Hợp tác nghiên cứu xây dựng qui trình tạo khối sâm Ngọc Linh làm nguyên liệu sản xuất chế phẩm phục vụ sức khoẻ cộng đồng

BỘ KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ HỌC VIỆN QUÂN Y BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU HỢP TÁC NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUI TRÌNH TẠO KHỐI TẾ BÀO SÂM NGỌC LINH LÀM NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM PHỤC VỤ SỨC KHỎE CỘNG ĐỒNG CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI HỌC VIỆN QUÂN Y PGS,TS Nguyễn Văn Minh Đại tá, GS.TS Hoàng Văn Lương HÀ NỘI - 2009 CÁC CÁ NHÂN VÀ ĐƠN VỊ THAM GIA NGHIÊN CỨU I CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: PGS.TS Nguyễn Văn Minh II CỘNG TÁC VIÊN CHÍNH: GS.TS Sang Yo Byun GS.TS Lê Bách Quang GS.TS Hoàng Văn Lương PGS.TS Nguyễn Tùng Linh TS Lê Văn Đông TS Nguyễn Văn Long TS Vũ Bình Dương BS Nguyễn Hồng Ngân ThS Đào Văn Đơn 10 DS Chử Văn Mến 11 ThS Nguyễn Trọng Điệp 12 DS Nguyễn Văn Thư 13 ThS Nguyễn Văn Dự 14 ThS Chu Đức Thành III CÁC ĐƠN VỊ PHỐI HỢP NGHIÊN CỨU: Trường Đại học Ajou – Hàn Quốc Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương Viện Dược liệu Trung tâm NCƯD Sinh – Y – Dược học – HVQY Trung tâm Đào tạo, nghiên cứu Dược – HVQY Bộ môn khoa Giải phẫu bệnh lý – Bệnh viên 103 – HVQY MỤC LỤC Trang MỤC LỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH, BIỂU ĐỒ, SƠ ĐỒ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 CÔNG NGHỆ SINH KHỐI TẾ BÀO THỰC VẬT 1.1.1 Khái niệm 1.1.2 Ưu nhược điểm công nghệ sinh khối tế bào thực vật 1.1.3 Qui trình lý thuyết tạo sinh khối tế bào thực vật 1.1.4 Yếu tố ảnh hưởng tới phát triển tế bào, hàm lượng hoạt chất 1.1.5 Thành tựu cơng nghệ sinh khối tế bào 13 1.1.6 Tình hình ứng dụng công nghệ sinh khối tế bào thực vật cho loài sâm 16 1.2 17 SÂM NGỌC LINH 1.2.1 Đặc điểm thực vật 17 1.2.2 Thành phần hóa học 18 1.2.3 Tác dụng dược lý 19 1.2.4 Nuôi trồng 20 CHƯƠNG NGUYÊN VẬT LIỆU, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 22 2.1.1 Nguyên liệu 22 2.1.2 Hóa chất 22 2.1.3 Các thiết bị nghiên cứu 22 2.1.4 Động vật thí nghiệm 24 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.2.1 Phương pháp tạo sinh khối tế bào rễ sâm Ngọc Linh 24 2.2.2 Phương pháp kiểm nghiệm, xây dựng tiêu chuẩn sở 32 2.2.3 Phương pháp đánh giá tính an tồn tác dụng sinh học 41 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 66 3.1 XÂY DỰNG QUI TRÌNH TẠO KHỐI TẾ BÀO SÂM NGỌC LINH 66 3.1.1 Nuôi cấy tạo callus 66 3.1.2 Phương pháp trì ni cấy callus mơi trường thạch 69 3.1.3 Kết nuôi cấy môi trường lỏng 73 3.1.4 Kết tối ưu hóa mơi trường ni cấy 78 3.1.5 Kết lựa chọn chất làm tăng hoạt chất (elicitor) 83 3.1.6 Nuôi cấy hệ thống bioreacotor 87 3.1.7 Kết xây dựng qui trình thu hoạch sâm Ngọc Linh sinh khối 88 3.1.8 Kết nghiên cứu bào chế cao đặc (5 :1) từ sâm Ngọc Linh sinh khối 92 3.2 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VÀ TIÊU CHUẨN CƠ SỞ 94 3.2.1 Kết kiểm tra hàm lượng chất tồn dư 1-NAA 94 3.2.2 Kết xác định thành phần hoạt chất sâm Ngọc Linh sinh khối 96 3.2.3 Kết xây dựng tiêu chuẩn sở 101 3.3 TÍNH AN TỒN VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG CỦA SÂM NGỌC LINH SINH KHỐI 122 3.3.1 Kết đánh giá tính an tồn sâm Ngọc Linh sinh khối 122 3.3.2 Một số tác dụng dược lý sâm Ngọc Linh sinh khối 137 KẾT LUẬN 166 KIẾN NGHỊ 169 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG ĐỀ TÀI BC CNT CCT DĐVN Hb HC HST HVQY LD50 NMSL MDA POL SD SLVK SK SKTB SGOT SGPT SNL TLCT TKTW TCCS TC VK Bạch cầu Chuột nhắt trắng Chuột cống trắng Dược điển Việt Nam Hemoglobin Hồng cầu Huyết sắc tố Học viện Quân y Liều chết 50% động vật thí nghiệm Nước muối sinh lý Acid Malonyl Dialdehyd Peroxid hóa lipid Độ lệch chuẩn (standard deviation) Số lượng vi khuẩn Sinh khối SKTB Serum glutamo-oxalo transaminase Serum glutamo-pyruvic transaminase Sâm Ngọc Linh Trọng lượng thể Thần kinh trung ương Tiêu chuẩn sở Tiểu cầu Vi khuẩn DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 2.1 Ký hiệu mức biến đầu vào 29 2.2 Ký hiệu mức yêu cầu biến đầu 30 2.3 Chương trình pha động 36 2.4 Sơ đồ chuẩn bị giếng đo xác định hoạt độ SOD 57 2.5 Sơ đồ phản ứng xác định GPx 59 2.6 Sơ đồ phản ứng xác định TAS 61 3.1 Kết tạo thành callus sau 35 ngày nuôi cấy 66 3.2 Khối lượng callus môi trường khác 67 3.3 Tốc độ tăng trưởng callus sâm theo thời gian 67 3.4 Ảnh hưởng chất điều tiết sinh trưởng đến hình thành callus 68 3.5 Đặc tính tế bào sau lần cấy chuyển 69 3.6 Ảnh hưởng nồng độ NAA đến tốc độ phát triển tế bào 71 3.7 Ảnh hưởng pH môi trường tới sinh trưởng tế bào sâm 72 3.8 Ảnh hưởng nhiệt độ phịng ni cấy đến tốc độ phát triển tế bào 73 3.9 Tốc độ phát triển tế bào sâm Ngọc Linh môi trường lỏng 74 3.10 Tốc độ phát triển tế bào sau lần cấy chuyển 75 3.11 Ảnh hưởng pH môi trường 76 3.12 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy 77 3.13 Ảnh hưởng chất điều tiết sinh trưởng 77 3.14 Kết nuôi cấy tế bào sâm theo thiết kế phần mềm 79 3.15 Ảnh hưởng biến đầu vào với biến đầu 80 3.16 Kết nuôi cấy tế bào SNL môi trường tối ưu 83 3.17 Kết lựa chọn loại elicitor 84 3.18 Kết lựa chọn nồng độ acid jasmonic 85 3.19 Thời điểm tiếp xúc với elicitor 86 3.20 Kết lựa chọn thời gian tiếp xúc elicitor với tế bào 86 3.21 Kết nuôi cấy hệ thống Bioreactor 5lit 87 3.22 Kết nuôi cấy hệ thống Bioreactor 15 lit 88 3.23 Hàm lượng 1-NAA tồn dư hoạt chất SNL sinh khối 89 3.24 Hàm lượng 1-NAA tồn dư hoạt chất SNL sinh khối 89 3.25 Kết phân tích chất tồn dư 1-NAA hoạt chất mẻ nuôi cấy SNL sinh khối 91 3.26 Mối tương quan diện tích píc nồng độ 1-NAA 94 3.27 Nồng độ 1-NAA mẫu SNL sinh khối 95 3.28 Hàm lượng saponin toàn phần sinh khối sâm 98 3.29 Sự phụ thuộc diện tích píc nồng độ ginsenosid 99 3.30 Hàm lượng Rb1, Rg1 Rd mẫu sâm sinh khối 100 3.31 Hàm lượng saponin toàn phần SNL tự nhiên 103 3.32 Hàm lượng Rb1, Rg1 Rd mẫu sâm sinh khối 104 3.33 Chương trình pha động định lượng Ginsenosid Rg1, Rb1 Rd 107 3.34 Kết xác định độ ẩm SNL sinh khối 110 3.35 Kết xác định tro toàn phần có SNL sinh khối 110 3.36 Chương trình pha động định lượng ginsenosid 113 3.37 Hàm lượng Rb1, Rg1 Rd mẫu sâm sinh khối 116 3.38 Kết đo độ nhiễm khuẩn cao đặc sâm SNL sinh khối 117 3.39 Chương trình pha động định lượng ginsenosid cao đặc SNL sinh khối 120 3.40 Độc tính cấp SNL sinh khối theo đường uống 122 3.41 Ảnh hưởng SNL sinh khối TLCT thỏ 123 3.42 Điện tim thỏ đạo trình DII (n = 8) 124 3.43 Ảnh hưởng SNL sinh khối số lượng HC thỏ 125 3.44 Ảnh hưởng SNL sinh khối HST thỏ 126 3.45 Ảnh hưởng SNL sinh khối số lượng BC thỏ 127 3.46 Ảnh hưởng SNL sinh khối số lượng TC thỏ 128 3.47 Ảnh hưởng SNL sinh khối hoạt độ SGOT thỏ 129 3.48 Ảnh hưởng SNL sinh khối hoạt độ SGPT thỏ 130 3.49 Ảnh hưởng SNL sinh khối creatinin máu thỏ 131 3.50 Ảnh hưởng SNL sinh khối ure máu thỏ 132 3.51 Kết nghiên cứu mô bệnh học gan thỏ 133 3.52 Kết nghiên cứu mô bệnh học thận thỏ 134 3.53 Kết nghiên cứu mô bệnh häc cđa l¸ch thá 134 3.54 Thời gian bơi chuột thí nghiệm 137 3.55 Thời gian bám rotarod chuột sau 60 phút thử thuốc 138 3.56 Thời gian bám rotarod chuột sau tuần thử thuốc 139 3.57 Sức chân chuột lô nghiên cứu 140 3.58 Ảnh hưởng SNL sinh khối đến trọng lượng chuột 140 3.59 Tốc độ hình thành phản xạ có điều kiện tìm thức ăn mê lộ lô chuột nghiên cứu (n = 8) 142 3.60 Tốc độ dập tắt phản xạ có điều kiện tìm thức ăn mê lộ chuột nhắt trắng lô nghiên cứu (n=8) 142 3.61 Tác dụng khả học tập, nhận thức chuột nhắt trắng 143 3.62 Tác dụng khả ghi nhớ chuột nhắt trắng 144 3.63 Đáp ứng chuột với môi trường lạ 145 3.64 Tác dụng SNL sinh trờn lực thần kinh 145 3.65 Nng MDA mẫu gan chuột nghiên cứu 147 3.66 Nồng độ GSH lô chuột nghiên cứu 148 3.67 Ảnh hưởng SNL sinh khối liều 1,2g/kg đến nồng độ MDA 149 3.68 Ảnh hưởng sinh khối sâm liều 1,2g/kg đến nồng độ GSH 150 3.69 Nồng độ GSH /máu lô chuột nghiên cứu 151 3.70 Hoạt độ SOD máu lô nghiên cứu 152 3.71 Hoạt độ GPx máu chuột gây độc CCl4 153 3.72 Trạng thái chống oxy hóa toàn phần (TAS) huyết tương 154 3.73 Hoạt độ SGOT SGPT lô nghiên cứu 156 3.74 Trọng lượng gan lô nghiên cứu 156 3.75 Tỷ lệ % tăng thể tích bàn chân chuột sau gây viêm 160 3.76 Tỷ lệ % ức chế (I%) phù viêm cấp bàn chân chuột sau gây viêm 161 3.77 Khối lợng u hạt lô nghiên cứu 162 3.78 Ngưỡng đau bàn chân chuột bị gây viêm cấp 163 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình 1.1 Qui trình tạo sinh khối tế bào thực vật Trang 1.2 Đường cong phát triển tế bào thực vật 12 1.3 Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamenesis) 17 1.4 Cấu trúc hóa học saponin sâm Ngọc Linh 19 2.1 Thiết bị Rota-Rod Cat No 47600, Ugo Basile 43 2.2 Grip strength meter, Cat No 47106, Ugo Basile 44 2.3 Chuång mª lé (classic maze) 46 2.4 Mê cung nớc (Morris water maze) 47 2.5 Bảng đục lỗ Hole Board Cat No 6650, Ugo Basile 48 2.6 Máy đo phản xạ tự động có điều kiện Automatic Reflex Conditioner Cat No 7530, Ugo Basile 49 2.7 Hình 2.7 Plethysmometer Cat No.7140, Ugo Basile 63 2.8 Paw Pressure Analgesy Meter Cat No 37215 , Ugo Basile 65 3.1 Rễ callus sâm Ngọc Linh 66 3.2 Callus SNL sau lần cấy chuyển môi trường thạch 70 3.3 Tế bàoSNL môi trường thạch (A); môi trường lỏng (B) 74 3.4 Sắc ký đồ mẫu trắng (a), mẫu thử ng/ml (b) 96 3.5 Sắc ký đồ mẫu SNL tự nhiên (a) SNL sinh khối (b) 97 3.6 Sắc ký đồ HPLC ginsenosid chuẩn (a) SNL sinh khối (b) 97 3.7 Hình ảnh vi phẫu rễ SNL tự nhiên 101 3.8 Hình ảnh soi bột rễ SNL tự nhiên 3.9 Sắc ký đồ chuẩn (a) SNL tự nhiên (HPLC-b), sắc ký lớp mỏng (c) 3.10 Sắc ký đồ mẫu SNL tự nhiên (b) cao đặc SNL sinh khối (a) 3.11 Sắc ký đồ HPLC ginsenosid chuẩn (a) cao đặc SNL sinh khối (b) 101 102 115 116 3.12 Hình ảnh gan thỏ thực nghiệm (HE, 100X) 135 3.13 Hình ảnh mơ bệnh học thận thỏ thực nghiệm (HE, 100X) 135 3.14 Hình ảnh lách thỏ thực nghim (HE, 100X) 135 3.15 Hình ảnh i th gan lô chuột nghiên cứu 157 3.16 Hỡnh ảnh mô bệnh học gan chuột nghiên cứu (HE, 100X) 158 DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ Biểu đồ Tên biểu đồ Trang 3.1 Ảnh hưởng yếu tố đầu vào đến tốc độ phát triển tế bào 80 3.2 Ảnh hưởng yếu tố đầu vào đến lượng saponin tế bào 81 3.3 Sự thay đổi hàm lượng 1-NAA hoạt chất ginsenosid qua lần rửa 89 3.4 Tương quan nồng độ 1-NAA diện tích píc 95 3.5 Sự phụ thuộc diện tích píc vào nồng độ Rg1, Rb1 Rd 99 DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ Tên sơ đồ Trang 3.1 Sơ đồ quy trình thu hoạch SNL sinh khối 90 3.2 Quy trình chiết xuất siêu âm cao SNL sinh khối 92 3.3 Sơ đồ xử lý dịch chiết hoàn thiện cao SNL sinh khối 93 164 - Tỷ lệ phần trăm tăng ngưỡng đau so với lô chứng sinh lý lô dùng SNL sinh khối lô dùng SNL tự nhiên tăng cao thời điểm sau uống thuốc (lần lượt 59,52 % 61, 37 %) Ngưỡng đau tăng đồng nghĩa với thuốc có tác dụng giảm đau tốt Như vậy, SNL sinh khối nghiên cứu theo mô hình RandallSelitto, chuột cống trắng, dùng liều 0,9g/kg TLCT, có tác dụng giảm đau tốt tổ chức phù viêm cấp tác dụng tương đương với SNL tự nhiên dùng liều 0,18g/kg TLCT Bàn luận tác dụng chống viêm giảm đau SNL sinh khối: Tác dụng chống viêm sâm nhiều tác giả báo cáo [33], [37] SNL có thành phần majonoside-R2 chứng minh có tác dụng chống viêm, chống khối u [59] Trên sở tác dụng chống viêm, kháng khuẩn SNL, Viện Dược liệu bào chế viêm ngậm trị ho, viêm họng từ SNL Trong nghiên cứu đánh giá tác dụng chống viêm cấp SNL sinh khối mơ hình gây phù viêm cấp bàn chân chuột cống carragenin, đánh giá tác dụng chống viêm mạn mơ hình gây u hạt thực nghiệm đánh giá tác dụng giảm đau tổ chức phù viêm dùng thử nghiệm Randall-Sellito Đây mơ hình kinh điển, có giá trị đánh giá sàng lọc tác dụng giảm đau chống viêm chế phẩm Kết nghiên cứu cho thấy SNL sinh khối có tác dụng thử mơ hình này, tác dụng tương đương với tác dụng SNL tự nhiên Bàn luận liều tác dụng SNL sinh khối: Trong đề tài sử dụng liều dùng SNL sinh khối 0,9g/kg chuột cống trắng 1,2g/kg chuột nhắt trắng Liều dùng SNL tự nhiên dùng làm đối chứng so sánh 0,18g/kg chuột cống trắng 0,24g/kg chuột nhắt trắng Cơ sở cho việc xác định liều dùng bao gồm: - Theo nghiên cứu phân tích Nguyễn Văn Minh, Vũ Bình Dương, Đào Văn Đơn cộng [16], hàm lượng hoạt chất (các ginsenosids) SNL sinh khối 1/5 lượng có rễ SNL tự nhiên - Theo nghiên cứu viện dược liệu tác dụng dược lý SNL tự nhiên [17], [18], [20], [25], liều có tác dụng dịch chiết rễ SNL tự nhiên 0,1 đến 0,3 g/kg thử chuột nhắt trắng Chúng chọn liều dùng SNL tự nhiên dùng cho chuột nhắt trắng 0,24 g/kg quy đổi liều 165 cho chuột cống trắng 0,18g/kg TLCT Với mức liều SNL tự nhiên, qua nghiên cứu thấy liều có tác dụng rõ Dựa kết kết tỷ lệ lượng hoạt chất SNL sinh khối so với sâm tự nhiên (1/5), tính liều thử đánh giá tác dụng SNL sinh khối 1,2 g/kg TLCT với chuột nhắt trắng 0,9 g/kg TLCT với chuột cống trắng - Theo kết khảo sát động học theo liều SNL sinh khối nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa dịch chiết SNL sinh khối cho thấy mức liều 0,4g/kg, 0,8g/kg 1,2g/kg chuột nhắt trắng có tác dụng, mức liều 1,2g/kg thể tác dụng rõ Từ sở trên, liều dùng SNL sinh khối 0,9g/kg với chuột cống trắng 1,2g/kg chuột nhắt trắng ấp dụng cho thử nghiệm Kết thử nghiệm cho thấy mức liều SNL sinh khối thể tác dụng tốt tác dụng tương đương với SNL tự nhiên dùng liều 0,18 g/kg với chuột cống trắng 0,24 g/kg chuột nhắt trắng, tức 1/5 liều dùng SNL sinh khối Như kết thử nghiệm hoàn toàn phù hợp với kết nghiên cứu cơng bố trước kết tính toán đưa 166 KẾT LUẬN Đã xây dựng qui trình tạo sâm Ngọc Linh sinh khối qui mơ phịng thí nghiệm Quy trình tạo khối tế bào sâm Ngọc Linh từ giai đoạn nuôi cấy tạo callus đến ni cấy Bioreactor 15 lít: - Quy trình kỹ thuật tạo callus từ rễ sâm Ngọc Linh tự nhiên, sử dụng mơi trường MS có bổ sung mg/l NAA 0,1 mg/l kinetin với pH mơi trường = 5,8, trì ni cấy thời gian 35 ngày Với điều kiện thành phần môi trường tỷ lệ tạo callus đạt 40% - Quy trình kỹ thuật trì nuôi cấy callus môi trường thạch mềm Môi trường điều kiện thích hợp để tế bào phát triển tốt là: mơi trường MS có bổ sung NAA, 0,1 mg/l kinetin, 30 g/l đường saccarose, pH môi trường: 5,8; nhiệt độ 24-260C thời gian 35 ngày, sau – lần cấy chuyển môi trường thạch mềm tế bào khơng cịn khả biệt hóa tốc độ phát triển tế bào cao ổn định với tỷ lệ tăng trưởng đạt 5,38 lần - Đã xây dựng qui trình kỹ thuật ni cấy tối ưu hóa ni cấy sâm Ngọc Linh môi trường lỏng Đã lựa chọn môi trường điều kiện ni cấy thích hợp cho tế bào sâm thích nghi phát triển tốt mơi trường lỏng hệ thống shaker bình 150 ml Mơi trường MS có sử dụng NAA = 6,42 mg/l ; kinetin = 0,11 mg/l; đường = 34,3 g/l, pH = 5,6-5,8; nhiệt độ ni cấy 24-260C, khơng có ánh sáng, tốc độ lắc shaker 150 vòng/phút, thời gian nuôi cấy: 14 ngày Khi sử dụng môi trường nuôi cấy tối ưu khối lượng tế bào thu đạt 20,11 g/l khối lượng saponin toàn phần đạt 20,01mg/g - Đã xây dựng qui trình kỹ thuật ni cấy hệ thống Bioreactor lít 15 lít với điều kiện nuôi cấy hệ thống máy lắc - Qui trình kỹ thuật thu hoạch khối tế bào sâm hàm lượng chất NAA tồn dư giới hạn cho phép Đã xây dựng tiêu chuẩn sở phương pháp kiểm nghiệm sâm Ngọc Linh Gồm có tiêu chuẩn sở rễ sâm Ngọc Linh tự nhiên, sâm Ngọc Linh sinh khối cao đặc (5:1) sâm Ngọc Linh sinh khối Trong đó, sâm Ngọc Linh sinh khối có hàm lượng saponin tồn phần đạt 2,01% Hàm lượng 167 ginsenosid mẫu sâm Ngọc Linh sinh khối theo phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao Rg1 =0,31%; Rb1 = 0,36%; Rd= 0,15% Đã đánh giá tính an tồn số tác dụng sinh học sâm Ngọc Linh sinh khối 3.1 Sâm Ngọc Linh sinh khối có tính an tồn cao thử động vật thực nghiệm - Chưa xác định độc tính cấp dịch chiết tế bào sâm Ngọc Linh sinh khối (LD50) dùng theo đường uống Với thể tích dịch chiết sâm Ngọc Linh sinh khối cao đưa vào dày chuột nhắt trắng (0,5ml/10g, tương ứng 100g/kg), không gây chết chuột nhắt trắng thực nghiệm - Khi dùng dịch chiết tế bào sâm Ngọc Linh sinh khối liều 2g/kg/24h 4g/kg/24h cho thỏ thời gian 42 ngày (độc tính bán trường diễn): Khơng ảnh hưởng đến phát triển trọng lượng thể Không làm ảnh hưởng đến điện tim thỏ Không độc với quan tạo máu (hồng cầu, hemoglobin, tiểu cầu, bạch cầu) Không làm ảnh hưởng đến chức thận (hàm lượng ure, creatinin), chức gan (enzym SGOT, SGPT) Trên hình ảnh mơ bệnh học: dịch chiết sâm Ngọc Linh sinh khối không gây tổn thương mô bệnh học gan, lách thận 3.2 Sâm Ngọc Linh sinh khối với mức liều 0,9g/kg với chuột cống trắng 1,2g/kg chuột nhắt trắng có tác dụng: - Tác dụng tăng lực: Làm tăng thời gian bơi thử nghiệm chuột bơi kiệt sức, tăng gian bám rota-rod, tăng sức thử nghiệm grip streng test, không gây ảnh hưởng đến trọng lượng chuột - Tác dụng thần kinh trung ương: Tác dụng tốt trình nhận thức ghi nhớ, thể qua đánh giá mơ hình mê cung nước mơ hình tránh né chủ động chuột gây suy giảm trí nhớ scopolamine Rút ngắn thời gian hình thành dập tắt phản xạ thử mơ hình mê lộ (classical maze), gây hưng phấn, tăng hoạt động, tăng tính tị mị thám hiểm (thử nghiệm hole-board test) - Tác dụng chống oxy hóa: làm giảm lượng MDA tạo gan; làm tăng lượng GSH gan - Tác dụng bảo vệ gan: Làm giảm men gan, giảm khối lượng gan bị viêm, giảm tổn thương gan (trên hình ảnh đại thể vi thể) chuột nhắt trắng gây độc CCl4 168 - Tác dụng chống viêm: thể tác dụng chống viêm cấp thử mơ hình gây phù viêm cấp bàn chân chuột cống carragenin, tác dụng chống viêm mạn đánh giá mô hình gây u hạt thực nghiệm, tác dụng giảm đau tổ chức phù viêm đánh giá thử nghiệm RandallSellito 169 KIẾN NGHỊ - Hoàn thiện qui trình sinh khối tế bào sâm qui mơ lớn nhằm sản xuất lượng lớn sâm Ngọc Linh sinh khối - Nghiên cứu bào chế sản phẩm nhằm chăm sóc bảo vệ sức khỏe cộng đồng từ nguyên liệu sâm Ngọc Linh sinh khối 170 Tµi liƯu tham kh¶o Tiếng Việt Bộ Y tế - Cộng hoà Xã hội Chủ nghĩa Việt Nam ( 1996 ) : Quy định nghiên cứu dược lý thuốc y học cổ truyền dân tộc, định 371/QĐ-BYT Bộ Y Tế (1996) “Hướng dẫn nghiên cứu dược lý thuốc cổ truyền”, Hướng dẫn nghiên cứu đánh giá tính an tồn hiệu lực thuốc cổ truyền Việt Nam, tr 41-49 Bộ Y Tế (1996) “Hướng dẫn khảo sát độc tính thuốc cổ truyền”, Hướng dẫn nghiên cứu đánh giá tính an tồn hiệu lực thuốc cổ truyền Việt Nam, tr 30-40 Bộ Y tế, (2005), Dự thảo hướng dẫn thử độc tính thuốc-Các phương pháp thử độc tính cấp- OECD, Phụ lục Bộ Y tế, (2005), Dự thảo hướng dẫn thử độc tính thuốc-Các phương pháp Tính LD50 cổ điển, Phụ lục Bộ Y tế, (2005), Dự thảo hướng dẫn thử độc tính thuốc-Phương pháp thử độc tính liều nhắc lại 28 ngày, đường uống – OECD Guideline: Repeated Dose Toxicity 28 Days- Oral, Phụ lục Bộ môn Dược liệu, Trường Đại học Dược Hà Nội (2005) Bài giảng Dược liệu, tập Nhà xuất Y học – Hà Nội Đặng Văn Giáp Thiết kế & tối ưu hóa cơng thức quy trình Nhà xuất Y học (2002) Đỗ Huy Bích cộng (2003) Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, tập I ; II Nhà xuất Khoa học kỹ thuật 10 Đỗ Trung Đàm (2001) “Phương pháp nghiên cứu tác dụng tăng lực thuốc dùng nghiệm pháp chuột bơi” Tạp chí dược học số 11, tr.79 11 Đỗ Tất Lợi (2005) Những thuốc vị thuốc Việt Nam NXB Y học Tr 808-810 171 12 Phạm Hoàng Hộ (1998) Cây cỏ Việt Nam, NXB Trẻ 13 Lê Minh Un (2002), Nghiên cứu tính chất chống oxy hố số chế phẩm Actisô (Cynara scolymus) gan chuột nhắt, Luận án thạc sỹ dược học, Trường ĐH Y-Dược TP-HCM, TP HCM 14 Nguyễn Xuân Phách cs ( 1995 ) : Toán thống kê tin học ứng dụng sinh – y – dược, Nhà xuất Quân đội Nhân dân 15 Nguyễn Văn Long, Nguyễn Hoàng Ngân, Vũ Bình Dương cs Nghiên cứu độc tính dịch chiết xuất SKTB rễ SNL Tạp chí Y dược học quân - Học viện quân Y (Đã gửi đăng năm 2008) 16 Nguyễn Văn Minh, Vũ Bình Dương, Đào Văn Đơn cs (2008) Nghiên cứu định lượng đồng thời số ginsenosid SNL sinh khối phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao Cơng trình hội nghị khoa học cơng nghệ Hóa Dược Vit Nam ln th 17 Nguyễn Thị Thu Hơng, Yobimoto (2001), Stress lÃo hoá - triển vọng sâm Việt Nam (Panax vietnamensis), Công trình nghiên cứu khoa häc 1987 – 2000, ViƯn D−ỵc LiƯu, trang 447 – 449 18 Nguyễn Thị Thu Hương, Bùi Thị Kim Cúc (2006), Tác dụng bảo vệ gan sâm Việt Nam tổn thương gan thực nghiệm ethanol, Nghiên cứu phát triển dược liệu đông dược Việt Nam, trang 288 – 295, Nxb KH KT, Hà Nội 19 Nguyễn Thị Hiền (2002), Nghiên cứu tác dụng chống oxy hoá becelen chuột thực nghiệm, Luận án thạc sỹ y học, Trường Học viện Quân y, Hà Nội 20 Nguyễn Thu Hương, Lương Kim Bích, Đồn Thị Ngọc Hạnh (2005) “Nghiên cứu tác dụng sâm Việt Nam Đinh lăng trí nhớ” Tạp chí Dược liệu; 2005/số 21 Nguyễn Quang Thường (2003), Nghiên cứu ứng dụng số phương pháp xác định gốc tự chất chống oxy hoá thể, Đề tài cấp y tế, Hà Nội 172 22 Nguyễn Văn Nguyên (2003), Nghiên cứu bào chế ứng dụng chế phẩm chống oxy hoá, chống lão hoá từ dược liệu nước, bảo vệ đối tượng tiếp xúc với tác nhân độc hại, Đề tài độc lập cấp nhà nước, Hà Nội 23 Phạm Thị Trang (2005) “Nghiên cứu sơ thành phần hoá học, tác dụng tăng cường thể lực tác dụng hạ đường huyết sâm báo” Khoá luận tốt nghiệp dược sỹ đại học 24 Trần Mỹ Tiên, Nguyễn Thị Thu Hương (2006), Nghiên cứu số tác dụng dược lý sâm Việt Nam, Nghiên cứu phát triển dược liệu đông dược Việt Nam, trang 303 – 311, Nxb KH KT, Hà Nội 25 Trần Mỹ Tiên, Nguyễn Thị Thu Hương (2006) “Xây dựng thử nghiệm tránh né thụ động (Passive avoidance test-step-down method) nghiên cứu tác dụng sâm Việt Nam trí nhớ” Tạp chí Dược liệu 2006/số 26 Trần Lê Quân, Shigetoshi Kadota, Trần Kim Qui (2003) “Triterpen Saponin từ sâm Việt Nam (Panax vietnamensis) hoạt tính bảo vệ gan” Hố học kỷ XXI phát triển bền vững: Tuyển tập session: tập II: II; 2003/số 27 Võ Văn Chi (1997) Từ điển thuốc Việt Nam NXB Y học 28 Vũ Bình Dương (2008), Nghiên cứu xây dựng quy trình tạo SKTB rễ SNL, Luận văn thạc sỹ dược học, Học viện Quân y, Hà Nội 29 Vũ Xuân Nghĩa (2002), Nghiên cứu khả chống oxy hố chế phẩm protecgan mơ hình gây viêm hoại tử gan chuột thực nghiệm tetraclorua cacbon, Luận án thạc sỹ y học, Học viện Quân Y, Hà Nội 30 Viện Dược Liệu (2006), Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý thuốc từ dược thảo, Nxb khoa học kỹ thuật, Hà Nội 31 Viện dược liệu (2003) Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam Nhà xuất Khoa học kỹ thuât Tập 2, 704-710 173 Tiếng Anh 32 Abrham W.B ( 1978 ) : Techniques of animal and clinical toxicology, Med Pub Chicago, pp 55 – 68 33 Attele AS, Wua JA and Yuan CS (1999), Ginseng pharmacology, multiple constituents and multiple actions, Biochemical Pharmacology, 58: 1685 – 1693 34 Bailey C M and H Nicholson (1990) Optimal Temperature Control for a Structured Model of Plant Cell Culture Biotechnol Bioeng 35, pp.252–259 35 Barry Halliwell (2002), Food-Derived Antioxidants: How to Evaluate Their Importance in Food and In Vivo, Handbook of Antioxidants, Second Edition, edited by Enrique Cadenas Lester Packer, University of Southern California School of Pharmacy Los Angeles, California 36 Chawla H.S (2003) Introduction Plant Biotechnology Amazone Press 37 Cabral de Oliveira AC, Perez Ac, Merino G, Pieto JG and Alvarez Al (2001), Protective effects of panax ginseng on muscle injury and inflamation after eccentric exercise, Comparative Biochemistry and Physiology, 130C: 369 – 377 38 Choi KT, Ann IO, Park JC (1993) Production of ginseng saponin in tissue-culture of ginseng Panax-gisneng CAMeyer Plant Physiol ,102(Suppl S):31 39 Daxian zhang et al (1996), Ginseng extract scavenges hydroxyl radical and protects unsaturated fatty acid from decomposition cause by iron – mediated lipid peroxidation, Free Radical Biology & Medicine, Vol 20, No 1, pp 145150 40 David D Kitts, Arosha N Wijewickreme and Chun Hu (2000), Antioxidant properties of a North American ginseng extract, Molecular and Cellular Biochemistry 203: 1- 10 174 41 Dăornenburg H, Knorr D (1995) Strategies for the improvement of secondary metabolite production in plant cell cultures Enzym Microbial Technol ;17:pp 674–84 42 Do CB, Cormier F (1990) Accumulation of anthocyanins enhanced by a high osmotic potential in grape (Vitis viniferaL.) cell suspensions Plant Cell Rep ;9, pp143–6 43 Forbes SC, Candow DG, Little JP, Magnus C, Chilebeck PD (2007) Effect of Red Bull energy drink on repeate Wingate cycle performance and bench-press muscle endurance Int J Sport Nutr Exerc Metab; 17(5): p433-44 44 Furuya T, Yoshikawa T, Orihara Y, Oda H (1984) Studies of the culture conditions for Panax ginseng cells in jar fermentors J Nat Prod, 47.pp 70– 45 Gulik.W M., H J G Ten Hoopen, J J Heijnen (2004) Kinetics and stoichiometry of growth of plant cell cultures of Catharanthus roseus and Nicotiana tabacum in batch and continuous fermentors Biotechnology and Bioenginering 40(8), pp 863-874 46 Huong N.T.T, Matsumoto K, Kasai R, Yamasaki K, Watanabe H (1998), In vitro antioxydant activity of Vietnamese ginseng saponin and its components, BioI Pharm Bull, 21: 978-981 47 J.Y Wu, K Wong, K.P Ho, L.G Zhou (2005) Enhancement of saponin production in Panax ginseng cell culture by osmotic stress and nutrient feeding Enzym and Microbial Technology, 36 pp133–138 48 Jian Zhao, T, Lawrence C Davis, Robert Verpoorte (2005) Elicitor signal transduction leading to production of plant secondary metabolites Biotechnology Advances 23.pp 283–333 49 Jian-youg Wu, Jian-Jiang Zhong (2001) Production of ginseng and it’s bioactive components in plant cell culture: current technological and applied aspects Journal of Biotechnology 72 pp 89-99 50 Jin Han, Jian-Jiang Zhong (2003) Effects of oxygen partial pressure on 175 cell growth and Ginsengnosid in high density cell cultures of PanaxGinseng Enzym and microbial technology 32, pp 498-503 51 John H Dodds, Lorin W Roberts Experiments in Plant Tissue Culture, Cambridge University Press – England(1995) pp 55-60 52 Jung Hae Kim, Eun Jung Chang (2005) Saponin productions in submerged adventitious root culture of Panax Ginseng as effected by culture conditions and elicitors Asia Pacific journal of molecular biology and biotechnology 12 pp 87-91 53 Kaori Yobimoto, Kinzo matsumoto, Nguyen Thi Thu Huong, Rioji Kasai, Hiroshi Wantanabe (2000) Suppressive Efects of Vietnamese Ginseng Saponin and its Major Component Majonoside-R2 on Psychological stress-Induced Enhancement of lipid Peroxidationin the Mouse Brain Pharmacology Biochemistry and Behavior Vol 66, No 3, pp 661-665 54 Kee-Won Yu a, Wenyuan Gaob, Eun-Joo Hahn (2002) Jasmonic acid impoves ginsengnosid accumulation in adventitious root culture of panax ginseng C.A Meyer Biochemical engineering journal 11.pp 211-215 55 Kee-Won Yu, Hosakatte Nirajana Murthy (2005) Ginsengnosid production by hairy root cultures of Panax Ginseng: influence of temperature and light quality Biochemical engineering journal 23, pp 53-56 56 Kim SJ (2003) Effect of environmental conditions on growth and quality of chrysanthemum plantlets in bioreactor culture Tissue and organ culture 76: 214-219 57 Kim SY (1995), Protective Effect of Ginseng Polysaccharide Fraction on CCl4 – induced Hepatotoxicity In vitro and in vivo, Korean J, Ginseng Sci, Vol, 19, No, 2, 108 – 113 58 Kim SJ, Jun-Hwan Oh, Dong-Wook Lee, Hwa-Jin Park and Dong-Ki Park (1996), Effect of ginsenosid Rb1 on lipid peroxidation and neurotoxicity induced by MPTP in liver and brain of mouse, Experimental and Molecular Medicine , Vol 28, No 4, 199-205 176 59 Konoshima T, Takasaki M, Tokuda H, Nishino H, Duc NM, Kasai R, Yamasaki K (1998) “Anti-tumor-promoting activity of majonoside-R2 from Vietnamese ginseng, Panax vietnamensis Ha et Grushu” Biol Pharm Bull; 21(8): p834-8 60 Lee HJ, Kim DY and Chang CC (1999), Antioxidant effects of Korean red ginseng components on the antioxydant enzyms activity and liver peroxidation in the liver of mouse treated with paraquat, Journal of Ginseng Research, 23, 182 – 189 61 M Feeney, Z.K Punja Production of somatic embryos of American ginseng (Panax quinquefolius) in suspension culture and regeneration of plantlets International Society for Horticultural Science 2003 62 Nguyen Minh Duc, Kyosikasai, Kazuo Yansaki, Nguyen Thoi Nham, Osamu Tanaka, (1997) Saponin composition of Vietnamese ginseng and Its significants from Pharmacognostical Points of view Báo cáo toàn văn Pharma indochina 1,20.23/5/l997, Bangkok, Thailan 63 Nguyen Trung Thanh, Hosakatte Niranjana Murthy, Kee-Won Yu, Cheol Seung Jeong, Eun-Joo Hahn and Kee-Yoeup Paek (2006) Effect of oxygen supply on cell growth and saponin production in bioreactor cultures of Panax ginseng Journal of Plant Physiology 163(12), pp 1337-1341 64 Nguyen TD, Villard PH, Barlatier A, Elsisi AE, Jouve E, Duc NM, Sauze C, Durand A, Lacarelle B, (2000) Panax vietnamensis protects mice against carbon tetrachloride-induced hepatotoxicity without any modificanon of CYP2El gene expression PlanraMed, Dec; 66 (8): 714-9 65 Nham N.T, De P.V, Luan T.C, Duc M.D, Shibata S, Tanaka 0, Kasai R (1995), Pharmacognostical and chemical studies on Vietnamese ginseng, Panax vietnamensis Ha et Grushv (Araliaceae) J.J pn Bot, 70,1-10 66 Quan Le Tran, I Ketut A, Yasuhiro T, Takema N, Qui KT, Shigetoshi K, (2001), Triterpene saponins from Vietnamese ginseng (Panax vietnamensis) and their hepatocytoprotective activive, J Nat Prod 64: 456 – 461 67 Rao SR, Ravishankar GA (2002) Plant cell cultures: chemical factories 177 of secondary metabolites Biotechnol Adv; 20, pp:101–53 68 Sang Yo Byun, Byung Sam Yoo (2001) Characteristics of batch and effects of various elicitors on ginsenosid production in suspension cultures of Panax ginseng C.A Meyer Korean J Biotechnol Bioeng vol 16 (6) pp-620-625 69 Seung-Hwan Kim, Kyung-Shin Park (2003), Effects of Panax ginseng extract on lipid metabolism in humans, Pharmacological Research 48, 511– 513 70 Scholey AB, Kennedy DO (2004) Cognitive and physiological effects of an “energy krink”: an evaluation of the whole drink and of glucose, caffeine and herbal flavouring fractions Psychopharmacology (Berl); 176(3-4):p320-30 71 Schulte.U(1983) H El-Shagi and M H Zenk Optimization of 19 Rubiaceae species in cell culture for the production of anthraquinones Plantcell reports vol (2) pp51-54 72 Takao Konoshima, Midori Takasaki, Eiichiro Ichiishi, Teruo Murakami, Harukuni Tokuda, Hoyoku Nishino, Nguyen Minh Duc, Ryoji Kasai, Kazuo Yamasaki (1999) “Cancer chemopreventive activity of majonosideR2 from Vietnamese ginseng, Panax vietnamensis” Cancer Letters; 147: 11-16 73 Tran QL, Adnyana IK, Tezuka Y, Harimaya Y, Saiki I, Kurashige Y, Tran QK, Kadota S (2002) “Hepatoprotective effect of majonoside R2, the major saponin from Vietnamese ginseng (Panax vietnamensis)” Planta Med; 68(5): p402-6 74 Turner A ( 1965 ) : Screening methods in pharmacology, Academic Press, New York and London, pp 60 – 68 75 Tran Ty Yen (1990) “Improvement of learning ability in mice and rats with the root extract of Dinh lang (Polycias fruticosum L.) Acta Physiol Hung; 75(1): 6976 76 Tran Ty Yen (1990) “Stimulation of sexual performance in male rats with the root extract of Dinh lang (Polycias fruticosum L.) Acta Physiol Hung; 75(1): 61-7 77 WHO ( 1993 ) : Research guidelines for evaluating the safety and 178 efficacy of herbal medicines, Manila, Philipin, pp 35 – 41 78 Wu JY, Zhong JJ (1999) Production of ginseng and its bioactive components in cell culture: current technological and applied aspects J Biotechnol, 68 pp89–99 79 Yasuko SAKATA (2005): Effect of a Nutritive-Tonic Drink on ScopolamineInduced Memory Impairment in Mice, Biol Pharm Bull 28(10) 1886—1891 80 Yari Khosroushahi A, M Valizadeh , A Ghasempour, M Khosrowshahli, H Naghdibadi, M.R.Dadpour, Y.Omidi (2006) Improved Taxol production by combination of inducing factors in suspension cell culture of Taxus baccata Cell Biology International, 30, pp262-269 81 Yasuhiro Fujita and Yasuhiro Hara (1985) The Effective Production of Shikonin by Cultures with an Increased Cell Population Agric Biol Chem., 49 (7) Pp 2071-2075 82 Yen TT, Knoll J (1992) “Extension of lifespan in mice treated with Dinh lang (Policias fruticosum L.) and (-)deprenyl” Acta Physiol Hung; 79(2): 119-24 83 Zhang YH, Zhong JJ, Yu JT (1995) Effect of osmotic pressure on cell growth and production of ginseng saponin and polysaccharides in suspension cultures of Panax notoginseng Biotechnol Lett ;17: pp 1347– 50 84 Zhong J.J; Wang D.J (2005) Improverment of cell growth and productions of Ginseng saponin and polysaccharide in suspensions culture of Panax notoginseng: Cu2+ effect J Biotechnol 46.pp 69-72 85 Zhou Jun , Toshinobu Morita Saponin of Zu-Tziseng, Rhizomes of Panax japonica C.A Meyer var major (Burk) C Y Wu et K M Feng, collected in Yunnan, China Chem, Pharm Bull 30 (12) 4331 – 4346 (1982) ... hợp Ajou, Hàn Quốc triển khai nghiên cứu công nghệ sinh khối tế bào Sâm Ngọc Linh Trong trình tiến hành đề tài này, việc đánh giá tác dụng dược lý Sâm Ngọc Linh sinh khối có so sánh với Sâm Ngọc. .. Kết xây dựng tiêu chuẩn sở 101 3.3 TÍNH AN TOÀN VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG CỦA SÂM NGỌC LINH SINH KHỐI 122 3.3.1 Kết đánh giá tính an toàn sâm Ngọc Linh sinh khối 122 3.3.2 Một số tác dụng dược lý sâm Ngọc. .. cấp nguyên liệu, số Xí nghiệp Dược phẩm phải ngừng sản xuất chế phẩm từ Sâm Ngọc Linh tinh sâm nước, tinh sâm viên, viên ngậm Trên giới, công nghệ sinh khối tế bào thực vật ứng dụng rộng dãi, tạo