Để thực hiện việc chuyển gen bằng A. rhizogenes phƣơng pháp chủ yếu đƣợc tiến hành là ủ trực tiếp mẫu với dịch huyền phù vi khuẩn đồng nuôi cấy với mẫu với tế bào trong môi trƣờng lỏng trong một khoảng thời gian nhất định.
Chuẩn bị mẫu mô thực vật: Các mẫu mô thực vật đƣợc khử trùng, cắt nhỏ, tạo vết thƣơng trên biểu bì. Các mẫu lá đƣợc cắt có kích thƣớc 0,2 - 0,5 cm2 đƣợc làm tổn thƣơng bằng lƣỡi dao cắt bốn cạnh xung quanh. Thân cây bá bệnh cắt nhỏ chiều dài khoảng 0,3 – 0,4 cm. Đặt vào trong đĩa petri có sẵn môi trƣờng WPM lỏng. Phần gốc cây Bá bệnh cấy tiếp vào môi trƣờng MG tiếp tục giữ giống cây.
Phƣơng pháp chuyển gen tạo rễ tơ ở cây bá bệnh thông qua vi khuẩn A. rhizogenes ATCC15834 bao gồm các bƣớc chính nhƣ sau:
Chuẩn bị chủng A. rhizogenes ATCC15834 một ngày trƣớc khi biến nạp, nuôi một khuẩn lạc vào 5 ml YMP lỏng có bổ sung, nuôi lắc 200 v/p ở 28oC. Hút 1 ml dịch khuẩn nuôi lỏng ở trên cho vào 50 ml YMP lỏng, đo OD600 = 0,3 – 0,5 là có thể đƣợc sử dụng cho biến nạp.
Đổ dịch khuẩn vào bình tam giác có chứa các mẫu cấy đƣợc chuẩn bị nhƣ trên.
Sau 30 phút chuyển các mảnh cấy lên giấy thấm đã khử trùng, thấm khô và cấy lên môi trƣờng WPM. Sau 2 ngày đồng nuôi cấy chuyển sang môi trƣờng WPM có bổ sung kháng sinh cefotaxim 500 mg/L.
21
Sau 2 - 4 tuần các mảnh cấy bắt đầu cảm ứng tạo rễ đƣợc cắt và chuyển sang môi trƣờng WPM có bổ sung cefotaxim 400 mg/l.
Qui trình tóm tắt tạo rễ tơ của cây bá bệnh
Việc loại bỏ vi khuẩn sau thời gian đồng nuôi cấy là bƣớc quan trọng. Nếu không loại bỏ vi khuẩn thì trong quá trình nuôi cấy rễ tơ, chúng sẽ phát triển trong môi trƣờng nuôi cấy, sẽ cạnh tranh nguồn dinh dƣỡng gây ảnh hƣởng xấu đến khả
Các dòng rễ khác nhau đƣợc cấy chuyển sang từng đĩa petri riêng biệt
Chủng vi khuẩn A. Rhizogenes
Hạt bá bệnh
Khử trùng bằng Javen Nảy mầm trên MG
Nuôi lỏng tạo huyền phù
Ly tâm thu sinh khối , tạo huyền phù trong môi trƣờng nhiễm khuẩn
Đoạn thân mầm và mảnh lá nhỏ kích thƣớc 0,5 - 1 cm cảm ứng trong dung dịch cảm ứng mẫu
Lây nhiễm
Đồng nuôi cấy trên WPM + AS 50 ở điều kiện tối
Tiếp tục lƣu giữ trên môi trƣờng WPM đặc
2-3 tuần
3 ngày
Chuyển mô lên môi trƣờng WPM (bổ sung 500 mg/l cefotaxim)
1 tháng
3 tuần/lần tuần/lần Cảm ứng tạo rễ trên môi trƣờng WPM
(bổ sung 500 mg/l cefotaxime 3 tuần/lần
Cấy chuyển sang môi trƣờng WPM đặc tạo sinh khối
22
năng phát triển của rễ tơ tại vị trí nhiễm, thậm chí có thể lấn át không cho rễ phát triển.
Rễ tơ thƣờng xuất hiện sau khi đã chuyển gen khoảng 1-4 tuần. Cần tiếp tục cấy chuyển rễ tơ lên môi trƣờng có bổ sung kháng sinh diệt khuẩn cefotaxim 400 mg/l thêm 2-4 lần. Khi mẫu đã sạch thì có thể đƣợc chuyển qua môi trƣờng lỏng để nuôi cấy. Khi rễ đƣợc nuôi trong môi trƣờng lỏng ở quy mô bình lắc 250 ml thì cần phải đƣợc cấy chuyền định kì 3-4 tuần. Điều kiện thích hợp để cấy chuyển là khi rễ tơ vẫn còn đang phát triển, nếu rễ trở nên già hay nâu thì khi cấy chuyền, các đầu rễ có thể sẽ bị chết.