Các rễ tơ không mang gen chuyển sẽ không có khả năng phát triển ổn định trên môi trƣờng không có chất điều hòa sinh trƣởng thực vật và khả năng tổng hợp các hợp chất tự nhiên của chúng cũng rất thấp so với những dòng rễ đã chuyển gen. Nếu nhƣ khi đƣa vào sản xuất hợp chất tự nhiên mà trong hệ thống nuôi cấy có lẫn tạp nhiều rễ không mang gen chuyển thì khả năng tổng hợp hợp chất tự nhiên sẽ kém hơn nhiều so với môi trƣờng đồng nhất các dòng rễ tơ có mang gen chuyển. Không những thế các dòng không mang gen chuyển đó sẽ không duy trì ổn định đƣợc trong suốt thời gian sản xuất. Vì vậy để đảm bảo tất cả hệ thống rễ tơ đƣa vào sản xuất phải đều mang gen đã chuyển từ vi khuẩn A. rhizogenes cần phải tiến hành bƣớc kiểm tra và chọn lọc.
Có nhiều phƣơng pháp để kiểm tra và chọn lọc dòng đã đƣợc chuyển gene. Việc kiểm tra gián tiếp thông qua khả năng tổng hợp hợp chất opine ở rễ có thể kiểm tra đƣợc rễ đã đƣợc chuyển gene hay chƣa, tuy nhiên phƣơng pháp này độ chính xác không cao vì khả năng tổng hợp opine ở rễ đã đƣợc chuyển gene là không ổn định. Do đó các phƣơng pháp xác định trực tiếp việc có mặt của T-DNA trong bộ gene của rễ tơ sẽ cho kết quả chọn lọc chính xác hơn. Trong nghiên cứu này phƣơng pháp đƣợc sử dụng là PCR.
23
Phƣơng pháp xác định trực tiếp việc có mặt của T-DNA trong bộ gen của rễ tơ sẽ cho kết quả chọn lọc chính xác hơn. Các phƣơng pháp đó chủ yếu là các phƣơng pháp sinh học phân tử nhƣ Southern blotting, PCR,…
Các gen rolA, rolB and rolC đóng vai trò quan trọng trong quá trình cảm ứng tạo rễ tơ ở mô tế bào thực vật. Sự biểu hiện đồng thời của ba gen này gây nên kiểu hình rễ tơ ở mô tế bào thực vật bị xâm nhiễm. Phƣơng pháp chiết tách DNA đƣợc thực hiện theo White và Sinkar năm 1987. Phản ứng khuếch đại đƣợc thực hiện trong hệ thống máy gene Amp® PCR System 9700, sử dụng mồi 22-mer oligonucleotide đặc hiệu cho từng gen rol. Hỗn hợp phản ứng bao gồm 1μl của 1 đơn vị Taq polymerase, 2,5 μl dNTP 100 nM, 1μl đoạn mồi 20 pM, 1μl của 20 ng/μl DNA mẫu và 2,5 μl đệm phản ứng 10X, sau đó đƣợc bổ sung lên đến 25μl bằng nƣớc cất vô trùng. Quá trình sau đây đã đƣợc thiết lập cho phản ứng PCR: biến tính khởi đầu trong 4 phút ở 94 °C; biến tính trong 1 phút, 94 °C; ủ đoạn mồi trong 1 phút, 52 °C; khuếch đại trong 2 phút, 72 °C. Khuếch đại kết thúc trong 5 phút, ở 72 °C. Sau khi khuếch đại 30 chu kỳ, các PCR-DNA Phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu với từng rol không nhƣng cho phép pháp hiện sự có mặt của T- DNA mà còn có khả năng đánh giá mức độ tạo rễ tơ của thực vật. Phản ứng đƣợc PCR thực hiện với nhiệt độ gắn mồi 52oC thời gian kéo dài mồi 1 phút. Những rễ tơ chuyển thành công cho các kích thƣớc tƣơng ứng với rolA, rolB và rolC lần lƣợt là 404bp, 795bp, 481bp.
ii) Phân tích các hợp chất thứ cấp có trong các dòng rễ tơ bằng phƣơng pháp sắc ký bản mỏng và khối phổ kế.
Các dòng rễ tơ tạo ra theo phƣơng pháp sử dụng Agrobacterium rhizogenes
với mục đích sử dụng các hợp chất tự nhiên có trong rễ của cây bá bệnh. Để đánh giá thành phần các chất chúng tôi sử dụng hai phƣơng pháp phân tích các hợp chất thứ cấp trong thực vật đó là sắc ký bản mỏng và LTP Orbitrap XL MS.
- Sắc ký bản mỏng (thin layer chromatography)
Sắc ký là quá trình tách các cấu tử của một hỗn hợp dựa vào việc các cấu tử này sẽ phân bố khác nhau giữa pha tĩnh và pha động. Pha tĩnh có thể là cột nhồi (sắc ký cột) và pha động là dung môi hữu cơ sẽ di chuyển ngang qua; pha tĩnh có thể là một lớp mỏng chất hấp phụ, lúc đó pha động sẽ đƣợc hút thấm lên lớp mỏng nhờ lực hút mao dẫn.
24
Chuẩn bị mẫu: Chiết mẫu với dung môi là MeOH (thƣờng sử dụng máy siêu âm và áp dụng cho lƣợng mẫu không quá 500g trong mỗi lần chiết) ở nhiệt độ thƣờng hoặc có thể tăng nhiệt độ. Thực hiện chiết mẫu với 3 lần. Dịch chiết thu đƣợc đƣợc cất loại dung môi dƣới áp suất thấp bằng máy quay cất chân không [45].
Trƣớc khi chấm mẫu lên bản phải vạch lằn "mức xuất phát" cách đáy bản 1cm; và lằn "mức tiền tuyến dung môi" cách đầu bản 0,5cm.
Dùng vi quản nhúng nhẹ phần đầu nhọn vào dung dịch mẫu, lực mao dẫn sẽ hút dung dịch mẫu vào vi quản, chấm nhẹ phần đầu nhọn có chứa mẫu lên trên bản mỏng tại một điểm cách đáy bản 1cm. Cẩn thận, nhẹ nhàng để đầu nhọn của vi quản chạm nhẹ, không làm thủng lỗ bề mặt. Chạm vào và lấy ra thật nhanh để dung dịch mẫu thấm vào bản tạo thành một điểm tròn nhỏ. Thổi nhẹ lên vết chấm để dung môi bay hơi mau không lan thành vết chấm to. Có thể chấm thêm lên ngay vết cũ vài lần nữa để có vết đậm, rõ, đƣờng kính không quá 2 mm. Nên chấm nhiều lần, mỗi lần một lƣợng nhỏ dung dịch mẫu hơn là chấm một lần với lƣợng mẫu lớn. Nếu cần phải chấm cùng lúc nhiều vết chấm trên cùng một bản thì các vết chấm phải cách đều nhau 1cm và cách đáy bản 1cm và cách 2 cạnh bên 1cm.
Bình hình khối trụ hoặc khối chữ nhật có đƣờng kính lớn hơn bề ngang bản. Đặt một tờ giấy lọc bao phủ mặt trong của bình nhƣng vẫn chừa một khoảng để có thể quan sát bên trong. Tính toán lƣợng dung môi giải ly sao cho khi vào bình, lớp dung môi sẽ dày khoảng 0,5-0,7cm. Cho dung môi giải ly vào bình, để yên 5-10 phút để bão hòa hơi dung môi trong bình. Bản mỏng đƣợc cầm thẳng đứng và đƣợc nhúng vào dung môi trong bình, khi nhúng vào phải cẩn thận để hai cạnh bên của bản không chạm vào thành bình; lúc đó vị trí của các vết chấm mẫu nằm trên cao cách mặt thoáng của dung môi khoảng 0,5 cm. Đậy nắp bình, dung môi sẽ đƣợc hút lên nhờ lực hút mao dẫn. Theo dõi khi mực dung môi lên đến vạch tiền tuyến dung môi thì lấy bản ra khỏi bình. Sấy nhẹ bằng máy sấy. Quan sát bằng mắt và dùng viết chì khoanh nhẹ các vết thấy đƣợc. Còn nếu không thấy gì, có thể nhìn bản dƣới đèn tử ngoại, bằng hơi iod hoặc phun bản với các thuốc hiện hình thích hợp.
25
LCMS là phƣơng pháp đƣợc dùng trong phân tích vết (ppb, ppm) các hợp chất cần nhận danh chính xác. Trong những điều kiện vận hành nhất định ngoài thời gian lƣu đặc trƣng, các chất còn đƣợc nhận danh bằng khối phổ của nó.
Nguyên lý chung
Phƣơng pháp khối phổ (Mass Spectrometry-MS) là phƣơng pháp nghiên cứu các chất bằng cách đo, phân tích chính xác khối lƣợng phân tử của chất đó dựa trên sự chuyển động của các ion nguyên tử hay ion phân tử trong một điện trƣờng hoặc từ trƣờng nhất định. Tỉ số giữa khối lƣợng và điện tích (m/z) có ảnh hƣởng rất lớn đối với chuyển động này của ion. Nếu biết đƣợc điện tích của ion thì ta dễ dàng xác định đƣợc khối lƣợng của ion đó.
Kiểu hình thành ion ứng dụng cho nguồn API trong LC/MS: Ion hóa tia điện (electrospray ionization – ESI).
Đầu dò khối phổ
Đầu dò khối phổ bẫy ion (Ion Trap, IT)
26
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Thu thập và định danh loài bá bệnh bằng chỉ thị DNA 3.1.1. Thu thập mẫu
Dựa vào các đặc điểm hình thái (thân nhỏ, ít phân cành, lá kép lông chim một lần lẻ, mọc so le. Mỗi lá kép gồm từ 21 – 41 lá chét, mọc đối, hình bầu dục, cuống lá rất ngắn, gốc lá thuôn, đầu nhọn, mặt trên bóng, mặt dƣới có lông màu xám), chúng tôi tiến hành thu các mẫu cây bá bệnh tại vƣờn quốc gia Bái Tử Long. Kết quả đã thu nhận đƣợc 30 cây Bá bệnh tại vƣờn ƣơm phù hợp với mục đích nghiên cứu.
Hình 7. Một số hình ảnh cây bá bệnh tại vƣờn quốc gia Bái Tử Long: A) Cây mọc tự nhiên trong vƣờn; B & C) Cây trồng trong vƣờn ƣơm
27
Trong nghiên cứu này, ngoài mẫu cây bá bệnh, mẫu hạt cây bá bệnh cũng đƣợc thu thập tại vƣờn quốc gia Bái Tử Long. Bá bệnh là loài đơn tính khác gốc nên mỗi cây chỉ trổ hoa đực hoặc hoa cái. Hoa Bá bệnh màu đỏ nâu mọc thành chùm, nở vào tháng 3-4, mỗi bông hoa có 5-6 cánh rất nhỏ. Cây kết quả vào tháng 5-6. Hạt thƣờng đƣợc thu vào tháng 6-7. Quả non màu xanh; khi chín đổi sang màu đỏ sẫm. Quả hình trứng hơi dẹt, có rãnh ở giữa dài từ 1 – 2 cm, ngang 0,5 – 1 cm, chứa 1 hạt, trên mặt hạt có nhiều lông ngắn [23].
Hình 8. Mẫu hạt cây Bá Bệnh thu thập đƣợc tại vƣờn quốc gia Bái Tử Long
3.1.2. Định danh loài bằng chỉ thị DNA
Hệ gen lục lạp có tính bảo thủ cao và mang tính đặc thù của từng loài do vậy việc sử dụng các kết quả phân tích hệ gen lục lạp vào nghiên cứu phát sinh loài và phân loại thực vật đƣợc các nhà khoa học rất quan tâm. Dựa trên những thông tin có sẵn từ các nghiên cứu về phát sinh loài và các nghiên cứu gần đây, một số locus là đoạn gen hay các gen đƣợc chọn để nghiên cứu làm chỉ thị barcode tiềm năng cho các loài thực vật trên trái đất. Có khoảng 20 gen lục lạp có độ dài phù hợp (khoảng 1 kb) đƣợc sử dụng trong nghiên cứu phát sinh loài. Các gen này chứa đựng nhiều mức độ tiến hoá và vì vậy phù hợp cho nhiều mức độ phân loại [36], [38], [35]. Trong nghiên cứu này chúng tôi lựa chọn 2 trình tự gen là rbcL và matK để định danh loài Bá bệnh ở Việt Nam.
28
Trình tự gen rbcL
Trong các gen lạp thể, rbcL là trình tự gen đặc trƣng nhất, mã hóa các tiểu đơn vị lớn của rubilose - 1,5 - bisphosphate cacboxylase/ oxygenase (RUBISCO).
rbcL là gen đầu tiên đƣợc giải trình từ thực vật. rbcL đã đƣợc sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu phát sinh loài và phân loại thực vật với hơn 10000 trình tự rbcL có sẵn trong GenBank. Do sự dễ dàng trong khuếch đại PCR ở một số nhóm thực vật, CBOL gần đây đã công nhận rbcL là một trong những trình tự gen tiềm năng nhất cho các nghiên cứu DNA barcode ở thực vật. Tuy nhiên, do khả năng phân biệt loài thấp, nên hầu hết các nhóm đều cho rằng nên sử dụng kết hợp rbcL với các với các chỉ thị barcode khác, ví dụ nhƣ matK là hai locus barcode chuẩn cho thực vật [36], [37], [39].
Trình tự gen matK
Trong số các gen lục lạp, matK là một trong những gen tiến hoá nhanh nhất, có kích thƣớc khoảng 1550 bp và mã hóa cho enzyme maturase liên quan đến quá trình loại bỏ các intron loại 2 trong quá trình phiên mã RNA. Do matK tiến hoá nhanh và có mặt hầu hết trong thực vật nên đã đƣợc sử dụng nhƣ một chỉ thị trong nghiên cứu mối quan hệ giữa các loài và phát sinh loài ở thực vật. CBOL đã thử nghiệm matK trên gần 550 loài thực vật và thấy rằng 90% mẫu thực vật hạt kín dễ dàng khuếch đại trình tự bằng cách sử dụng một cặp mồi đơn và đề nghị sử dụng
matK là một trong những locus barcode chuẩn cho thực vật [36], [40].
Kết quả nhân bản gen rbcL và matK
Kết quả kiểm tra sản phẩm điện di gen rbcL trên gel agarose 0,8% (hình 9) cho thấy gen rbcL đƣợc khuếch đại tốt ở tất cả các mẫu dó bầu nghiên cứu, các băng thu đƣợc đều sáng và rõ chỉ có một băng vạch duy nhất với kích thƣớc khoảng 750 bp đối với mồi rbcL và 990bp đối với mồi matK (khi so sánh với thang DNA chuẩn 1 kb). Đây là kết quả tốt tạo cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo.
29
Hình 9. Kết quả điện di sản phẩm PCR gen rbcL và matK của các mẫu Bá bệnh thu thập phục vụ cho nghiên cứu. M: marker 1kb, giếng 1 kiểm tra bằng mồi rbcL,
giếng 2 kiểm tra bằng mồi matK
Kết quả phân tích trình tự đoạn gen matK và rbcL
Các đoạn DNA sau khi đƣợc tách dòng thành công sẽ đƣợc gửi đọc trình tự tại công ty Macrogen (Công ty tham gia vào dự án giải trình tự bộ gen ngƣời). Trình tự đƣợc xác định trên máy đọc trình tự tự động theo nguyên lý của Sanger. Sau khi xử lý trình tự bằng phần mềm BioEdit và đối chiếu với những thông tin trên ngân hàng GenBank, chúng tôi đã tiến hành phân tích kết quả với 2 mồi nghiên cứu kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
Sử dụng chỉ thị matK chúng tôi tiến hành phân tích trình tự mẫu cây bá bệnh thu đƣợc ngoài thực địa với trình tự gen cây bá bệnh trên ngân hàng gen thế giới.
990bp 750bp
30
Hình 10. So sánh trình tự nucleotide (sử dụng chỉ thị chỉ thị matK) của mẫu thu ở Hình 10. So sánh mẫu thu tại Quảng Ninh với trình tự Eurycoma longifolia đƣợc
công bố (sử dụng chỉ thị là mồi matK)
Khi so sánh trình tự nucleotide của mẫu Bá bệnh - Việt Nam với dòng
Eurycoma longifolia voucher Gwee and Samsuri GW19 (SING) (Hình 10) nhận thấy ở dòng thu mẫu tại Việt Nam có 1 điểm không tƣơng đồng (do sự thay đổi giữa các loại bazơ ở vị trí 232 T-C).
Nhƣ vậy, độ tƣơng đồng về trình tự nucleotide đoạn gen của mẫu thu ở Quảng Ninh Việt Nam là rất lớn trong 850 nucleotide chỉ có 1 nucleotide sai khác.
31
Hình 11. So sánh trình tự nucleotide (sử dụng chỉ thị chỉ thị rbcL) của mẫu thu ở So Hình 11. So sánh mẫu thu tại Quảng Ninh với trình tự Eurycoma longifolia đƣợc
công bố (sử dụng chỉ thị là mồi rbcL)
Tƣơng tự khi sử dụng cặp mồi (rbcL) để nhân gen và so sánh với trình tự
Eurycoma longifolia voucher Gwee and Samsuri GW19 (SING) |EU042996.1| kết quả cho thấy chỉ có một điểm sai khác ở vị trí nucleotide 320. Vậy trong tổng số 660 nucleotide chỉ cho duy nhất một điểm sai khác, chứng tỏ độ tƣơng đồng rất cao của mẫu cây Bá bệnh thu tại Quảng Ninh với trình tự cây bá bệnh tại ngân hàng gen thế giới.
Vậy có thể khẳng định mẫu thu tại Quảng Ninh là giống Eurycoma longifolia
với độ tin cậy 99%.
3.2. Kết quả khử trùng hạt và đƣa các mẫu bá bệnh vào nuôi cấy in vitro làm nguyên liệu cho nuôi cấy mô tế bào và chuyển gen tạo rễ tơ nguyên liệu cho nuôi cấy mô tế bào và chuyển gen tạo rễ tơ
Khử trùng mẫu cấy là việc làm khó vì mẫu sống không thể khử bằng nhiệt độ cao mà phải giữ đƣợc bản chất sinh học của nó [6]. Do đó mẫu cấy thực vật phải đƣợc khử trùng bằng các dung dịch khử trùng. Các dung dịch khử trùng thƣờng dùng là hypoclorit calcium, hypoclorit sodium, chlorua thủy ngân, oxi già… Tỉ lệ vô trùng thành công phụ thuộc thời gian khử trùng và nồng độ các chất khử trùng và
32
khả năng xâm nhập của chúng vào các kẽ lách lồi lõm trên bề mặt mô nuôi cấy, khả năng đẩy hết các bọt khí bám trên bề mặt mô nuôi cấy. Các dung dịch dùng để khử trùng mẫu phải bảo vệ đƣợc mô thực vật nhƣng thời gian khử trùng phải đủ để tiêu diệt nguồn gây nhiễm là nấm và vi khuẩn.
Thời gian khử trùng mẫu kéo dài gây ảnh hƣởng tới sức sống của mẫu (do tác động của chất khử trùng, tác động của việc lắc mẫu trong ngƣớc,và quá trình phân hủy qua hô hấp của mẫu...)
Các hạt bá bệnh sau khi thu thập, chọn lựa những hạt chắc, loại bỏ vỏ cứng và đƣợc rửa trƣớc bằng xà phòng dƣới dòng nƣớc chảy rồi mới cho vào ngâm trong dung dịch khử trùng. Để làm tăng khả năng xâm nhập của chất diệt khuẩn, hạt bá