Quy trình chuyển gen thông qua A.rhizogenes phu thuộc và các yếu tố nhƣ: nồng độ vi khuẩn biến nạp, chất kháng sinh, thời gian biến nạp và diện tích mẫu lá đƣợc cắt cho biến nạp.
Ảnh hưởng của kháng sinh bổ sung vào môi trường nuôi cấy
Bổ sung các kháng sinh vào môi trƣờ ng nuôi cấy nói chung thƣ ờng đƣợc tránh do sự hiện diện của chúng trong môi trƣờng làm chậm sinh trƣởng của mô và tế bào. Tuy nhiên, một số tế bào thƣ̣c vật bị nhiễm vi sinh v ật có chủ động hoặc bị động, và để ngăn chặn sinh trƣởn g của các vi sinh vật này , điều không thể thay thế là làm giàu môi trƣờng bằng kháng sinh . Và môi trƣờng đƣợc bổ sung các kháng sinh này phải không gây bất lợi cho sƣ̣ sinh trƣởng của tế bào thực vật nuôi cấy [5].
Một số vai trò của các loại thuốc kháng sinh trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật:
- Ngăn chặn sự lây nhiễm của các vi khuẩn vào môi trƣờng nuôi cấy tế bào và mô thực vật
- Ngăn chặn nấm mốc và nấm men lây nhiễm vào mô, tế bào nuôi cấy - Loại trừ các chủng vi khuẩn Agrobacterium dùng trong chuyển gen ra khỏi môi trƣờng và mô nuôi cấy (sau nuôi cấy, hỗn hợp Agrobacterium với tế bào thực vật để chuyển gen hoàn thành).
- Sử dụng kháng sinh trong môi trƣờng chọn lọc để chọn các tế bào hoặc mô đã đƣợc chuyển gen (mang gen chỉ thị kháng kháng sinh). Các tế bào không đƣợc
34
chuyển gen sẽ ngừng sinh trƣởng trong môi trƣờng có kháng sinh ở nồng độ thích hợp.
Hình 13. Ảnh hƣởng của kháng sinh lên mẫu lá, thân sau 7 ngày trên môi trƣờng WPM bổ sung 500 mg/L cefotaxime
Trong nghiên cứu này, kháng sinh sử dụng trong môi trƣờng diệt khuẩn sau khi biến nạp là Cefotaxime nồng độ 500 mg/l. Cefotaxime là kháng sinh đƣợc sử dụng phổ biến , chi phí rẻ trong nhiều nghiên cứu chuyển gen ở thực vật. Kết quả thử nghiệm ảnh hƣởng của kháng sinh lên sự phát triển của mẫu cấy cho thấy cefotaxime nồng độ 500 mg/l hầu nhƣ không ảnh hƣởng đến hình thái ngoài của mẫu cấy (hình 13).
Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn Agrobacterium tới hiệu quả chuyển gen gus
Mật độ tế bào vi khuẩn đƣợc xác định bởi giá trị quang phổ OD ở bƣớc sóng 600nm của dịch lỏng vi khuẩn, có liên quan tới sinh khối tế bào của chúng hay số lƣợng tế bào trong một thể tích nhất định. Trong nghiên cứu chuyển gen, việc xác định mật độ vi khuẩn phù hợp, giai đoạn vi khuẩn sinh trƣởng khỏe có ý nghĩa quan trọng để hiệu quả chuyển gen đƣợc cao nhất. Để xác định OD600 phù hợp chúng tôi đã tiến hành thử nghiệm nhiễm khuẩn mảnh thân mầm bá bệnh trong môi trƣờng huyền phù vi khuẩn với OD600 dao động từ 0,2 tới 0,8.
35
Bảng 2. Ảnh hƣởng của nồng độ vi khuẩn Agrobacterium tới hiệu quả chuyển gen
Trong nghiên cứu này, chúng tôi nhận thấy mật độ vi khuẩn có ảnh hƣởng trực tiếp tỷ lệ tạo rễ tơ. Với thời gian nhiễm khuẩn là 15 phút, tỷ lệ tạo rễ tơ có giảm nhẹ thấp nhất đạt tỉ lệ 12% khi nồng độ OD600 = 0,8. Qua kết quả thí nghiệm, giá trị OD600 trong khoảng 0,4 đến 0,6 đƣợc dùng cho các thí nghiệm chuyển gen tạo rễ tơ từ thân mầm cây bá bệnh.