Hệ gen lục lạp có tính bảo thủ cao và mang tính đặc thù của từng loài do vậy việc sử dụng các kết quả phân tích hệ gen lục lạp vào nghiên cứu phát sinh loài và phân loại thực vật đƣợc các nhà khoa học rất quan tâm. Dựa trên những thông tin có sẵn từ các nghiên cứu về phát sinh loài và các nghiên cứu gần đây, một số locus là đoạn gen hay các gen đƣợc chọn để nghiên cứu làm chỉ thị barcode tiềm năng cho các loài thực vật trên trái đất. Có khoảng 20 gen lục lạp có độ dài phù hợp (khoảng 1 kb) đƣợc sử dụng trong nghiên cứu phát sinh loài. Các gen này chứa đựng nhiều mức độ tiến hoá và vì vậy phù hợp cho nhiều mức độ phân loại [36], [38], [35]. Trong nghiên cứu này chúng tôi lựa chọn 2 trình tự gen là rbcL và matK để định danh loài Bá bệnh ở Việt Nam.
28
Trình tự gen rbcL
Trong các gen lạp thể, rbcL là trình tự gen đặc trƣng nhất, mã hóa các tiểu đơn vị lớn của rubilose - 1,5 - bisphosphate cacboxylase/ oxygenase (RUBISCO).
rbcL là gen đầu tiên đƣợc giải trình từ thực vật. rbcL đã đƣợc sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu phát sinh loài và phân loại thực vật với hơn 10000 trình tự rbcL có sẵn trong GenBank. Do sự dễ dàng trong khuếch đại PCR ở một số nhóm thực vật, CBOL gần đây đã công nhận rbcL là một trong những trình tự gen tiềm năng nhất cho các nghiên cứu DNA barcode ở thực vật. Tuy nhiên, do khả năng phân biệt loài thấp, nên hầu hết các nhóm đều cho rằng nên sử dụng kết hợp rbcL với các với các chỉ thị barcode khác, ví dụ nhƣ matK là hai locus barcode chuẩn cho thực vật [36], [37], [39].
Trình tự gen matK
Trong số các gen lục lạp, matK là một trong những gen tiến hoá nhanh nhất, có kích thƣớc khoảng 1550 bp và mã hóa cho enzyme maturase liên quan đến quá trình loại bỏ các intron loại 2 trong quá trình phiên mã RNA. Do matK tiến hoá nhanh và có mặt hầu hết trong thực vật nên đã đƣợc sử dụng nhƣ một chỉ thị trong nghiên cứu mối quan hệ giữa các loài và phát sinh loài ở thực vật. CBOL đã thử nghiệm matK trên gần 550 loài thực vật và thấy rằng 90% mẫu thực vật hạt kín dễ dàng khuếch đại trình tự bằng cách sử dụng một cặp mồi đơn và đề nghị sử dụng
matK là một trong những locus barcode chuẩn cho thực vật [36], [40].
Kết quả nhân bản gen rbcL và matK
Kết quả kiểm tra sản phẩm điện di gen rbcL trên gel agarose 0,8% (hình 9) cho thấy gen rbcL đƣợc khuếch đại tốt ở tất cả các mẫu dó bầu nghiên cứu, các băng thu đƣợc đều sáng và rõ chỉ có một băng vạch duy nhất với kích thƣớc khoảng 750 bp đối với mồi rbcL và 990bp đối với mồi matK (khi so sánh với thang DNA chuẩn 1 kb). Đây là kết quả tốt tạo cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo.
29
Hình 9. Kết quả điện di sản phẩm PCR gen rbcL và matK của các mẫu Bá bệnh thu thập phục vụ cho nghiên cứu. M: marker 1kb, giếng 1 kiểm tra bằng mồi rbcL,
giếng 2 kiểm tra bằng mồi matK
Kết quả phân tích trình tự đoạn gen matK và rbcL
Các đoạn DNA sau khi đƣợc tách dòng thành công sẽ đƣợc gửi đọc trình tự tại công ty Macrogen (Công ty tham gia vào dự án giải trình tự bộ gen ngƣời). Trình tự đƣợc xác định trên máy đọc trình tự tự động theo nguyên lý của Sanger. Sau khi xử lý trình tự bằng phần mềm BioEdit và đối chiếu với những thông tin trên ngân hàng GenBank, chúng tôi đã tiến hành phân tích kết quả với 2 mồi nghiên cứu kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
Sử dụng chỉ thị matK chúng tôi tiến hành phân tích trình tự mẫu cây bá bệnh thu đƣợc ngoài thực địa với trình tự gen cây bá bệnh trên ngân hàng gen thế giới.
990bp 750bp
30
Hình 10. So sánh trình tự nucleotide (sử dụng chỉ thị chỉ thị matK) của mẫu thu ở Hình 10. So sánh mẫu thu tại Quảng Ninh với trình tự Eurycoma longifolia đƣợc
công bố (sử dụng chỉ thị là mồi matK)
Khi so sánh trình tự nucleotide của mẫu Bá bệnh - Việt Nam với dòng
Eurycoma longifolia voucher Gwee and Samsuri GW19 (SING) (Hình 10) nhận thấy ở dòng thu mẫu tại Việt Nam có 1 điểm không tƣơng đồng (do sự thay đổi giữa các loại bazơ ở vị trí 232 T-C).
Nhƣ vậy, độ tƣơng đồng về trình tự nucleotide đoạn gen của mẫu thu ở Quảng Ninh Việt Nam là rất lớn trong 850 nucleotide chỉ có 1 nucleotide sai khác.
31
Hình 11. So sánh trình tự nucleotide (sử dụng chỉ thị chỉ thị rbcL) của mẫu thu ở So Hình 11. So sánh mẫu thu tại Quảng Ninh với trình tự Eurycoma longifolia đƣợc
công bố (sử dụng chỉ thị là mồi rbcL)
Tƣơng tự khi sử dụng cặp mồi (rbcL) để nhân gen và so sánh với trình tự
Eurycoma longifolia voucher Gwee and Samsuri GW19 (SING) |EU042996.1| kết quả cho thấy chỉ có một điểm sai khác ở vị trí nucleotide 320. Vậy trong tổng số 660 nucleotide chỉ cho duy nhất một điểm sai khác, chứng tỏ độ tƣơng đồng rất cao của mẫu cây Bá bệnh thu tại Quảng Ninh với trình tự cây bá bệnh tại ngân hàng gen thế giới.
Vậy có thể khẳng định mẫu thu tại Quảng Ninh là giống Eurycoma longifolia
với độ tin cậy 99%.
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});