nguyên liệu cho nuôi cấy mô tế bào và chuyển gen tạo rễ tơ
Khử trùng mẫu cấy là việc làm khó vì mẫu sống không thể khử bằng nhiệt độ cao mà phải giữ đƣợc bản chất sinh học của nó [6]. Do đó mẫu cấy thực vật phải đƣợc khử trùng bằng các dung dịch khử trùng. Các dung dịch khử trùng thƣờng dùng là hypoclorit calcium, hypoclorit sodium, chlorua thủy ngân, oxi già… Tỉ lệ vô trùng thành công phụ thuộc thời gian khử trùng và nồng độ các chất khử trùng và
32
khả năng xâm nhập của chúng vào các kẽ lách lồi lõm trên bề mặt mô nuôi cấy, khả năng đẩy hết các bọt khí bám trên bề mặt mô nuôi cấy. Các dung dịch dùng để khử trùng mẫu phải bảo vệ đƣợc mô thực vật nhƣng thời gian khử trùng phải đủ để tiêu diệt nguồn gây nhiễm là nấm và vi khuẩn.
Thời gian khử trùng mẫu kéo dài gây ảnh hƣởng tới sức sống của mẫu (do tác động của chất khử trùng, tác động của việc lắc mẫu trong ngƣớc,và quá trình phân hủy qua hô hấp của mẫu...)
Các hạt bá bệnh sau khi thu thập, chọn lựa những hạt chắc, loại bỏ vỏ cứng và đƣợc rửa trƣớc bằng xà phòng dƣới dòng nƣớc chảy rồi mới cho vào ngâm trong dung dịch khử trùng. Để làm tăng khả năng xâm nhập của chất diệt khuẩn, hạt bá bệnh đƣợc xử lí trong cồn 70% trong 30 giây, sau đó xử lí trong dung dịch Javen (60%) trong vòng 15-20 phút. Trong thời gian xử lí, hạt bá bệnh phải đƣợc ngập hoàn toàn trong dung dịch diệt khuẩn. Sau khi xử lý xong Javen, hạt bá bệnh đƣợc rửa nhiều lần trong nƣớc cất vô trùng (3-5 lần)… Để tránh ảnh hƣởng trực tiếp của tác nhân vô trùng lên mô cấy, nên chú ý để lại một lớp bọc ngoài và lớp vỏ bọc này sẽ đƣợc cắt bỏ hoặc bóc đi trƣớc khi đặt mô cấy lên môi trƣờng [6].
Hình 12. Hạt bá bệnh nảy mầm trên môi trƣơng MG
A: Hạt bá bệnh sau 3 ngày khử trùng; B, C: Hạt bá bệnh nảy mầm sau 3 tuần trên môi trƣờng MG
33
Sau khi khử trùng, hạt bá bệnh đƣợc đặt lên môi trƣờng MS đặc có bổ sung chất kích thích sinh trƣởng là GA3. GA3 có tác dụng kích thích sự nảy mầm và kéo dài chồi của hạt cây bá bệnh diễn ra nhanh và mạnh hơn.
Hạt bá bệnh sau 3 ngày nuôi cấy bắt đầu nảy mầm với tỷ lệ sống rất cao. Sau 3 tuần vào mẫu hạt thì hạt đã nảy mầm, kéo dài chồi và có hình thành rễ.. Tuy nhiên thì vẫn có các hạt ko nảy mầm do khi sử dụng hạt đƣa khử trùng đã chọn lọc vẫn có hạt lép.