44
Để xác định khối lƣợng phân tử chính xác thƣờng phải xác định chính xác pic nào của ion phân tử M+H , bên cạnh pic nào của ion phân tử thƣờng có pic của ion phân tử M+2H, M+3H..Khi biết đƣợc công thức phân tử có thể xác định đƣợc công thức cấu tạo của hợp chất bằng trên cơ sở dữ liệu đã có và nghiên cứu kĩ các mảnh ion và con đƣờng phân cắt của phân tử từ đó dự đoán đƣợc công thức cấu tạo của hợp chất trƣớc khi bị phá vỡ .
Trong khuôn khổ luận văn này chúng tôi tiến hành tìm các pịc của ion phân tử M+H, M+2H, M+3H từ đó suy ra công thức phân tử của chất có khả năng có trong rễ của rễ chuyển gen và rễ tự nhiên.
Sử dụng phƣơng pháp sắc ký lỏng ghép nối đầu dò khối phổ (LCMS) chúng tôi thu đƣợc các pic phân tử của các chất (Hình 20).
Hình 20. Sắc ký đồ của hợp chất rễ tơ
Qua phân tích và so sánh với các chất ở tài liệu tham khảo 45, chúng tôi thu đƣợc 21 chất có khả năng thuộc nhóm chất tách đƣợc từ E. longifolia. Trong đó, rễ chuyển gen thu đƣợc 18 chất với 8 chất có thể thuộc nhóm quassinoids và 10 chất có thể thuộc nhóm alkaloids. Với rễ cây tự nhiên thu đƣợc 15 chất, trong đó có 8 có thể chất thuộc nhóm quassinoids và 7 chất có thể thuộc nhóm alkaloids. Những chất đƣợc tìm thấy ở cả hai loại rễ chuyển gen và tự nhiên là 13 chất.
45
tự nhiên giống với rễ của cây bá bệnh ngoài tự nhiên. Tỷ lệ giống với mẫu tự nhiên là 13/21 (61%).
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Kết luận:
1. Đã thu thập và định dạng chính xác bằng chỉ thị phân tử các các mẫu cây Bá bệnh thu tại Quảng Ninh.
2. Tối ƣu quy trình chuyển gen thông qua Agrobacterium rhizogenes: nồng độ kháng sinh cefotaxime 500mg/l, mật độ vi khuẩn OD = 0,4 trong môi trƣờng WPM cho tỷ lệ tạo rễ tơ ở mỗi lô thí nghiệm cao nhất là 71% và thấp nhất là 64,5% .
3. Tạo đƣợc 20 dòng rễ tơ với các hình thái khác nhau ( rễ tơ lông nhỏ, rễ tơ to không phân nhánh, rễ tơ dạng mô sẹo). Trong đó có 15 dòng cho phản ứng dƣơng tính với phản ứng PCR.
4. Xác định đƣợc môi trƣờng nuối cấy giúp rễ tơ tăng trƣởng nhanh là WPM lỏng
5. Bằng phƣơng pháp phân tích khối phổ LCMS bƣớc đầu tìm đƣơc các hợp chất thứ cấp tạo ra của rễ chuyển gen cụ thể: 18 chất thứ cấp đƣợc tìm thấy trong đó 8 chất cố thể thuộc nhóm quassinoids và 10 chất có thể thuộc nhóm alkaloids. Với rễ cây tự nhiên thu đƣợc 15 chất thứ cấp, trong đó có 8 chất có thể thuộc nhóm quassinoids và 7 chất có thể thuộc nhóm alkaloids. Những chất đƣợc tìm thấy ở cả hai loại rễ chuyển gen và tự nhiên là 13 chất. Vậy rễ cây chuyển gen cũng có những hợp chất thứ cấp giống rễ tự nhiên.
46
1. Tiếp tục tối ƣu qui trình tạo rễ tơ với mục đích thu đƣợc sinh khối lớn nhất và dƣợc tính cao nhất.
2. Ứng dụng công nghệ tạo sinh khối thông qua nuôi cấy với các cây thuốc. Đây là một hƣớng tiềm năng có giá trị ứng dụng cao trong sản xuất dƣợc liệu tại Việt Nam.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1. Bộ Y tế (1996). "Ðịnh hƣớng chiến lƣợc công tác chăm sóc và bảo vệ sức khoẻ nhân dân đến năm 2000 và 2020". Tạp chí Dƣợc học 8(2).
2. Nguyễn Ánh Hồng (2000), Cơ sở Khoa học Công nghệ chuyển gen ở thực vật, NXB Nông nghiệp Hà Nội.
3. Phạm Gia Huệ, Mass Spectrometry & LC-MS, bài giảng khối phổ.
4. Nguyễn Văn Minh và cs (2010). Báo cáo tổng kết đề tài: “Hợp tác nghiên cứu xây dựng quy trình tạo khối tế bào sâm Ngọc Linh làm nguyên liệu sản xuất chế phẩm phục vụ sức khỏe cộng đồng”. Học Viện Quân Y.
5. Trần Công Luận (2010). “Công nghệ sinh học thực vật với tài nguyên cây thuốc”. Kỷ yếu hội thảo quốc tế tháng 4/2010.
6. Nguyễn Đức Thành (2003), Chuyển gen ở thực vật, NXB Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội.
Tài liệu tiếng Anh
7. Ang, H. H. and H. S. Cheang (1999). "Studies on the anxiolytic activity of Eurycoma longifolia Jack roots in mice". Jpn J Pharmacol 79(4): 497-500.
8. Ang, H. H., H. S. Cheang, et al. (2000). "Effects of Eurycoma longifolia Jack (Tongkat Ali) on the initiation of sexual performance of inexperienced castrated male rats". Exp Anim 49(1): 35-38.
9. Ang, H. H., K. L. Chan, et al. (1995). "In vitro antimalarial activity of quassinoids from Eurycoma longifolia against Malaysian chloroquine-resistant Plasmodium falciparum isolates". Planta Med 61(2): 177-178.
47
10.Ang, H. H., S. Ikeda, et al. (2001). "Evaluation of the potency activity of aphrodisiac in Eurycoma longifolia Jack". Phytother Res 15(5): 435-436.
11.Asada, Y., H. Saito, et al. (1993). "Biotransformation of 18 beta-glycyrrhetinic acid by ginseng hairy root culture". Phytochemistry 34(4): 1049-1052.
12.Bhat, R. and A. A. Karim (2010). "Tongkat Ali (Eurycoma longifolia Jack): A review on its ethnobotany and pharmacological importance". Fitoterapia.
13.Britton, M. T., M. A. Escobar, et al. (2008). “The oncogenes of Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes”. Agrobacterium: From Biology to Biotechnology. T. Tzfira and V. Citovsky. New York. Springer: 524-565.
14.Cardarelli, M., L. Spanò, et al. (1987). "The role of auxin in hairy root induction". Mol Gen Genet 208(3): 457-463.
15.Chan, K. L., C. Y. Choo, et al. (2004). "Antiplasmodial studies of Eurycoma longifolia Jack using the lactate dehydrogenase assay of Plasmodium falciparum". J Ethnopharmacol 92(2-3): 223-227.
16.Chawla HS (2003). Introduction plant biotechnology. Amazone Press
17.Chilton, M. D., D. A. Tepfer, et al. (1982). "Agrobacterium rhizogenes inserts T-DNA into the genomes of the host plant root cells". Nature 295: 432-434. 18.Christey, M. C. (2001). "Use of Ri-mediated transformation for production of
transgenic plants". In Vitro Cell. Dev. Biol-Plant 37: 687-700.
19.Dodds JH, Roberts LW. (1995). Experiments in Plant Tissue Culture, Cambridge University Press - England
20.Duc, N. M., R. Kasai, et al. (1994). "Saponins from Vietnamese ginseng, Panax vietnamensis Ha et Grushv. collected in central Vietnam. III". Chem Pharm Bull (Tokyo) 42(3): 634-640.
21.Farouk, A. E. and A. Benafri (2007). "Antibacterial activity of Eurycoma longifolia Jack. A Malaysian medicinal plant". Saudi Med J 28(9): 1422-1424.
22.H. T. Dung và I. V. Grushvitsky, Tạp chí Thực vật, 4, 518 (1985).
23.Jeong, G. T., D. H. Park, et al. (2002). "Studies on mass production of transformed Panax ginseng hairy roots in bioreactor". Appl Biochem Biotechnol
98-100: 1115-1127.
24.Jeong, G. T., D. H. Park, et al. (2005). "Production of antioxidant compounds by culture of Panax ginseng C.A. Meyer hairy roots: I. Enhanced production of secondary metabolite in hairy root cultures by elicitation". Appl Biochem Biotechnol 121-124: 1147-1157.
48
25.Kardono, L. B., C. K. Angerhofer, et al. (1991). "Cytotoxic and antimalarial constituents of the roots of Eurycoma longifolia". J Nat Prod 54(5): 1360-1367. 26.Kawaguchi, K., M. Hirotani, et al. (1990). "Biotransformation of digitoxigenin
by ginseng hairy root cultures". Phytochemistry 29(3): 837-843.
27.Kuo, P. C., A. G. Damu, et al. (2004). "Cytotoxic and antimalarial constituents from the roots of Eurycoma longifolia". Bioorg Med Chem 12(3): 537-544. 28.Kurata, H., T. Achioku, et al. (1998). "Intermittent light irradiation with a
second-scale interval enhances caffeine production by coffea arabica cells". Biotechnol Prog 14(5): 797-799.
29.Liu J., J. Y. Ding, et al. (2004). "Studies on influence of fungal elicitor on hairy root of Panax ginseng biosynthesis ginseng saponin and biomass". China journal of chinese materia medica 29(4): 302-305.
30.Maziah, M. and N. Rosli (2009). "The Production of 9-methoxycanthin-6-one from Callus Cultures of (Eurycoma longifolia Jack) Tongkat Ali". Methods Mol Biol 547: 359-369.
31.Muller, M. J. and M. H. Zenk (1992). "The Norcoclaurine Pathway is Operative in Berberine Biosynthesis in Coptis japonica". Planta Med 58(6): 524-527.
32.N. M. Duc, N. T. Nham, R. Kasai, A. Ito, K. Yamasaki and O. Tanaka, Chem.
Pharm. Bull., 41, 2010 (1993).
33.N. M. Duc, R. Kasai, K. Ohtani, A. Ito, N. T. Nham, K. Yamasaki and O. Tanaka, Chem. Pharm.Bull., 42, 115 (1994)
34.N. M. Duc, R. Kasai, K. Ohtani, A. Ito, N. T. Nham, K. Yamasaki and O. Tanaka,Chem. Pharm. Bull., 42, 634 (1994).
35.N. M. Duc, R. Kasai, K. Ohtani, A. Ito, N. T. Nham, K. Yamasaki and O. Tanaka (1996). "New saponins from Vietnamese ginseng: Highlights on biogenesis of dammarane triterpenoids". Advances in Experimental Medicine
and Biology 404:129-149, ed. by G. R. Waller and K. Yamasaki, Plenum Press,
New York and London.
36.N. M. Duc, R. Kasai, N. T. Nham, K. Yamasaki and O. Tanaka (1997).
"Saponin composition of Vietnamese ginseng and its significance from pharmacognostical points of view", Proceedings of "The First Indochina Conference on Pharmaceutical Sciences: Pharmacy in Harmony", May 20-23, 1997, Bangkok, Thailand.
49
37.N. T. Nham, P. V. De, T. C. Luan, N. M. Duc, S. Shibata, O. Tanaka and R. Kasai (1995). “Pharmacognostical and chemical studies on Vietnamese ginseng,
Panax vietnamensis Ha et Grushv. (Araliaceae)”. J. Jpn. Bot. 70(1).
38.Nguyen, M. D., T. N. Nguyen, et al. (1993). "Saponins from Vietnamese ginseng, Panax vietnamensis Ha et Grushv. Collected in central Vietnam. I". Chem Pharm Bull (Tokyo) 41(11): 2010-2014.
39.Nurhanan, M. Y., L. P. Azimahtol Hawariah, et al. (2005). "Cytotoxic effects of the root extracts of Eurycoma longifolia Jack". Phytother Res 19(11): 994-996. 40.Osman, A., B. Jordan, et al. (2003). "Genetic diversity of Eurycoma longifolia
inferred from single nucleotide polymorphisms". Plant Physiol 131(3): 1294- 1301.
41.Palazon, J., A. Mallol, et al. (2003). "Growth and ginsenoside production in hairy root cultures of Panax ginseng using a novel bioreactor". Planta Med
69(4): 344-349.
42.Palazón, J., R. M. Cusidó, et al. (1997). "Effect of rol genes from
Agrobacterium rhizogenes TL-DNA on nicotine production in tobacco root cultures". Plant Physiol Biochem 35: 155-162.
43.Pham NB (2009). Production and secretion of recombinant sweet-tasting thaumatin from suspension cells and hairy roots of Nicotiana tabacum. University of Heidelberg. PhD Thesis.
44.Kress W. J., Erickson D. L. (2008). “DNA barcodes: Genes, genomics, and bioinformatics”. Proc Natl Acad Sci USA 105(8): 2761-2762.
45.Lee Suan Chua, Nor Amaiza Mohd Amin, Jason Chun Hong Neo, Ting Hun Lee, Chew Tin Lee, Mohamad Roji Sarmidi, Ramlan Abdul Aziz (2011). “LC–MS/MS-based metabolites of Eurycoma longifolia (Tongkat Ali) in Malaysia (Perak and Pahang)”. Journal of Chromatography B 879: 3909-3919.
46.Sevon, N. and K. M. Oksman-Caldentey (2002). "Agrobacterium rhizogenes- mediated transformation: root cultures as a source of alkaloids". Planta Med
68(10): 859-868.
47.Van DeWiel C. C. M., Van Der Schoot J., Van Valkenburg J. L., Duistermaat C. H., Smulders (2009). “DNA barcoding discriminates the noxious invasive plant species, floating pennywort (Hydrocotyle ranunculoides L.f.), from non-invasive relatives”. Molecular Ecology Resources 9:1086-1091.
50
48.Woo, S. S., J. S. Song, et al. (2004). "Selection of high ginsenoside producing ginseng hairy root lines using targeted metabolic analysis". Phytochemistry
65(20): 2751-2761.
49.Yoshikawa, T., Y. Asada, et al. (1993). "Continuous production of glycosides by a bioreactor using ginseng hairy root culture". Appl Microbiol Biotechnol 39(4): 460-464.
50.Zhao, M. Q., J. Y. Ding, et al. (2001). "Studies on the arbutin biosynthesis by hairy root of Panax ginseng C.A. Mayer". China journal of chinese materia medica 26(12): 819-822.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
PHỤ LỤC
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Phụ lục 2. Thành phần các môi trƣờng Môi
trƣờng Thành phần
YMP đặc 0,4 g/l Yeast extract + 0,5 g/l K2HPO4.3H2O + 10 g/l mannitol + 2 g/l MgSO4.7H2O + 0,1 g/l NaCl + 15 g/l bacto agar, pH = 7
YMP lỏng 0,4 g/l Yeast extract + 0,5 g/l K2HPO4.3H2O + 10 g/l mannitol +
2 g/l MgSO4.7H2O + 0,1 g/l NaCl, pH = 7 WPM đặc WPM I + WPM II + WPM III + WPM IV + WPM V + 30 g đƣờng + 8 g thạch, pH = 5,8 WPM lỏng WPM I + WPM II + WPM III + WPM IV + WPM V + 30 g đƣờng + 8 g thạch, pH = 5,8 MS đặc MS I + MS II + MS III + MS IV + MS V + 30 g đƣờng + 8 g thạch, pH = 5,8 MS lỏng MS I + MS II + MS III + MS IV + MS V + 30 g đƣờng, pH = 5,8 ½ MS MS I + MS II + MS III + MS IV + MS V, pH = 5,8 MG MS I + MS II + MS III + MS IV + MS V + 0,5mg/L GA3 + 30 g đƣờng + 8 g thạch, pH = 5,8
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Môi trƣờng WPM_ Woody Plant Medium
Muối khoáng Nồng độ Nồng độ Đa lƣợng mg/l Vi lƣợng mg/l Amonium nitrate (NH 4NO 3) 400 Boric Acid (H 3BO 3) 6.2 Calcium nitrate (Ca(NO 3) 2.4H 2O) 556 Zinc sulfate (ZnSO 4.7H 2O) 8.6 Calcium chloride (CaCl 2. 2H 2O) 96 Na 2EDTA.2H 2O 37.2 Magnesium sulfate (MgSO 4.7H 2O) 370 Cupric Sulfate (CuSO 4.5H 2O) 0.25 Potassium sulfate (K 2SO 4) 990 Ferrous sulfate (FeSO 4.7H 2O) 27.8 Potassium phospate (KH 2PO 4) 170 Manganesesulfate (MnSO 4.4H 2O) 22.3 Sodium molybdate (Na 2MoO 4.2H 2O) 0.25 Các chất hữu cơ
Myo-inositol 100 mg/l Nicotinic acid 0.5
mg/l
PyridoxineHCl 0.5 mg/l Thiamine HCl 1.0
mg/l
Glycine 2.0 mg/l Agar 6.0 g/l
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Thành phần môi trƣờng MS_Murashige & Skoog
Muối khoáng Nồng độ Nồng độ
Đa lượng (mg/l) Vi lượng (mg/l) Potasium nitrate (KNO3) 1,900 Manganese sulfate
(MnSO4. 4H2O)
22.3
Amonium nitrate (NH4NO3) 1,650 Boric Acid (H3BO3) 6.2 Calcium chloride (CaCl2.H2O) 440 Colbalt chloride (CoCl2.6H2O) 0.025 Magnesium sulfate (MgSO4.7H2O) 370 Cupric Sulfate (CuSO4.5H2O) 0.025 Potassium phosphate (KH2PO4) 170 Ferrous sulfate (FeSO4.7H2O) 27.8
Potassium Iodine (KI) 0.83 Sodium molybdate (Na2MoO4.2H2O) 0.25 Zinc Sulfate (ZnSO4.7H2O) 8.6 Na2EDTA.2H2O 37.2 Các chất hữu cơ
Myo-inositol 100 mg/l Nicotinic aAcid 0.5 mg/l Pyridoxine HCl 0.5 mg/l Thiamine HCl 0.1 mg/l IAA 1-30 mg/l Kinetin 0.04-10 Glycine (recrytallized) 2.0 g/l Edamine 1.0 g/l Sucrose 20 g/l Agar 10 g/l