Giống nhƣ Ti-plasmid, Ri-plasmid là phân tử DNA mạch vòng, sợi kép có trọng lƣợng phân tử lớn từ 200 - 800 kp gồm 2 vùng chính là T-DNA và vir (virulence). Vùng TR-DNA mang các gen mã hóa sinh tổng hợp auxin (tms1 và
tms2), vùng TL-DNA bao gồm 18 khung đọc mở (ORFs), trong đó có 4 loci 10, 11, 12 và 15 mã hóa cho rolA, B, C và D (root locus) [17].
Để kiểm tra sự có mặt của T-DNA của Ri-plasmid ở các dòng rễ tơ chuyển gen, chúng tôi đã tiến hành phản ứng PCR nhân đoạn gen rol A, rol B và rolC từ DNA tổng số của các dòng rễ tơ bằng cặp mồi đặc hiệu.
Kết quả thu đƣợc ở nhƣ sau:
Với cặp mồi Rol A: chúng tôi thu đƣợc 15 dòng/20 dòng có dƣơng tính với phản ứng PCR. Sản phẩm PCR cho bănng đặc hiệu với kích thƣớc 404bp. Trong đó các dòng có kiểu rễ HR-M có 06 dòng ( D1, D2, D3, D5, D6, D7) kiểu rễ C-M có 4 (D12, D13, D14, -D15), kiểu rễ T-M có 5 dòng ( D16, D17, D18, D19, D20) cho phản ứng dƣơng tính với phản ứng PCR.
41
Hình 16. Kiểm tra sự có mặt của Rol A trong các dạng rễ bá bệnh
Với cặp mồi RolB, rolC cho kết quả giống với kết quả kiểm tra rol A thu đƣợc 15 dòng cho phản ứng dƣơng tính với PCR. Sản phẩm PCR thu đƣợc đặc hiệu có kích thƣớc 700 bp và 480 bp.
42
Do đó, chúng tôi chọn 15 dòng rễ cho phản ứng dƣơng tính với phản ứng PCR để tiếp tục chuyển sang hệ thống nuôi lỏng để tạo ra hợp chất tự nhiên nhƣ tính toán lý thuyết.
3.3.6. Kết quả nuôi sinh khối rễ tơ cây bá bệnh trên môi trƣờng WPM lỏng
Chuyển các mẫu nuôi từ đĩa sang các bình trụ nuôi lắc (70 vòng/phút) có chứa môi trƣờng WPM lỏng + Cefo500. Sử dụng loại bình trụ để thuận tiện cho quá trình chuyển và nuôi cấy rễ tơ. Sau 2 tuần nuôi cấy trong bình trụ, rễ tơ của cây bá bệnh phát triển mạnh .
Hình 18. Nuôi cấy rễ tơ trong bình trụ
Kết quả ban đầu nhận thấy hệ thống rễ tơ phát triển mạnh về sinh khối trong các bình trụ. Các dòng rễ nuôi lắc trong 3 tuần sẽ đƣợc thu lại làm khô và kiểm tra thành phần các hợp chât tự nhiên tạo ra đƣợc.