rhizogenes
Với các thành phần đƣợc tối ƣu thu đƣợc nhƣ trên, phƣơng pháp tối ƣu tạo rễ
tơ từ bá bệnh thông qua vi khuẩn A. rhizogenes đƣợc mô tả nhƣ sau: Để chuyển gen
vào thực vật thông qua vi khuẩn Agrobacterium thì vật liệu thực vật đƣợc sử dụng
thƣờng chọn lọc từ mô phân sinh đỉnh chồi, đỉnh rễ. Trong nghiên cứu này, hạt cây bá bệnh đƣợc thu tại vƣờn Quốc gia Bái Tử Long đƣợc khử trùng bằng NaClO 60%
trong thời gian 20 phút và HgCl2 trong thời gian 8 phút. Hạt bá bệnh sau khi đƣợc
khử trùng sẽ đặt lên trên môi trƣờng WPM có bổ sung GA3 với mục đích tạo đa chồi các cây mầm. Sau thời gian 2-3 tuần nuôi cấy, cây mầm phát triển từ 3-5 cm đƣợc sử dụng để cắt thành các mảnh nhỏ làm nguyên liệu chuyển gen. Việc cắt nhỏ các mảnh mẫu với mục đích tạo ra tổn thƣơng cho mẫu để vi khuẩn xâm nhập và chuyển đoạn gen mong muốn vào trong mô thực vật. Trong quá trình cắt lá cần chú ý cắt cho mẫu lá nguyên hình, và đƣa lá đặt ngay vào môi trƣờng ½MS để mô lá không tổn thƣơng nhiều do bị mất nƣớc.
Sau 2 ngày đồng nuôi cấy, các đoạn thân đƣợc thấm khô bằng giấy thấm khử trùng và cấy mẫu trên đĩa môi trƣờng WPMC (môi trƣờng WPM có bổ sung 500 mg/l cefotaxime).
OD600 Tỷ lệ mẫu tạo rễ tơ (%)
0,2 18 (9/50)
0,4 40 (20/50)
0,6 36 (18/50)
36
Các mẫu cấy đƣợc cấy chuyển sang môi trƣờng mới sau 3-4 tuần, các mẫu cấy cảm ứng tạo rễ tơ đƣợc cấy chuyển sang các đĩa môi trƣờng riêng biệt để tránh lẫn các dòng rễ tơ chuyển gen.
Bảng 3. Kết quả chuyển gen tạo rễ tơ ở Bá bệnh
Chúng tôi đã tiến hành 3 lô thí nghiệm chuyển gen, nhìn chung các mảnh cấy cảm ứng tạo rễ tơ sau 2-3 tuần chuyển gen. Tỉ lệ tạo rễ tơ ở mỗi lô thí nghiệm cao nhất là 71% và thấp nhất là 64,5%. Kết quả đã thu đƣợc nhiều dòng rễ tơ chuyển gen trên môi trƣờng WPMC đĩa thạch. Sau 2-3 lần cấy chuyển trên đĩa thạch, các dòng rễ tơ đƣợc chuyển vào nuôi cấy lỏng ở điều kiện nhiệt độ 25- 27oC, trong tối trên máy lắc nhẹ 60-100 v/p.
Theo hình 14D, một số mẫu mô lá vẫn sống sót trên môi trƣờng WPM nhƣng không cảm ứng tạo rễ tơ. Điều này cho thấy khả năng những mô lá tồn tại và phát triển đƣợc trên môi trƣờng có bổ sung kháng sinh cefotaxim nhƣng không đƣợc biến nạp thành công và không cảm ứng tạo rễ. Hình 14E, F các dòng rễ tơ chuyển gen có khả năng sinh trƣởng và phát triển hơn nhiều so với rễ bình thƣờng trên môi trƣờng không bổ sung chất điều hoà sinh trƣởng.
Điều này cho thấy các dòng rễ tơ nhận đƣợc có nhiều khả năng là các dòng rễ tơ đã chuyển gen đã nhận đƣợc đoạn T-DNA từ vi khuẩn Ri-plasmid.
Thời gian Tỷ lệ mẫu tạo rễ tơ (%) Tỷ lệ rễ tơ sinh trƣởng, phát triển tốt (%) Lô thí nghiệm 1 71(71/100 ) 16,9 (12/71) 2 64,5 (60/93) 13,3 (8/60) 3 68,7 (55/80) 5,5 (3/55)
37
Hình 14. Kết quả chuyển gen tạo rễ tơ ở bá bệnh nhờ vi khuẩn Agrobacterium
rhizogenes
A: Mẫu hạt cây bá bệnh thu thập đƣợc tại vƣờn quốc gia Bái Tử Long; B: Hạt nảy
mầm sau 3 tuần trên môi trƣờng WPM bổ sung 0,2 mg/L GA3; C: Các mẫu cấy bá bệnh sau khi biến nạp 5 ngày trên WPMC; D: Cảm ứng tạo rễ tơ sau 2-4 tuần biến nạp trên WPMC; E,F: Dòng rễ tơ phát triển ổn đinh sau 8-12 tuần biến nạp trên WPMC đĩa thạch và lỏng; G: Hình thái rễ tơ bá bệnh phân nhánh