3. Nội dung nghiên cứu
2.3.4. Phương pháp bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm 1:
Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1
Nghiên cứu ảnh hưởng của các loại dung môi gồm nước, ethanol, methanol, chloroform đến khả năng kháng khuẩn của dịch chiết củ tỏi, lá cây chó đẻ răng cưa với vi khuẩn Streptococcus spp.
Khả năng kháng vi khuẩn Streptococcus spp được ghi nhận bằng đường kính vòng vô khuẩn của các đĩa giấy tẩm dịch ép bằng phương pháp thử kháng sinh đồ của Bauer - Kirby, 1997.
Các thao tác được thực hiện trong tủ cấy vô trùng. Khi mật độ vi khuẩn đạt 106 tế bào/ml, lắc đều bình chứa vi khuẩn, dùng pipet man hút 0,1ml canh khuẩn nhỏ vào giữa đĩa thạch, dùng que thủy tinh tráng đều cho đến khi mặt
Ethanol Methanol Nước Chlorofom Ethanol Methanol Nước Chlorofom
Củ tỏi Lá chó đẻ răng cưa
Vi khuẩn Streptococcus spp. Vi khuẩn Streptococcus spp.
Kết luận:
- Ảnh hưởng của các loại dung môi đến khả năng kháng khuẩn của dịch chiết
- Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của dịch chiết thảo dược
thạch khô. Sau 15 phút đặt các khoanh giấy với đường kính 6mm có tẩm đến no dịch chiết của các loại thảo dược, các khoanh giấy đặt cách nhau khoảng 20 mm. Sau đó để vào tủ ấm ở 37oC/24h đọc kết quả bằng cách đo đường kính vòng vô khuẩn, rồi tính số bình quân.
Xác định nồng độ ức chế tổi thiểu (MIC) của dịch chiết các loại thảo dược đến vi khuẩn Streptococcus spp. Theo phương pháp của Trương Công Quyền và cộng sự, 1986; Từ Minh Koong và cộng sự, (2001)
Thí nghiệm 2:
Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2
CT1
(Cảm nhiễm vi khuẩn cho cá với mật độ 106-108 )CFU/ml)
)
CT2
(Cảm nhiễm vi khuẩn cho cá với mật độ 106-108 CFU/ml)
Cho ăn thức ăn thường
- Theo dõi dấu hiệu bệnh lý - Theo dõi tỷ lệ nhiễm bệnh - Theo dõi tỷ lệ chết
Thu con cá bệnh phẩm tái phân lâp vi khuẩn
Kết luận Cá khỏe được nuôi
thuần 7 ngày
Cho ăn thức ăn bổ sung dịch chiết củ tỏi
Tiến hành thí nghiệm:
Chúng tôi tiến hành thực hiện thí nghiệm để thử khả năng trị bệnh của dịch chiết củ tỏi đối với cá trê lai do vi khuẩn Streptococcus spp gây ra như sau: Cá trê lai được đem về và nuôi thuần trong vòng 7 ngày. Mỗi bể gồm 30 cá thể. Trước khi tiến hành thí nghiệm ta kiểm tra đảm bảo cá không bị bệnh. Trong quá trình làm thí nghiệm thì tất cả các bể thí nghiệm và bể đối chứng đều được theo dõi các biểu hiện bất thường và được ghi chép đầy đủ.
- Sau thời gian nuôi thuần thì ta tiến hành cảm nhiễm cho cả 2 lô thí nghiệm: gây mê cho cá (ngâm trong nước 100C trong 1 phút), tiêm 0,1ml dung dịch vi khuẩn mật độ 106 - 108CFU/ml vào cơ lưng cá. - Sau khi cảm nhiễm ta tiến hành cho cá ở NT 1 ăn thức ăn có thảo dược và theo dõi tình trạng cá (6h/1lần). Lượng thảo dược có trong thức ăn được chọn là liều lượng tốt nhất ở thí nghiệm1 xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC). Còn cá ở NT 2 ta cho ăn thức ăn không có thảo dược.
- Tiếp tục theo dõi (6h/1 lần) và so sánh biểu hiện bệnh lý và tỷ lệ sống giữa các bể. Từ đó rút ra kết luận về tác dụng trị bệnh của củ tỏi.
Công thức tính: +. Tỷ lệ sống (%) 100 N Nt (%)= × TLS Trong đó: TLS = Tỷ lệ sống
Nt = Số lượng cá còn sống từ đầu kỳ đến thời điểm đánh giá N = Số lượng cá đưa vào nuôi đầu kỳ thí nghiệm
+. Tỷ lệ cá nhiễm bệnh:
CNB
(%) 100
TSC
Trong đó: TLNB = Tỷ lệ nhiễm bệnh CNB = Số lượng cá nhiễm bệnh TSC = Số lượng cá kiểm tra
Các số liệu được phân tích và xử lí bằng phần mềm EXCELL và SPSS 16.0 bằng phép kiểm định LSD.
- Sau quá trình theo dõi thu con cá bệnh phẩm và phân lập lại để xác nhận tác nhân gây bệnh chính cho đối tượng theo phương pháp.
* Phương pháp nuôi cấy, phân lập và định danh vi khuẩn
Tiến hành theo phương pháp nghiên cứu vi khuẩn ở cá và động vật thuỷ sản của Millar và Frerichs (1993).
- Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn
Cấy chọn khuẩn lạc: Phương pháp thường dùng là cấy ria, mục đích làm cho khuẩn lạc đứng riêng rẽ. Ta tiến hành đốt nóng đỏ que cấy sau mỗi vùng cấy để làm cho mật độ vi khuẩn giảm dần, mỗi tế bào vi khuẩn đứng riêng rẽ sẽ phát triển thành một khuẩn lạc sau khi nuôi cấy.
Hình 2.5. Đường cấy vi khuẩn trên đĩa lồng
Bệnh phẩm được nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ 290C, sau 24 - 48h chọn khuẩn lạc, cấy tăng sinh nhằm tăng lượng vi khuẩn lên.
* Phương pháp nhuộm Gram xác định hình thái vi khuẩn
Sau khi nuôi cấy tăng sinh giống vi khuẩn thuần, lấy mẫu phết lên lam kính, cho thêm 1 đến 2 giọt nước muối sinh lý vô trùng, dùng đầu que cấy dàn mỏng lên lam kính. ( 1 ) ( 2 ) ( 3 ) ( 4 )
+ Để mẫu khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng hoặc hơ cao lam kính trên ngọn lửa đèn cồn để cố định và diệt vi khuẩn
+ Nhỏ tiếp dung dịch 1 (tím tinh thể) lên tiêu bản, để yên 30 - 60 giây
Rửa nước nhanh, vẩy khô.
+ Nhỏ dung dịch 2 (Lugol) để cố định trong 1 phút Rửa nước nhanh, vẩy khô.
+ Nhỏ dung dịch 3 (Alcohol) để nghiêng đầu một bên lam để cồn chảy qua chỗ phết vi khuẩn, nhằm tẩy màu Rửa nước nhanh, vẩy khô.
+ Nhỏ dung dịch 4 (Safranin) để cố định 1 đến 2 phút Rửa nước, để khô hoặc dùng giấy thấm khô lam kính
+ Soi dưới kính hiển vi bằng vật kính dầu (độ phóng đại x1000). Dưới kính hiển vi ta có thể xác định được vi khuẩn gram âm bắt màu hồng và gram dương bắt màu xanh tím.
* Phương pháp định danh vi khuẩn
Dùng phương pháp thử phản ứng sinh hóa, thử khả năng sinh enzym catalase: Phết vi khuẩn lên lam kính sạch rồi nhỏ H2O2 30%, quan sát sau 1 - 2 giây. Thử nghiệm là (+) với những vi khuẩn hiếu khí, khi có hiện tượng sủi bọt khí do O2. Streptococcus spp là vi khuẩn kị khí tùy tiện, có hệ enzym catalase thủy phân H2O2 thành H2O và O2.
Dựa vào kết quả nuôi cấy phân lập, nhuộm vi khuẩn kết hợp với kết quả thực hiện các phản ứng sinh hóa để định danh vi khuẩn theo khoá phân lập của Bergey (1957), Nicky Buller (2004) và Nguyễn Lân Dũng (2006).