạt tính kháng khuẩn của dịch ép cây Chó đẻ răng cưa thu từ vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long kết quả cho thấy loại thảo dược này chỉ kháng khuẩn kém đối với
dịch chiết lá Chó đẻ răng cưa bằng Ethanol và Methanol thì hiệu quả kháng khuẩn tốt hơn so với dạng dịch ép và dạng bột. Theo nghiên cứu của Biller, 1994 dùng dung môi Ethanol và Methanol chiết xuất dịch chiết lá cây cỏ lào (Chromolaena odorata) thì hiệu quả kháng khuẩn đạt rất tốt. Nguyên nhân là do chúng đã tác động đến thành phần alkaloid của lá cỏ lào làm tăng hoạt tính kháng khuẩn [33]. Như vậy, rõ ràng Ethanol và Methanol cũng đã kích hoạt được thành phần alkaloid có trong lá Chó đẻ răng cưa. Điều này lý giải tại sao khả năng kháng khuẩn của dịch chiết với 2 loại dung môi này lại tốt hơn so với dung môi nước và Chloroform.
Như vậy, thử nghiệm ban đầu với 4 loại dung môi khác nhau để chiết xuất dịch chiết củ tỏi và lá cây Chó đẻ răng cưa thì chỉ có Ethanol và Methanol cho hiệu quả kháng khuẩn cao hơn so với nước và Chloroform. Theo Sukanya và cộng sự, 2009 hầu hết các thành phần có hoạt tính kháng khuẩn trong các loại thảo dược là những hợp chất hữu cơ thơm hoặc bão hòa, dễ tan trong Ethanol và Methanol. Do đó 2 loại dung môi này có tác dụng kích hoạt thiosulfide và sulfur tổng số trong tỏi và alkaloid trong lá chó đẻ răng cưa làm tăng khả năng kháng khuẩn của chúng.
Đặc biệt là trong kết quả nghiên cứu của chúng tôi dịch chiết của củ tỏi và lá cây Chó đẻ răng cưa khi được chiết xuất bởi các dung môi ethanol, methanol, nước và chloroform đều cao hơn rất nhiều so với kháng sinh Bt SMX/TMP (8,12mm), là một loại kháng sinh dùng khá phổ biến trong trị các bệnh nhiễm khuẩn trên các đối tượng động vật Thủy sản, sự sai khác này có ý nghĩa thống kê với p<0.05. Điều này mở ra hi vọng cho việc có thể thay thế hoàn toàn việc sử dụng thuốc kháng sinh để chữa bệnh cho thủy sản bằng các loại thảo dược thông thường như tỏi, Chó đẻ răng cưa.
* Kết quả nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của dịch chiết thảo dược đối với vi khuẩn và Streptococus spp.
Từ kết quả nghiên cứu nội dung ảnh hưởng của các loại dung môi khác nhau lên tính kháng khuẩn streptococcus spp chúng tôi tiến hành thí nghiệm xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của dịch chiết củ tỏi và lá cây Chó đẻ răng cưa đối với vi khuẩn nghiên cứu.
Bảng 3.4. Nồng độ ức chế tối thiểu MIC của dịch chiết củ tỏi
Thảo dược Dung môi
Nồng độ ức chế tối thiểu - MIC (µg/ml) Streptococcus spp Củ tỏi (Allium sativum) Nước 128 Ethanol 64 Methanol 64 Chloroform 512
Hình 3.3. Nồng độ ức chế tối thiểu MIC của dịch chiết củ tỏi
Kết quả nghiên cứu cho thấy dịch chiết củ tỏi với các loại dung môi khác nhau có hoạt tính kháng khuẩn không giống nhau, tác động mạnh nhất là với dung môi Ethanol và Methanol với nồng độ ức chế vi khuẩn
Streptococcus spp là 64 µg/ml, kế đến là dung môi nước với MIC là 128 µg/ml, tác động yếu khi chiết xuất với dung môi Chloroform với MIC lần lượt là 512 µg/ml.
Bảng 3.5. Nồng độ ức chế tối thiểu MIC của dịch chiết lá chó đẻ răng cưa
Thảo dược Dung môi Nồng độ ức chế tối thiểu - MIC (µg/ml) Streptococcus spp Lá cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthus amarus) Nước 4096 Ethanol 1024 Methanol 1024 Chloroform 4096
Hình 3.4. Nồng độ ức chế tối thiểu MIC của dịch chiết lá chó đẻ răng cưa
Dịch chiết lá chó đẻ răng cưa với dung môi Methanol và Ethanol có hoạt tính kháng khuẩn trung bình với MIC là 1024 µg/ml, các dung môi còn lại có mức kháng khuẩn yếu với MIC 4096 µg/ml. Nghiên cứu của Huỳnh Kim Diệu và Lý Thị Loan Em về khả năng kháng khuẩn của dịch ép lá chó đẻ răng cưa cho thấy nó tác động rất mạnh trên Edwardsiella tarda (MIC = 64- 512 μg/ml), kế đến Aeromonas hydrophila (MIC=512-1024 μg/ml) và tác động yếu trên Streptococcus faecalis và E. Coli (MIC= 2048- 4096 μg/ml). Như vậy, khả năng tác động của dịch chiết lá Chó đẻ răng cưa đối với vi khuẩn Streptococcus spp cũng tương đương với dạng dịch ép với vi khuẩn
Streptococcus faecalis và E. Coli.