Nghiên cứu xây dựng qui trình tạo sinh khối thông qua hệ thống nuôi cấy rễ tơ của cây bá bệnh (Eurycoma longifolia)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT  HOÀNG HÀ NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH TẠO SINH KHỐI THÔNG QUA HỆ THỐNG NUÔI CẤY RỄ TƠ CỦA CÂY BÁ BỆNH (Eurycoma longifolia) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2012 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT  LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH TẠO SINH KHỐI THÔNG QUA HỆ THỐNG NUÔI CẤY RỄ TƠ CỦA CÂY BÁ BỆNH (Eurycoma longifolia) Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 624230 Học viên: Hoàng Hà Hƣớng dẫn khoa học: PGS. TS. Chu Hoàng Hà Hà Nội - 2012 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến những người đã hướng dẫn, giúp đỡ tận tình để tôi hoàn thành luận văn này: Người thầy của tôi, PGS. TS. Chu Hoàng Hà, Phó Viện trưởng Viện công nghệ sinh học, trưởng phòng Công nghệ Tế bào Thực vật - Viện Công nghệ Sinh học, đã hướng dẫn và hỗ trợ tận tình, truyền đạt kiến thức, những kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình thực hiện đề tài. GS. TS. Lê Trần Bình, TS Lê Văn Sơn, TS. Phạm Bích Ngọc, CN. Nguyễn Đình Trọng và cán bộ phòng Công nghệ Tế bào Thực vật đã chỉ bảo tận tình về chuyên môn, luôn theo sát thí nghiệm của tôi để có những lời khuyên bổ ích và kịp thời. Trong những năm học tập và nghiên cứu tại phòng Công nghệ tế bào thực vật, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm giúp đỡ, động viên chân thành của tập thể cán bộ phòng. Các thực tập sinh luôn thân thiện, nhiệt tình, tạo nên một môi trường nghiên cứu chủ động, hăng say. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu này. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến phòng Tổng hợp hữu cơ Viện Hóa học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, phòng Sắc ký khối phổ phân giải cao - khoa Hóa học - Đại học Khoa học tự nhiên đã tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành đề tài. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến các thầy cô giáo tại cơ sở viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong thời gian học tập vừa qua. Bằng tình cảm chân thành, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè đã luôn ở bên, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn này. Hà Nội, tháng 8 năm 2012 Học viên Hoàng Hà Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn NHỮNG KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT API Atmospheric Pressure Ionization Bp Base pairs CTAB Cetyl trimethylammonium bromide COI Cytochrome c oxidase subunit I dNTP 2‟- deoxyribonucleoside - 5‟triphosphate EDTA Ethylene diamine tetra acetic acid ITS Internal Transcribed Spacer Kb Kilobase MS Mass Spectrometry MS Murashige and Skoog WPM Woody Plant Medium Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY BÁ BỆNH 4 1.1.1. Giới thiệu và phân bố địa lý 4 1.1.2. Phân loại 4 1.1.3. Hình thái 5 1.1.4. Tác dụng dƣợc lý của cây bá bệnh 5 1.1.5. Tính cấp thiết nghiên cứu, bảo tồn và sản xuất bền vững cây bá bệnh 6 1.2. NUÔI CẤY SINH KHỐI RỄ TƠ - GIẢI PHÁP TẠO NGUỒN DƢỢC PHẨM SẠCH PHỤC VỤ SỨC KHỎE CỘNG ĐỒNG 6 1.2.1. Giới thiệu về nuôi cấy sinh khối tế bào 6 1.2.2. Giới thiệu về Agrobacterium rhizogenes - phƣơng pháp tạo rễ tơ ở tế bào thực vật 8 1.2.3. Cơ chế chuyển các gen vùng T-DNA vào tế bào thực vật 8 1.2.4. Nuôi cấy sinh khối rễ tơ 10 1.3. CÁC NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CHỈ THỊ DNA VÀO VIỆC ĐỊNH DANH LOÀI 13 1.4. PHƢƠNG PHÁP KHỐI PHỔ (MASS SPECTROMETRY-MS) 15 Chương 2: VẬT LIỆU - PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1. VẬT LIỆU 18 2.2. DỤNG CỤ - HÓA CHẤT 18 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.3.1. Thu thập và định danh loài bằng chỉ thị phân tử 18 2.3.2. Phƣơng pháp khử trùng hạt và đƣa mẫu vào nuôi cấy in vitro 19 2.3.3. Phƣơng pháp chuyển gen thông qua Agrobacterium rhizogenes 20 2.3.4. Đánh giá các dòng rễ tơ chuyển gen trong phòng thí nghiệm 20 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 3.1. THU THẬP VÀ ĐỊNH DANH LOÀI BÁ BỆNH BẰNG CHỈ THỊ DNA 26 3.1.1. Thu thập mẫu 26 3.1.2. Định danh loài bằng chỉ thị DNA 27 3.2. KẾT QUẢ KHỬ TRÙNG HẠT VÀ ĐƢA CÁC MẪU BÁ BỆNH VÀO NUÔI CẤY IN VITRO LÀM NGUYÊN LIỆU CHO NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO VÀ CHUYỂN GEN TẠO RỄ TƠ 31 3.3. TỐI ƢU HÓA QUY TRÌNH CHUYỂN GEN VÀ TIẾN HÀNH CHUYỂN GEN TẠO RỄ TƠ THÔNG QUA Agrobacterium rhizogenes 33 3.3.1. Tối ƣu hóa quy trình chuyển gen thông qua A. rhizogenes 33 3.3.2. Kết quả chuyển gen tạo rễ tơ thông qua vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes 35 3.3.3. Kết quả thử nghiệm các môi trƣờng nuôi cấy rễ tơ bá bệnh 37 3.3.4. Các hình thái của rễ tơ bá bệnh 39 3.3.5. Kiểm tra các dòng rễ tơ chuyển gen 40 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3.3.6. Kết quả nuôi sinh khối rễ tơ cây bá bệnh trên môi trƣờng WPM lỏng 42 3.4. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH CÁC HỢP CHẤT THỨ CẤP CÓ TRONG DÒNG RỄ TƠ BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ BẢN MỎNG VÀ KHỐI PHỔ KẾ 42 3.4.1. Kết quả sắc ký bản mỏng 42 3.4.2. Kết quả phân tích hợp chất tự nhiên của rễ bá bệnh 43 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 Luận văn Thạc sỹ Hoàng Hà 1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Cây bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack) hay Tongkat Ali là cây thảo dƣợc phân bố chủ yếu ở khu vực Đông Nam Á. Cây Bá bệnh là cây thuốc quý hiếm với khả năng trị bách bệnh, đã đƣợc tìm thấy ở Việt Nam tại Vƣờn quốc gia Bái Tử Long từ năm 2000, mọc tự nhiên ở hầu hết các diện tích đất rừng tại đây. Trên thế giới, từ lâu cây này đã đƣợc biết đến nhƣ là nhân sâm Malaysia, cũng nhƣ tại nhiều nƣớc Đông Nam Á nhƣ Indonesia, Brunei, Thái lan, Cămpuchia, Lào… với tác dụng giúp nam giới tăng cƣờng chức năng sinh lý và sức khoẻ tình dục. Các bộ phận của cây đƣợc sử dụng nhiều trong các bài thuốc truyền thống chữa các bệnh sốt rét, bệnh tiểu đƣờng, kháng lại các bệnh do vi sinh vật và tăng cƣờng chức năng sinh lý và sức khoẻ tình dục, bổ sung năng lƣợng cho cơ thể, giúp giảm stress, mệt mỏi, tăng cƣờng miễn dịch, ngăn ngừa khối u và phòng chống lão hoá. Các hợp chất có hoạt tính sinh học đã đƣợc tìm thấy từ các bộ phận khác nhau của cây nhƣ eurycomaoside, eurycolactone, eurycomalactone, eurycomanone, và pasakbumin-B, cùng với các alkaloid và quassinoid. Cây Bá bệnh đã đƣợc sản xuất và sử dụng dƣới dạng thực phẩm chức năng tại nhiều nƣớc ở châu Á, Tây Âu và Hoa Kỳ. Ở Việt Nam, các kết quả nghiên cứu ban đầu của các nhà khoa học trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội vào năm 2006 cho thấy cây bá bệnh tại Việt Nam cũng có tác dụng không thua kém các nƣớc trong khu vực. Hiện nay, giá trị y dƣợc quý của cây Bá bệnh đã đƣợc nhiều ngƣời biết đến; do đó cần quản lý và sử dụng các phƣơng pháp khoa học để khai thác bền vững nguồn tài nguyên này. Trƣớc tình hình trên, bên cạnh việc nghiên cứu giá trị của cây Bá Bệnh ở Việt Nam, phân tích tác dụng dƣợc lý để đƣa ra những hƣớng dẫn chiết xuất, sử dụng phù hợp với sức khoẻ cộng đồng, cần sớm nghiên cứu áp dụng nuôi cấy sinh khối tế bào thực vật tạo nguồn nguyên liệu ổn định, đáp ứng nhu cầu làm thuốc. Những năm gần đây, cùng với xu hƣớng chung trên thế giới, ở nƣớc ta hƣớng nghiên cứu công nghệ sinh khối tế bào thực vật để sản xuất các sản phẩm thứ cấp đã bắt đầu đƣợc quan tâm đầu tƣ phát triển. Tuy nhiên quá trình nuôi cấy tạo sinh khối tế bào thực vật nhằm làm giảm hoặc mất tính biệt hóa ở các mô tế bào Luận văn Thạc sỹ Hoàng Hà 2 nuôi cấy cần bổ sung các chất điều hòa sinh trƣởng vào trong môi trƣờng nuôi cấy. Vấn đề này là một trong những trở ngại lớn do tồn dƣ của các chất điều hòa sinh trƣởng trong sinh khối tế bào nuôi cấy ảnh hƣởng trực tiếp đến sản phẩm và sức khỏe ngƣời sử dụng. Việc này hoàn toàn có thể khắc phục trong nuôi cấy sinh khối từ rễ tơ. Rễ tơ là một bệnh ở thực vật đƣợc gây ra bởi quá trình tƣơng tác giữa vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes và tế bào vật chủ. Rễ tơ có khả năng sinh trƣởng nhanh, phát triển tốt trên môi trƣờng không cần bổ sung các chất điều hòa sinh trƣởng và có thể nuôi cấy tạo sinh khối liên tục điều này có ý nghĩa trong dây chuyền sản xuất các hợp chất thứ cấp hay các dƣợc phẩm sinh học tái tổ hợp. Rễ tơ có thể sản xuất một lƣợng lớn các hợp chất thứ cấp và là cơ quan biệt hóa nên rễ tơ có sự di truyền ổn định hơn nuôi cấy tế bào huyền phù và mô sẹo. Xuất phát từ các ƣu điểm trên và do hợp chất dƣợc lý quý của Bá bệnh chủ yếu thu đƣợc từ rễ, chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu xây dựng qui trình tạo sinh khối thông qua hệ thống nuôi cấy rễ tơ của cây bá bệnh (Eurycoma longifolia)”. Công trình này đƣợc thực hiện tại phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2. Mục đích nghiên cứu Mục tiêu tổng quát: Nghiên cứu cơ sở khoa học và thực nghiệm của việc tạo sinh khối cây bá bệnh làm nguyên liệu dƣợc và thực phẩm chức năng bằng công nghệ nuôi cấy rễ tơ. Mục tiêu cụ thể: - Thu thập đƣợc mẫu cây Bá Bệnh làm nguyên liệu cho nuôi cấy mô tế bào và chuyển gen tạo rễ tơ. - Tối ƣu hóa đƣợc quy trình chuyển gen thông qua Agrobacterium rhizogenes và tạo đƣợc các dòng rễ tơ. - Đánh giá điều kiện nuôi cấy và chọn lọc đƣợc một số dòng rễ tơ có khả năng sinh trƣởng nhanh để nuôi cấy tạo sinh khối. - Bƣớc đầu đánh giá hàm lƣợng hoạt chất của sản phẩm nuôi cấy thu đƣợc so với dƣợc liệu tự nhiên. 3. Nội dung nghiên cứu - Thu thập và định danh mẫu cây bá bệnh bằng chỉ thị phân tử - Đƣa mẫu cây bá bệnh vào nuôi cấy in vitro Luận văn Thạc sỹ Hoàng Hà 3 - Nghiên cứu tối ƣu quy trình chuyển gen sử dụng Agrobacterium rhizogenes, tạo rễ tơ bá bệnh và xác định các điều kiện môi trƣờng thích hợp cho sinh trƣởng - Đánh giá sơ bộ hàm lƣợng hoạt chất của sản phẩm nuôi cấy thu đƣợc so với dƣợc liệu tự nhiên . 4. Ý nghĩa khoa học Làm cơ sở cho việc sản xuất quy mô công nghiệp sinh khối rễ tơ cây bá bệnh cho mục đích làm nguyên liệu dƣợc và thực phẩm chức năng. Luận văn Thạc sỹ Hoàng Hà 4 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về cây bá bệnh 1.1.1. Giới thiệu và phân bố địa lý Cây bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack) hay Tongkat Ali là cây thảo dƣợc phân bố chủ yếu ở khu vực Đông Nam Á. Bá bệnh là một cây thuốc đƣợc sử dụng trong dân gian từ rất lâu, nó còn đƣợc gọi với những cái tên khác đó là: cây mật nhân, hay cây bách bệnh. Tại Việt Nam bá bệnh có mặt trong vƣờn quốc gia Bái Tử Long, khu Bảo tồn thiên nhiên Đồng Sơn- Kỳ Thƣợng, Hoành Bồ, Quảng Ninh, một số rừng ở Tây Nguyên . Cây Bá bệnh từ lâu đã đƣợc biết đến nhƣ là nhân sâm Malaysia, cũng nhƣ tại nhiều nƣớc Đông Nam Á nhƣ Indonesia, Brunei, Thái lan, Cămpuchia, Lào… với tác dụng giúp Nam giới tăng cƣờng chức năng sinh lý và sức khoẻ tình dục. Các bộ phận của cây đƣợc sử dụng nhiều trong các bài thuốc truyền thống chữa các bệnh sốt rét, bệnh tiểu đƣờng, kháng lại các bệnh do vi sinh vật [21] và tăng cƣờng chức năng sinh lý và sức khoẻ tình dục, bổ sung năng lƣợng cho cơ thể, giúp giảm stress, mệt mỏi, tăng cƣờng miễn dịch, ngăn ngừa khối u và phòng chống lão hóa. 1.1.2. Phân loại Giới: Plantae Ngành: Magnoliophyta Lớp: Magnoliopsida Bộ: Sapindales Họ: Simaroubaceae Chi: Eurycoma Loài: E. longifolia Tên hai phần: Eurycoma longifolia Jack Hình 1. Cây Bá bệnh [...]... Đã có rất nhiều nghiên cứu thành công trong tạo các hoạt chất từ nuôi cấy sinh khối rễ tơ [3, 4] Hình ảnh một số rễ tơ đƣợc nuôi cấy trong các môi trƣờng lỏng và môi trƣờng đặc: Hình 4 Các hệ rễ tơ đƣợc nuôi cây 1 Rễ tơ Beta vulgaris phát triển trên môi trƣờng agar 2 Rễ tơ của cây đậu phộng (Arachis hypogaea) 3 Rễ tơ G glabra nuôi trong môi trƣờng lỏng 4 Nuôi cấy rễ tơ G.glabra bằng hệ thống bioreactor... cây bá bệnh tại vƣờn quốc gia Bái Tử Long Kết quả đã thu nhận đƣợc 30 cây Bá bệnh tại vƣờn ƣơm phù hợp với mục đích nghiên cứu Hình 7 Một số hình ảnh cây bá bệnh tại vƣờn quốc gia Bái Tử Long: A) Cây mọc tự nhiên trong vƣờn; B & C) Cây trồng trong vƣờn ƣơm 26 Luận văn Thạc sỹ Hoàng Hà Trong nghiên cứu này, ngoài mẫu cây bá bệnh, mẫu hạt cây bá bệnh cũng đƣợc thu thập tại vƣờn quốc gia Bái Tử Long Bá. .. việc nghiên cứu giá trị của cây bá bệnh ở Việt Nam, phân tích tác dụng dƣợc lý để đƣa ra những hƣớng dẫn chiết xuất, sử dụng phù hợp với sức khoẻ cộng đồng, cần sớm nghiên cứu áp dụng nuôi cấy sinh khối tế bào thực vật tạo nguồn nguyên liệu ổn định, đáp ứng nhu cầu làm thuốc 1.2 Nuôi cấy sinh khối rễ tơ - giải pháp tạo nguồn dƣợc phẩm sạch phục vụ sức khỏe cộng đồng 1.2.1 Giới thiệu về nuôi cấy nuôi cấy. .. ứng dụng nuôi cấy sinh khối tế bào từ nhân sâm trong sản xuất các sản phẩm chức năng hay làm thuốc bổ, thuốc phòng chống bệnh tim mạch, chống gốc tự do, tăng cƣờng chức năng hệ thần kinh trung ƣơng, các loại mỹ phẩm [2, 23, 37, 38] Trong khi đó, có rất ít nghiên cứu về nuôi cấy sinh khối tế bào cây bá bệnh Gần đây, nhóm nghiên cứu của Maziah và cs (2009) đã thành công trong nuôi cấy cảm ứng tạo hoạt... cao Nghiên cứu của Lodhi (1996) đã chứng minh rằng hàm lƣợng anthraquinone và alizarin trong hệ thống nuôi cấy rễ tơ của Rubia peregrina L tăng cao khi gắn đoạn gen mã hóa ra enzyme isochorismate synthase vào đoạn T-DNA; và theo Banerjee (2002) thì rễ tơ của A belladonna đƣợc chuyển gen P450 2E1 thể hiện khả năng tổng hợp chất tự nhiên với mức độ rất cao [39] Với tiềm năng to lớn của hệ thống rễ tơ, ... 9-methoxycanthin-6-one từ mô sẹo [30] Trong quá trình nuôi cấy tạo sinh khối tế bào thực vật nhằm giảm hoặc mất tính biệt hóa ở các mô tế bào nuôi cấy cần thiết bổ sung các chất điều tiết sinh trƣởng vào trong môi trƣờng nuôi cấy Vấn đề này là một trong những trở ngại lớn làm nản lòng các nhà nghiên cứu do tồn dƣ của các chất điều tiết sinh trƣởng trong sinh khối tế bào nuôi cấy ảnh hƣởng trực tiếp đến sản phẩm... chuyển động này của ion Nếu biết đƣợc điện tích của ion thì ta dễ dàng xác định đƣợc khối lƣợng của ion đó [45] Nhƣ vậy, trong nghiên cứu khối phổ của bất kỳ chất nào, trƣớc tiên nó phải đƣợc chuyển sang trạng thái bay hơi, sau đó đƣợc ion hoá bằng các phƣơng pháp thích hợp Các ion tạo thành đƣợc đƣa vào nghiên cứu trong bộ phân tích khối của máy khối phổ Tùy theo loại điện tích của ion nghiên cứu mà ngƣời... Mẫu hạt cây Bá Bệnh thu thập đƣợc tại vƣờn quốc gia Bái Tử Long 3.1.2 Định danh loài bằng chỉ thị DNA Hệ gen lục lạp có tính bảo thủ cao và mang tính đặc thù của từng loài do vậy việc sử dụng các kết quả phân tích hệ gen lục lạp vào nghiên cứu phát sinh loài và phân loại thực vật đƣợc các nhà khoa học rất quan tâm Dựa trên những thông tin có sẵn từ các nghiên cứu về phát sinh loài và các nghiên cứu gần... tài nguyên Vƣờn quốc gia Bái Tử Long đã đề xuất đề tài nhân giống bảo tồn cây bá bệnh và nhận đƣợc sự ủng hộ của Sở Khoa học Công nghệ tỉnh Quảng Ninh Đến nay tại Vƣờn quốc gia Bái Tử Long đã thực hiện thành công việc nhân giống và trồng thử nghiệm thành công loài cây bá Bệnh bằng hai phƣơng pháp cây giâm hom và cây mọc từ hạt Một quy trình tạm thời gieo ƣơm và trồng cây bá bệnh bƣớc đầu đã thành công,... môi trƣờng WPM lỏng Phần gốc cây Bá bệnh cấy tiếp vào môi trƣờng MG tiếp tục giữ giống cây Phƣơng pháp chuyển gen tạo rễ tơ ở cây bá bệnh thông qua vi khuẩn A rhizogenes ATCC15834 bao gồm các bƣớc chính nhƣ sau:  Chuẩn bị chủng A rhizogenes ATCC15834 một ngày trƣớc khi biến nạp, nuôi một khuẩn lạc vào 5 ml YMP lỏng có bổ sung, nuôi lắc 200 v/p ở 28oC Hút 1 ml dịch khuẩn nuôi lỏng ở trên cho vào 50 . hiện đề tài: Nghiên cứu xây dựng qui trình tạo sinh khối thông qua hệ thống nuôi cấy rễ tơ của cây bá bệnh (Eurycoma longifolia) . Công trình này đƣợc thực hiện tại phòng Công nghệ Tế bào Thực. ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT  HOÀNG HÀ NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH TẠO SINH KHỐI THÔNG QUA HỆ THỐNG NUÔI CẤY. ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT  LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH TẠO SINH KHỐI THÔNG QUA HỆ THỐNG