Nghiên cứu xây dựng qui trình tạo sinh khối thông qua hệ thống nuôi cấy rễ tơ của cây bá bệnh (Eurycoma longifolia)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT - - HOÀNG HÀ NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH TẠO SINH KHỐI THÔNG QUA HỆ THỐNG NUÔI CẤY RỄ TƠ CỦA CÂY BÁ BỆNH (Eurycoma longifolia) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2012 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT - - LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH TẠO SINH KHỐI THÔNG QUA HỆ THỐNG NUÔI CẤY RỄ TƠ CỦA CÂY BÁ BỆNH (Eurycoma longifolia) Chuyên ngành: Mã số: Sinh học thực nghiệm 624230 Học viên: Hƣớng dẫn khoa học: Hoàng Hà PGS TS Chu Hoàng Hà Hà Nội - 2012 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến người hướng dẫn, giúp đỡ tận tình để hoàn thành luận văn này: Người thầy tôi, PGS TS Chu Hoàng Hà, Phó Viện trưởng Viện công nghệ sinh học, trưởng phòng Công nghệ Tế bào Thực vật - Viện Công nghệ Sinh học, hướng dẫn hỗ trợ tận tình, truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm quý báu suốt trình thực đề tài GS TS Lê Trần Bình, TS Lê Văn Sơn, TS Phạm Bích Ngọc, CN Nguyễn Đình Trọng cán phòng Công nghệ Tế bào Thực vật bảo tận tình chuyên môn, theo sát thí nghiệm để có lời khuyên bổ ích kịp thời Trong năm học tập nghiên cứu phòng Công nghệ tế bào thực vật, nhận nhiều quan tâm giúp đỡ, động viên chân thành tập thể cán phòng Các thực tập sinh thân thiện, nhiệt tình, tạo nên môi trường nghiên cứu chủ động, hăng say Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ quý báu Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến phòng Tổng hợp hữu Viện Hóa học - Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, phòng Sắc ký khối phổ phân giải cao khoa Hóa học - Đại học Khoa học tự nhiên tạo điều kiện cho hoàn thành đề tài Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến thầy cô giáo sở viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật truyền đạt cho kiến thức quý báu thời gian học tập vừa qua Bằng tình cảm chân thành, xin gửi lời cảm ơn đến gia đình bạn bè bên, động viên, giúp đỡ suốt thời gian thực luận văn Hà Nội, tháng năm 2012 Học viên Hoàng Hà Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn NHỮNG KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT API Atmospheric Pressure Ionization Bp Base pairs CTAB Cetyl trimethylammonium bromide COI Cytochrome c oxidase subunit I dNTP 2‟- deoxyribonucleoside - 5‟triphosphate EDTA Ethylene diamine tetra acetic acid ITS Internal Transcribed Spacer Kb Kilobase MS Mass Spectrometry MS Murashige and Skoog WPM Woody Plant Medium Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY BÁ BỆNH .4 1.1.1 Giới thiệu phân bố địa lý 1.1.2 Phân loại 1.1.3 Hình thái 1.1.4 Tác dụng dƣợc lý bá bệnh 1.1.5 Tính cấp thiết nghiên cứu, bảo tồn sản xuất bền vững bá bệnh 1.2 NUÔI CẤY SINH KHỐI RỄ TƠ - GIẢI PHÁP TẠO NGUỒN DƢỢC PHẨM SẠCH PHỤC VỤ SỨC KHỎE CỘNG ĐỒNG .6 1.2.1 Giới thiệu nuôi cấy sinh khối tế bào 1.2.2 Giới thiệu Agrobacterium rhizogenes - phƣơng pháp tạo rễ tơ tế bào thực vật 1.2.3 Cơ chế chuyển gen vùng T-DNA vào tế bào thực vật 1.2.4 Nuôi cấy sinh khối rễ tơ .10 1.3 CÁC NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CHỈ THỊ DNA VÀO VIỆC ĐỊNH DANH LOÀI 13 1.4 PHƢƠNG PHÁP KHỐI PHỔ (MASS SPECTROMETRY-MS) 15 Chương 2: VẬT LIỆU - PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .18 2.1 VẬT LIỆU .18 2.2 DỤNG CỤ - HÓA CHẤT .18 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.3.1 Thu thập định danh loài thị phân tử 18 2.3.2 Phƣơng pháp khử trùng hạt đƣa mẫu vào nuôi cấy in vitro .19 2.3.3 Phƣơng pháp chuyển gen thông qua Agrobacterium rhizogenes 20 2.3.4 Đánh giá dòng rễ tơ chuyển gen phòng thí nghiệm 20 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 3.1 THU THẬP VÀ ĐỊNH DANH LOÀI BÁ BỆNH BẰNG CHỈ THỊ DNA 26 3.1.1 Thu thập mẫu 26 3.1.2 Định danh loài thị DNA 27 3.2 KẾT QUẢ KHỬ TRÙNG HẠT VÀ ĐƢA CÁC MẪU BÁ BỆNH VÀO NUÔI CẤY IN VITRO LÀM NGUYÊN LIỆU CHO NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO VÀ CHUYỂN GEN TẠO RỄ TƠ 31 3.3 TỐI ƢU HÓA QUY TRÌNH CHUYỂN GEN VÀ TIẾN HÀNH CHUYỂN GEN TẠO RỄ TƠ THÔNG QUA Agrobacterium rhizogenes 33 3.3.1 Tối ƣu hóa quy trình chuyển gen thông qua A rhizogenes 33 3.3.2 Kết chuyển gen tạo rễ tơ thông qua vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes 35 3.3.3 Kết thử nghiệm môi trƣờng nuôi cấy rễ tơ bá bệnh 37 3.3.4 Các hình thái rễ tơ bá bệnh 39 3.3.5 Kiểm tra dòng rễ tơ chuyển gen 40 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3.3.6 Kết nuôi sinh khối rễ tơ bá bệnh môi trƣờng WPM lỏng 42 3.4 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH CÁC HỢP CHẤT THỨ CẤP CÓ TRONG DÒNG RỄ TƠ BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ BẢN MỎNG VÀ KHỐI PHỔ KẾ 42 3.4.1 Kết sắc ký mỏng 42 3.4.2 Kết phân tích hợp chất tự nhiên rễ bá bệnh 43 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn Thạc sỹ Hoàng Hà MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Cây bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack) hay Tongkat Ali thảo dƣợc phân bố chủ yếu khu vực Đông Nam Á Cây Bá bệnh thuốc quý với khả trị bách bệnh, đƣợc tìm thấy Việt Nam Vƣờn quốc gia Bái Tử Long từ năm 2000, mọc tự nhiên hầu hết diện tích đất rừng Trên giới, từ lâu đƣợc biết đến nhƣ nhân sâm Malaysia, nhƣ nhiều nƣớc Đông Nam Á nhƣ Indonesia, Brunei, Thái lan, Cămpuchia, Lào… với tác dụng giúp nam giới tăng cƣờng chức sinh lý sức khoẻ tình dục Các phận đƣợc sử dụng nhiều thuốc truyền thống chữa bệnh sốt rét, bệnh tiểu đƣờng, kháng lại bệnh vi sinh vật tăng cƣờng chức sinh lý sức khoẻ tình dục, bổ sung lƣợng cho thể, giúp giảm stress, mệt mỏi, tăng cƣờng miễn dịch, ngăn ngừa khối u phòng chống lão hoá Các hợp chất có hoạt tính sinh học đƣợc tìm thấy từ phận khác nhƣ eurycomaoside, eurycolactone, eurycomalactone, eurycomanone, pasakbumin-B, với alkaloid quassinoid Cây Bá bệnh đƣợc sản xuất sử dụng dƣới dạng thực phẩm chức nhiều nƣớc châu Á, Tây Âu Hoa Kỳ Ở Việt Nam, kết nghiên cứu ban đầu nhà khoa học trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội vào năm 2006 cho thấy bá bệnh Việt Nam có tác dụng không thua nƣớc khu vực Hiện nay, giá trị y dƣợc quý Bá bệnh đƣợc nhiều ngƣời biết đến; cần quản lý sử dụng phƣơng pháp khoa học để khai thác bền vững nguồn tài nguyên Trƣớc tình hình trên, bên cạnh việc nghiên cứu giá trị Bá Bệnh Việt Nam, phân tích tác dụng dƣợc lý để đƣa hƣớng dẫn chiết xuất, sử dụng phù hợp với sức khoẻ cộng đồng, cần sớm nghiên cứu áp dụng nuôi cấy sinh khối tế bào thực vật tạo nguồn nguyên liệu ổn định, đáp ứng nhu cầu làm thuốc Những năm gần đây, với xu hƣớng chung giới, nƣớc ta hƣớng nghiên cứu công nghệ sinh khối tế bào thực vật để sản xuất sản phẩm thứ cấp bắt đầu đƣợc quan tâm đầu tƣ phát triển Tuy nhiên trình nuôi cấy tạo sinh khối tế bào thực vật nhằm làm giảm tính biệt hóa mô tế bào Luận văn Thạc sỹ Hoàng Hà nuôi cấy cần bổ sung chất điều hòa sinh trƣởng vào môi trƣờng nuôi cấy Vấn đề trở ngại lớn tồn dƣ chất điều hòa sinh trƣởng sinh khối tế bào nuôi cấy ảnh hƣởng trực tiếp đến sản phẩm sức khỏe ngƣời sử dụng Việc hoàn toàn khắc phục nuôi cấy sinh khối từ rễ tơ Rễ tơ bệnh thực vật đƣợc gây trình tƣơng tác vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes tế bào vật chủ Rễ tơ có khả sinh trƣởng nhanh, phát triển tốt môi trƣờng không cần bổ sung chất điều hòa sinh trƣởng nuôi cấy tạo sinh khối liên tục điều có ý nghĩa dây chuyền sản xuất hợp chất thứ cấp hay dƣợc phẩm sinh học tái tổ hợp Rễ tơ sản xuất lƣợng lớn hợp chất thứ cấp quan biệt hóa nên rễ tơ có di truyền ổn định nuôi cấy tế bào huyền phù mô sẹo Xuất phát từ ƣu điểm hợp chất dƣợc lý quý Bá bệnh chủ yếu thu đƣợc từ rễ, thực đề tài: “Nghiên cứu xây dựng qui trình tạo sinh khối thông qua hệ thống nuôi cấy rễ tơ bá bệnh (Eurycoma longifolia)” Công trình đƣợc thực phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam Mục đích nghiên cứu Mục tiêu tổng quát: Nghiên cứu sở khoa học thực nghiệm việc tạo sinh khối bá bệnh làm nguyên liệu dƣợc thực phẩm chức công nghệ nuôi cấy rễ tơ Mục tiêu cụ thể: - Thu thập đƣợc mẫu Bá Bệnh làm nguyên liệu cho nuôi cấy mô tế bào chuyển gen tạo rễ tơ - Tối ƣu hóa đƣợc quy trình chuyển gen thông qua Agrobacterium rhizogenes tạo đƣợc dòng rễ tơ - Đánh giá điều kiện nuôi cấy chọn lọc đƣợc số dòng rễ tơ có khả sinh trƣởng nhanh để nuôi cấy tạo sinh khối - Bƣớc đầu đánh giá hàm lƣợng hoạt chất sản phẩm nuôi cấy thu đƣợc so với dƣợc liệu tự nhiên Nội dung nghiên cứu - Thu thập định danh mẫu bá bệnh thị phân tử - Đƣa mẫu bá bệnh vào nuôi cấy in vitro Luận văn Thạc sỹ Hoàng Hà - Nghiên cứu tối ƣu quy trình chuyển gen sử dụng Agrobacterium rhizogenes, tạo rễ tơ bá bệnh xác định điều kiện môi trƣờng thích hợp cho sinh trƣởng - Đánh giá sơ hàm lƣợng hoạt chất sản phẩm nuôi cấy thu đƣợc so với dƣợc liệu tự nhiên Ý nghĩa khoa học Làm sở cho việc sản xuất quy mô công nghiệp sinh khối rễ tơ bá bệnh cho mục đích làm nguyên liệu dƣợc thực phẩm chức Luận văn Thạc sỹ Hoàng Hà CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan bá bệnh 1.1.1 Giới thiệu phân bố địa lý Cây bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack) hay Tongkat Ali thảo dƣợc phân bố chủ yếu khu vực Đông Nam Á Bá bệnh thuốc đƣợc sử dụng dân gian từ lâu, đƣợc gọi với tên khác là: mật nhân, hay bách bệnh Tại Việt Nam bá bệnh có mặt vƣờn quốc gia Bái Tử Long, khu Bảo tồn thiên nhiên Đồng Sơn- Kỳ Thƣợng, Hoành Bồ, Quảng Ninh, số rừng Tây Nguyên Cây Bá bệnh từ lâu đƣợc biết đến nhƣ nhân sâm Malaysia, nhƣ nhiều nƣớc Đông Nam Á nhƣ Indonesia, Brunei, Thái lan, Cămpuchia, Lào… với tác dụng giúp Nam giới tăng cƣờng chức sinh lý sức khoẻ tình dục Các phận đƣợc sử dụng nhiều thuốc truyền thống chữa bệnh sốt rét, bệnh tiểu đƣờng, kháng lại bệnh vi sinh vật [21] tăng cƣờng chức sinh lý sức khoẻ tình dục, bổ sung lƣợng cho thể, giúp giảm stress, mệt mỏi, tăng cƣờng miễn dịch, ngăn ngừa khối u phòng chống lão hóa 1.1.2 Phân loại Giới: Plantae Ngành: Magnoliophyta Lớp: Magnoliopsida Bộ: Sapindales Họ: Simaroubaceae Chi: Eurycoma Loài: E longifolia Hình Cây Bá bệnh Tên hai phần: Eurycoma longifolia Jack data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read ... định nuôi cấy tế bào huyền phù mô sẹo Xuất phát từ ƣu điểm hợp chất dƣợc lý quý Bá bệnh chủ yếu thu đƣợc từ rễ, thực đề tài: Nghiên cứu xây dựng qui trình tạo sinh khối thông qua hệ thống nuôi cấy. .. ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT - - LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH TẠO SINH KHỐI THÔNG QUA HỆ THỐNG NUÔI CẤY... Nghiên cứu sở khoa học thực nghiệm việc tạo sinh khối bá bệnh làm nguyên liệu dƣợc thực phẩm chức công nghệ nuôi cấy rễ tơ Mục tiêu cụ thể: - Thu thập đƣợc mẫu Bá Bệnh làm nguyên liệu cho nuôi cấy