nghiên cứu thành phần hóa học cây kim tiền thảo (desmodium styracifolium osb.merr.) thuộc họ cánh bướm fabaceae

Hàm lượng ancaloit cũng thay đổi theo mùa, thời tiết, khí hậu…[2] Một số ancaloit được tìm ra trong thực vật chi Desmodium như sau: 1.4.1.1 Các ancaloit có bộ khung indol N H R2 R1 Năm

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

ĐOÀN KHUÊ

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC

CÂY KIM TIỀN THẢO (DESMODIUM STYRACIFOLIUM OSB MERR.) THUỘC HỌ CÁNH BƯỚM FABACEAE

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC VẬT CHẤT

Thái Nguyên, năm 2014

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

ĐOÀN KHUÊ

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC

CÂY KIM TIỀN THẢO (DESMODIUM STYRACIFOLIUM OSB MERR.) THUỘC HỌ CÁNH BƯỚM FABACEAE

Chuyên ngành: Hóa học hữu cơ

Mã số: 60 44 01 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC VẬT CHẤT

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Phạm Văn Thỉnh

Thái Nguyên, năm 2014

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc của mình tới PGS TS Phạm Văn Thỉnh- Người thầy đã tận tình hướng dẫn, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện luận văn

Xin chân thành cảm ơn phòng hóa sinh ứng dụng, Viện Hóa học- Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam

Tôi cũng xin chân thành cám ơn Ban Giám hiệu, Ban lãnh đạo Khoa Hóa Học, Khoa Sau đại học- trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành quyển luận văn này

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, bạn bè và các đồng nghiệp

đã giúp đỡ, động viên tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện luận văn này

Thái Nguyên, tháng 08 năm 2014

Tác giả

Đoàn Khuê

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu, kết quả nêu trong luận án này là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả

ĐOÀN KHUÊ

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

LỜI CAM ĐOAN

MỤC LỤC i

DANH MỤC CÁC BẢNG ii

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ ii

DANH MỤC CÁC HÌNH iii

DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC Error! Bookmark not defined MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Mô tả thực vật 3

1.3 Một số công dụng của cây kim tiền thảo Desmodium styracifolium (Osb.) Merr 5

1.4 Tình hình nghiên cứu hóa học thực vật của chi Desmodium 7

1.4.1 Một số đại diện của ancaloit 7

1.4.1.1 Các ancaloit có bộ khung indol 7

1.4.1.2 Các ancaloit không chứa dị vòng hay còn gọi là các bazơ amin 9 1.4.1.3 Các ancaloit có bộ khung pirol 12

1.4.2 Một số đại diện hợp chất flavonoit 12

1.4.3 Một số đại diện nhóm dẫn xuất polyphenol 18

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 19

2.1 Nguyên tắc chung 19

2.2 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 19

2.2.1 Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phương pháp xử lý mẫu 19

2.2.2 Phương pháp phân lập các hợp chất từ các dịch chiết 20

2.2.3 Phương pháp khảo sát và xác định cấu trúc hóa học các hợp chất 20 2.3 Dụng cụ, hóa chất và thiết bị nghiên cứu 20

2.3.1 Dụng cụ và hóa chất 20

2.3.2 Thiết bị nghiên cứu 21

2.4 Các dịch chiết từ cây kim tiền thảo (Desmodium styracifolium (Osb.) Merr.) 21 2.4.1 Các dịch chiết 21

2.4.2 Khảo sát đặc tính các dịch chiết 23

2.4.2.1 Xác định đường khử 23

2.4.2.2 Xác định định tính ankaloit 23

2.4.2.3 Xác định định tính steroid 23

2.4.2.4 Xác định định tính poliphenol 24

2.4.2.5 Xác định định tính flavoit 24

2.4.2.6 Xác định định tính cumarin 24

2.4.2.7 Xác định định tính saponin 24

2.4.2.8 Xác định định tính glycozit tim 24

2.4.3 Thử hoạt tính sinh học 25

2.5 Phân lập, tinh chế các chất từ cây kim tiền thảo (Desmodium styracifolium (Osb.) Merr.) 26

2.5.1 Dịch chiết n-hexan 26

2.5.1.1 Chất DSH.5 26

2.5.1.2 Chất DSH.7 26

2.5.1.3 Chất DSH.10 27

2.5.2 Dịch chiết etylaxetat 27

2.5.2.1 Chất DSE.5 27

2.5.2.2 Chất DSE.8 28

CHƯƠNG 3: THẢO LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 29

3.1 Nguyên tắc chung 29

3.2 Phân tích định tính và phát hiện các nhóm chất 30

3.3 Phân lập và nhận dạng các hợp chất có trong các dịch chiết khác nhau của cây kim tiền thảo 30

3.3.1 Chất DSH.5 - Lupeol 31

3.3.2 Chất DSH.7 - ancol mạch dài C32H66O (dotriacontan-1ol) 41

3.3.3 Chất DSH.10: -sitosterol 45

3.3.4 Hợp chất axit ursolic (3β-hydroxy-urs-12en-28-oic) (DSE.5) 49

3.3.5 Chất DSE.8( β-Sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosit) 60

KẾT LUẬN 65

TÀI LIỆU THAM KHẢO 66 PHỤ LỤC Phụ lục 1

ii

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Khối lượng chất tổng số được chiết từng phân đoạn của 23

Bảng 2.2: Kết quả thử hoạt tính sinh học của dịch chiết tổng 25

Bảng 3.1: Phát hiện các nhóm chất trong cây kim tiền thảo 30

Bảng 3.2: Số liệu phổ của DSE.5 và axit ursolic [5] 51

Bảng 3.3 Số liệu phổ 13 C-NMR (CDCl3, 125Mhz) của một số sterol trong lá cây kim tiền thảo 61

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1: Qui trình ngâm chiết mẫu cây kim tiền thảo 22

iii

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Ảnh cây kim tiền thảo Desmodium styracifolium (Osb.) Merr 3

Hình 2.1 Phản ứng trung hòa gốc DPPH 25

Hình 3.1 Cấu trúc hóa học của Lupeol (DSH.5) 32

Hình 3.2 Phổ FT-IR của (DSH.5) 34

Hình 3.3 Phổ 1 H-NMR của chất (DSH.5) 35

Hình 3.4 Phổ 13 C-NMR của chất (DSH.5) 36

Hình 3.5 Phổ 13C& DEPT của chất (DSH.5) 37

Hình 3.6 Phổ LC/MS của (DSH.5) 38

Hình 3.7 Phổ HSQC của (DSH.5) 39

Hình 3.8 Phổ HMBC của (DSH.5) 40

Hình 3.9 Cấu trúc hóa học của dotriacontan-1-ol (DSH.7) 41

Hình 3.10 Phổ 1 H-NMR của chất (DSH.7) 42

Hình 3.11 Phổ 13 C-NMR của (DSH.7) 43

Hình 3.12 Phổ DEPT của chất (DSH.7) 44

Hình 3.13 Cấu trúc hóa học của β-Sitosterol (DSH.10) 45

Hình 3.14 Phổ FT-IR (DSH.10) 46

Hình 3.15 Phổ 1 H-NMR của (DSH.10) 47

Hình 3.16 Phổ 13 C-NMR của (DSH.10) 48

Hình 3.17 Phổ 13 C-DEPT của (DSH.10) 49

Hình 3.18 Cấu trúc hóa học của (DSE.5) 51

Hình 3.19 Phổ FT-IR của (DSE.5) 53

Hình 3.20 Phổ LC-ESI-MS của (DSE.5) 54

Hình 3.21 Phổ 1 H-NMR của axit ursolic (DSE.5) 55

Hình 3.22 Phổ 13 C – NMR của axit ursolic 56

Hình 3.23 Phổ 13 C-DEPT của axit ursolic 57

Hình 3.24 Phổ HSQC của (DSE.5) 58

Hình 3.25 Phổ HMBC của axit ursoli 59

Hình 3.26 β-sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosit 61

Hình 3.27 Phổ 1 H-NMR của chất β-sitosterolglucozit (DSE.8) 63

Hình 3.28 Phổ 13 C-NMR của chất β-sitosterolglu,ozit (DSE.8) 64

iv

DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC

Phụ lục 1 Các phổ của chất DSH.5 Phụ lục 1 Phụ luc 1.1 Phổ dãn 1 H-NMR của chất DSH.5 Phụ lục 1 Phụ luc 1.2 Phổ dãn 1 H-NMR của chất DSH.5 (tiếp) Phụ lục 2 Phụ lục 1.3 Phổ dãn 13 C-NMR của chất DSH.5 Phụ lục 3 Phụ lục 1.4 Phổ 13 C- DEPT của DSH.5 (tiếp) Phụ lục 4 Phụ lục: 1.5 Phổ HSQC của DSH.5 (tiếp) Phụ lục 5 Phụ lục: 1.6 Phổ HMBC của DSH.5 (tiếp) Phụ lục 6 Phụ lục: 1.7 Phổ HMBC của DSH.5 (tiếp) Phụ lục 7 Phụ lục 2 Các phổ của chất DSH.7 Phụ lục 8 Phụ luc 2.1 Phổ dãn 1 H-NMR của DSH.7 Phụ lục 8 Phụ luc 2.2 Phổ DEPT của chất DSH.7 Phụ lục 9 Phụ lục 3: Các phổ của chất DSH.10 Phụ lục 10 Phụ lục 3.1 Phổ dãn 1 H-NMR của chất DSH.10 Phụ lục 10 Phụ lục 3.2 Phổ dãn 1 H-NMR của chất DSH.10 (tiếp) Phụ lục 11 Phục lục 3.3 Phổ dãn 13 C-NMR của chất DSH.10 Phụ lục 12 Phụ luc 3.4 Phổ DEPT của chất DSH.10 Phụ lục 13 Phụ luc 4: Các phổ của chất DSE.5 Phụ lục 14 Phụ lục 4.1 Phổ dãn 1 H-NMR của chất DSE.5 Phụ lục 14 Phụ lục 4.2 Phổ dãn 1 H-NMR của chất DSE.5 (tiếp) Phụ lục 15 Phụ lục 4.3 Phổ dãn 13 C-NMR của chất DSE.5 Phụ lục 16 Phụ lục 4.4 Phổ HMBC của axit ursolic Phụ lục 17 Phụ lục 5: Các Phổ của chất DSE.8 Phụ lục 18 Phụ lục 5.1 Phổ dãn 1 H-NMR của chất DSE.8 Phụ lục 18 Phụ lục 5.2 Phổ dãn 13 C-NMR của chất DSE.8 Phụ lục 19 Phụ lục 5.3 Phổ 13 C-DEPT của chất DSE.8 Phụ lục 21 Phụ lục 5.4 Phổ 13 C- DEPT của chất DSE.8 (tiếp) Phụ lục 22

1

MỞ ĐẦU

Y học phương Đông đã và đang có những đóng góp rất lớn vào nền y học hiện đại, đặc biệt trong việc phòng ngừa và điều trị các chứng bệnh Trong thời

kì hiện nay vai trò cũng như vị thế của nó ngày càng được nâng cao

Hiện nay những hợp chất tự nhiên được phân lập từ cây cỏ đã được ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều ngành công nghiệp, nông nghiệp, chúng được dùng để sản xuất thuốc chữa bệnh, thuốc bảo vệ thực vật, làm nguyên liệu cho ngành công nghiệp thực phẩm và mỹ phẩm Mặc dù công nghệ tổng hợp hoá dược ngày nay đã phát triển mạnh mẽ, tạo ra các biệt dược khác nhau sử dụng trong công tác phòng, chữa bệnh, điều đó đã góp phần làm tăng tuổi thọ con người, song nhu cầu sử dụng cây cỏ để làm thuốc cũng ngày càng tăng lên Do

đó, con người còn có xu hướng quay về với tự nhiên để nghiên cứu tìm ra các hoạt chất quý giúp cho quá trình điều trị bệnh, bắt chước thiên nhiên tổng hợp

ra các chất có hiệu quả hơn

Trong vô số loài thực vật ở Việt Nam, có nhiều loài cây thuộc họ cánh bướm (Fabaceae) có giá trị sử dụng cao, được dùng để bào chế thuốc chữa nhiều bệnh

như cây kim tiền thảo có tên khoa học là Desmodium styracifolium (Osb.) Merr.,

hay còn được gọi với tên khác như: vảy rồng, mắt trâu, đồng tiên lông, đây là một loại dược liệu mọc nhiều ở Đông Nam Ấn Độ, Trung Quốc, Thái Lan, Malaysia, Indonesia, Việt Nam, Nhật Bản…

Ở Việt Nam cây kim tiền thảo phân bố rộng rãi ở vùng đồi núi Thường gặp ở những chỗ sáng, trên đất cát pha, vùng trung du Hà Tây, Lạng Sơn, Ninh Bình, Hải Phòng Và được thu hái cây vào mùa hè thu, có thể dùng tươi hay phơi khô

Từ kinh nghiệm dân gian và những kết quả nghiên cứu thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học của cây kim tiền thảo trên thế giới, cho thấy loại

2

cây này có rất nhiều tác dụng như: chữa bệnh sỏi niệu đạo, sỏi bàng quang, sỏi túi mật Chữa nhiễm khuẩn đường niệu, viêm thận phù thũng, viêm gan vàng da… Cây kim tiền thảo là loại cây đã được dùng làm thuốc chữa bệnh ở Việt Nam từ rất lâu, nhưng việc nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của loài thực vật này ở nước ta còn rất ít Do vậy, việc nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của các cây kim tiền thảo là một hướng nghiên cứu đầy triển vọng

Vì vậy tôi đã lựa chọn nghiên cứu đề tài: ―Nghiên cứu thành phần hóa

học cây kim tiền thảo (Desmodium styracifolium (Osb.) Merr.) thuộc họ

cánh bướm Fabaceae‖

Mục tiêu của đề tài: Tìm hiểu thành phần hóa học của cây kim tiền thảo từ

đó tìm ra những hợp chất có hoạt tính sinh học, làm sáng tỏ việc sử dụng của cây trong dân gian, đưa ra hướng bảo tồn và sử dụng hiệu quả cây dược liệu quí này

rồng, mắt trâu, đồng tiên lông [1], [4]

Phân bố địa lý: Cây kim tiền thảo là một loại dược liệu mọc nhiều ở Đông Nam Ấn Độ, Trung Quốc, Thái Lan, Malaysia, Indonesia, Việt Nam và Nhật Bản…Ở Việt Nam cây kim tiền thảo phân bố rộng rãi ở vùng đồi núi Thường gặp ở những chỗ sáng, trên đất cát pha, vùng trung du Hà Tây, Lạng Sơn, Ninh Bình, Hải Phòng

Hình 1.1 Ảnh cây kim tiền thảo Desmodium styracifolium (Osb.) Merr

Mô tả cây: Thân cỏ, mọc bò Thân hình trụ, màu xanh hơi vàng, phủ đầy lông mịn màu vàng hoe Lá mọc so le, đơn hay kép lông chim lẻ gồm 1-3 lá chét,

lá chét ở giữa to hơn 2 lá bên Cuống lá dài 2-4 cm, hình trụ phù ở đáy, phủ đầy lông trắng Hai lá kèm hình mũi mác, dài 6-9 mm, ngang 2-3 mm, nhiều gân dọc, đầy lông trắng mịn Lá kèm con nhỏ, hình tam giác Lá chét có phiến tròn hoặc hơi xoăn, đường kính 2-4 cm, ít khi đến 5 cm, mép nguyên, đỉnh tròn hay tù hoặc chia 2 thùy cạn, đáy hình tim; mặt trên nhẵn, màu hơi vàng hoặc lục xám,

1.2 Một số công dụng của chi Desmodium

Những thực vật thuộc chi Desmodium hầu hết được nhân dân sử dụng để

làm các bài thuốc chữa bệnh và chăm sóc sức khỏe:

Cây kim tiền thảo được các lương y dùng chữa các chứng bệnh như: tiêu viêm, giải độc, tán sỏi… Do có nhiều công dụng nên cây kim tiền thảo đã và đang được nhiều nhà khoa học nghiên cứu thành phần hóa học và các hoạt tính sinh học để bào chế thành các chế phẩm thuốc phục vụ cho con người

Cây hàn the (Desmodium hyterophyllum): Theo Đông y (Y học cổ truyền

Tuệ Tĩnh) trong dân gian cây hàn the được sử dụng để chữa ho có đờm, sốt nóng, cầm máu… Ngoài ra nó còn được dùng để đắp trực tiếp lên vết thương

có tác dụng tiêu viêm rất tốt

Theo y học cổ truyền Tuệ Tĩnh cây Cỏ cháy (Desmodium gangeticum (L.)

DC) đây là loại cây mọc hoang ở rìa rừng có vị ngọt, tính mát, có tác dụng thanh nhiệt giải độc, kiện tỳ tiêu thực, lợi niệu, sát trùng Thường dùng để trị các bệnh như: Cảm mạo phát sốt nóng, viêm sưng họng, viêm mủ răng, viêm tuyến mang tai, viêm thận cấp, viêm gan vàng da, viêm ruột ỉa chảy, lỵ, bệnh giun móc, nhiễm trùng sán lá gan, trẻ em suy dinh dưỡng, phụ nữ nôn mửa khi có mang…

5

Trên thế giới, với sự phát triển không ngừng của khoa học kĩ thuật người

ta đã tiến hành nghiên cứu và thử hoạt tính sinh học của nhiều chất được phân lập từ chi này và đã thu được nhiều kết quả đáng chú ý:

Từ loại Desmodium pulchellum đã tách được một số hợp chất có khả

năng gây ảo giác giống như ma túy và có tác dụng kháng độc tốt [15], [30], [44]

Tại Nhật Bản người ta đã bào chế thành công thuốc chữa tâm thần phân liệt, chất làm tăng hưng phấn thần kinh, thuốc chữa các bệnh nội tạng như gan,

mật, thận… Từ rễ của một số loài thuộc chi Desmodium [18], [34]

1.3 Một số công dụng của cây kim tiền thảo Desmodium styracifolium

(Osb.) Merr

Cây kim tiền thảo: Theo Đông y đây là một loại cây có vị ngọt, tính hàn (Trung Quốc Dược Học Đại Từ Điển) Trong dân gian cây kim tiền thảo được dùng Thanh nhiệt, lợi thủy, tiêu sạn, giải độc, tiêu viêm (Trung Quốc Dược Học) Các nghiên cứu dược lý hiện đại cho thấy kim tiền thảo có tác dụng lợi tiểu, lợi mật, kháng sinh, kháng viêm, dãn mạch, hạ huyết áp Nhưng công dụng chủ yếu của Kim tiền thảo là lợi mật, thông tiểu tiện, thường dùng chữa sỏi thận, sỏi mật, sỏi bàng quang, sỏi đường tiết niệu, viêm gan vàng da, viêm thận phù thũng… Đặc biệt hoạt chất soyasaponin I chứa trong kim tiền thảo đã được chứng minh có tác dụng ức chế sự hình thành sỏi calci axalat ở thận Cao kim tiền thảo thí nghiệm trên động vật có tác dụng ức chế sự hình thành sỏi calci axalat ở thận do thành phần polysacchorid chứa trong cao có tác dụng này

và đồng thời làm tăng lượng bài tiết nước tiểu, kim tiền thảo còn có tác dụng tăng cường sự tiết mật [48]

Đối với hệ tim mạch, trên thực nghiệm cao kim tiền thảo làm tăng lưu lượng mạch vành, hạ huyết áp, làm tim đập chậm, đồng thời làm giảm mức tiêu thụ oxy của cơ tim Tác dụng hạ huyết áp do sự kích thích các thụ thể cholinergic và sự phóng bế các thụ thể adrenergic Thành phần flavonoid của kim tiền thảo cũng có tác dụng hạ huyết áp Trong nghiên cứu thực nghiệm,

6

kim tiền thảo có tác dụng đối kháng với các triệu chứng do pituitrin gây giảm lưu lượng mạch vành, thiếu máu cơ tim thể hiện trên điện tâm đồ và rối loạn nhịp tim [48]

Một số bài thuốc dân gian có dùng cây kim tiền thảo: [49]

Chữa mụn nhọt, ghẻ lở: kim tiền thảo + xa tiền thảo tươi, giã nát, cho rượu vào, vắt lấy nước cốt, lấy lông ngỗng chấm thuốc bôi vào vết thương

Chữa sạn mật: Chỉ xác (sao) 10-15g, xuyên luyện tử 10g, hoàng tinh 10g, kim tiền thảo 30g, sinh địa 6-10g (cho vào sau), sắc uống Hoặc kim tiền thảo 30g, xuyên phá thạch 15g, trần bì 30g, uất kim 12g, xuyên quân (cho vào sau) 10g, sắc uống

Chữa sạn đường tiểu: kim tiền thảo 30-60g, hải kim sa (gói vào túi vải) 15g, đông quỳ tử 15g, xuyên phá thạch 15g, hoài ngưu tất 12g, hoạt thạch 15g, sắc uống Hoặc kim tiền thảo 30g, xa tiền tử (bọc vào túi vải) 15g, xuyên sơn giáp (chích) 10g, thanh bì 10g, đào nhân 10g, ô dược 19g, xuyên ngưu tất 12g, sắc uống

Chữa sỏi đường tiểu do thận hư thấp nhiệt: hoàng kỳ 30g, hoàng tinh 15g, hoài ngưu tất 15g, kim tiền thảo 20g, hải kim sa (gói vào túi vải), xuyên phá thạch 15g, vương bất lưu hành 15g, sắc uống

Chữa bệnh trĩ: mỗi ngày dùng toàn cây kim tiền thảo tươi 100g (nếu khô 50g) sắc uống Đối với trĩ nội và ngoại đều có kết quả như nhau

Chữa viêm đường mật không do vi khuẩn: Dùng kim tiền thảo sắc uống sáng 1 lần hoặc nhiều lần trong ngày Mỗi ngày dùng 30g, có khi 20g hoặc 10g/ ngày, 30 ngày là 1 liệu trình Thông thường uống trong 2-3 tháng có kết quả với tỉ lệ 76,9%

7

1.4 Tình hình nghiên cứu hóa học thực vật của chi Desmodium

1.4.1 Một số đại diện của ancaloit

Ancaloit là các hợp chất hữu cơ được phân tách từ nhiều loài thực vật, vi sinh vật và động vật Trong phân tử chứa nitơ và có tính kiềm Trên thực tế đa

số các ancaloit có tác dụng sinh lí đối với cơ thể sống của động vật cũng như con người, do đó một số loại ancaloit được bào chế thành các chất gây mê, thuốc kích thích hoặc các chế phẩm thuốc nhằm mục đích chữa bệnh

Ancaloit có nhiều trong thực vật chi Desmodium chúng được phân bố

trong lá, thân, rễ, hoa và quả với hàm lượng khác nhau Hàm lượng ancaloit cũng thay đổi theo mùa, thời tiết, khí hậu…[2]

Một số ancaloit được tìm ra trong thực vật chi Desmodium như sau:

1.4.1.1 Các ancaloit có bộ khung indol

N H

R2

R1

Năm 1938, Cahill.W.M và các cộng sự [12], từ hạt cây Desmodium

tiliaefolium đã phân lập được chất N—metyltryptophan, có công thức phân tử

C12H14N2O2 có khả năng tan trong H2O, C2H5OH nhưng không tan trong ete (C2H5)2O Công thức được xác định là:

N H

O HO

8

tinh trong (C2H5)2O/n-C6H14 Đã được phân lập từ loài Desmodium pulchellum,

do Wilkinson.S.J.C.S và các cộng sự [15], [30], [44] Đây là một ancaloit có bộ khung indol với công thức như sau:

N H

Năm 1974 Mandava.N [25] đã phân lập từ loài Desmodium triflorum chất

có tên là: N,N-Dimethyltryptophan, có công thức phân tử C13H16N2O2, có dạng tinh thể tan trong C2H5OH, điểm chảy cao: 243-2450C, được xác định là có khả năng gây ức chế tăng trưởng ở thực vật Công thức hóa học là:

NH

N CH3

OH O

H3C

3 N,N-Dimethyltryptophan

Năm 1976 từ các loài Desmodium pulchellum và desmodium caudatum,

tác giả Roseghini.M và các cộng sự [14], [37] đã phân lập đươc Bufotenine oxide, công thức phân tử là C12H16N2O2, dạng tinh thể có nhiệt độ nóng chảy cao 214-2150C Bufotenine N-oxide còn được tìm thấy trong nọc của con cóc, trong nấm amanita và một số loại thực vật khác Công thức được xác định là:

N-N H

CH3O

CH3

4 Bufotenine N-oxide

9

Các tác giả U.S.Pat, 1993 và lam.Y.K.T, 1994 [22], [42] đã phân lập được một ancaloit có bộ khung indol, cấu trúc được xác định là: 3-(Dimethylaminomethyl) indole, có công thức phân tử là C11H14N2, có điểm chảy được xác định là 138-1390C Có tác dụng như một tác nhân kháng độc

Các tác giả Moriyasu.M, 1997 và Roseghini.M, 1976 và các cộng sự [28]

đã phân lập được từ loài Desmodium pulchellum hợp chất N-oxide, công thức

phân tử C12H16N2Ođiểm nóng chảy đo được là 123-1280C, dạng tinh thể ngậm

nước N-Oxide còn được tìm thây trong loài Desmodium triflodium và

Desmodium other Cấu trúc của 2 chất này được xác định như sau:

N H

N

CH3

5 3-(Dimethylaminomethyl) indole 6 N-oxide

1.4.1.2 Các ancaloit không chứa dị vòng hay còn gọi là các bazơ amin

Theo tác giả Yamaguchi và các cộng sự [16], [38], [45], đã phân lập chất

(N,N-dimethylamino)acetophenone, từ cây Desmodium gangeticum có công

thức phân tử C10H13NO, có nhiệt độ sôi ở 130-1320C và có công thức cấu tạo được xác định như sau:

H3C N

O

CH3

7 N,N-dimethylamino

Năm 1993 Tác giả Yang j.et al, Yaoxue Xuebao [46] đã phân lập được từ

cây Desmodium styracifolium một amit có cấu trúc được xác định là

3-Acetamidodihydro-4,5-dimethyl-2(3H)-furanone Còn được gọi là Desmodilactone, có

10

công thức phân tử C8H13NO3, là chất có nhiệt độ nóng chảy tương đối thấp,

84-850C Công thức cấu tạo được xác định như sau:

H3C

8 Acetamidodihydro-4,5-dimethyl-2(3H)-furanone

Từ loài Desmodium triflorum, Konno.C [5], [20] cùng các cộng sự đã phân

lập được chất coryneine, công thức phân tử C H NO11 18 2 , là chất được xác định có khả năng gây kích thích giao cảm Công thức cấu tạo được xác định như sau:

N+ CH3

OH HO

CH3

H 3 C

9 Coryneine

Từ loài Desmodium tilliaefolium, tác giả Ranieri.R cùng với các cộng sự

[11], [24], [29], [32] đã phân lập được chất 3,4-Dimethoxy phenethylamine dưới dạng tinh thể kết tinh trong C6H6 hoặc ete petrol, có công thức phân tử

C10H15NO2, đây là chất có nhiệt độ nóng chảy ở 1240C và có hoạt tính sinh học cao với công thức được xác định là một amin bậc nhất

NH2

O

CH3O

11

được xác định là N-Methyl-3,4-dimethoxy-hydroxy phenethylamine Có công thức phân tử C11H17NO3 [10], [17], [33] Ngoài ra chất này còn được tìm thấy trong các loài Cryphantha macromeris, Coryphantha calipensis và Dolichothele longimamma

Với các nguồn nguyên liệu từ Desmodium several, trichocereus

candicans, trichocereus spachianus, Gven.K.C [18], [34] đã phân lập được hợp

chất N-Me hay còn có tên là candicine, có công thức phân tử C11H18NO+, Đây

là hợp chất được xác định có khả năng gây ức chế hạch thân kinh, làm co mạch, ảnh hưởng đến hoạt động thần kinh, có độc tính rất giống nicotin Công thức cấu tạo được xác định như sau:

HO

N+ CH3

CH3

H3C

12 N-Me hay candicine

Hợp chất 4-Hydroxy phenethylamine với công thức phân tử C8H11NO được phân lập bởi tác giả Rondest.J và các cộng sự [40], [36] Đây là một chất hữu cơ phổ biến ở sinh vật, có khả năng giúp co mạch Chất này được tìm thấy

ở rất nhiều loại cây: Desmodium và Magnolia, Pisum sativum, ở các động vật

đang phân hủy, ngoài ra còn được tìm thấy trong nước tiểu của bệnh nhân bị bệnh Parkison và trong nhiều loại cây khác Công thức cấu tạo của nó được xác định như sau:

12

OH

NH2

13 4-Hydroxy phenethylamine

1.4.1.3 Các ancaloit có bộ khung pirol

Desmodimine là một chất đại diện cho ancaloit có bộ khung porol được

Yang.J.S và các cộng sự phân lập từ loài Desmodium styracifolium [47] Có

công thức phân tử là C12H15NO4 Với việc sử dụng các phương pháp phân tích quang phổ đã xác định được cấu trúc hóa học của chất này như sau:

O O

H 3 C

H3C OH

14 Desmodimine

1.4.2 Một số đại diện hợp chất flavonoit

Hợp chất Desmodianone D và Desmodianone E được phân lập từ thân và

rễ cây Desmodium canum do tác giả Botta.B [9] đều có cùng công thức phân tử

C26H28O6 cả hai hợp chất đều tồn tại dưới dạng chất rắn vô định hình Chúng có nhiệt độ nóng chảy khác nhau nhưng phổ UV rất giống nhau Với các kĩ thuật phân tích quang phổ người ta nhận dạng được chúng đều là các iso flavanon có vòng A giống nhau nhưng ở vòng B có các nhóm thế ở vị trí 4 khác nhau Botta.B đã đặt tên cho chúng là Desmodianone D và E với công thức cấu tạo tương ứng là:

O O

OH HO

CH3

H3C

18 3,4’,5,7-Tetrahydroxy-8-preylflavanone

14

Tác giả Botta.B, đã phân lập được hợp chất 6-Methyltetrapterol A, từ loài

định hình [9], công thức cấu tạo như sau:

O

O

O HO

6-(2,4-Dihydroxyphenyl)-2,3,6,7-tetrahydro-4-Me ether hay Uncinanone C có công thức phân tử C21H20O6 Được tách và phân

lập bởi Tasanuo.M.K và cộng sự từ loài Desmodium uncinatum [41] Công

thức cấu tạo của 2 chất này được xác định như sau:

ơ

O O

Từ lá của loài Desmodium oxyphyllum tác giả Mizuno.M và Lin.Y-L, [23],

[26] đã phân lập thành công 4 chất dạng bột là 7-0-D-glucopyranoside dạng bột màu vàng với công thức phân tử là C22H20O12; 5-hidroxy cũng có dạng bột màu vàng và công thức phân tử C16H10O7 và Desmoxyphyllin B, có công thức phân

tử được xác định là C16H10O6 7-O-D-Glucopyrano side có công thức phân tử

C22H20O11; Với các phương pháp quang phổ hiện đại người ta đã xác định được công thức cấu tạo của 4 chất dạng bột như sau:

15

O

O HO

O HO

O

CH3

O O

OH OH

OH HO

22 5-hidroxy,7-0-D-glucopyranoside 23 7-0-D-glucopyranoside

O

O HO

O

CH3

24 5-hidroxy

Tác giả Monache.G.D và các cộng sự [27] đã tiền hành phân lập thành

công 2 hợp chất từ loài Desmodium canum là: Desmodianone A có công thức

phân tử C26H28O6 và Desmodianone C có công thức phân tử C26H30O6 cả 2 chất này đều được xác định như là một tác nhân kháng khuẩn Công thức cấu tạo của 2 chất này được xác định như sau:

HO

O

26 Desmodianone C

16

Từ loài Desmodium caudatum tác giả Ueno.A [43] đã phân lập được chất

Desmodol Đây là hợp chất dạng bột màu vàng có công thức phân tử C21H18O6,

có điểm chảy tương đối cao 281-2820

Tác giả Khan.H [21] đã phân lập được từ cây Desmodium sequax hợp chất

Lanceolatin B ở dạng tinh thể trong hỗn hợp C6H6/C6H12 có công thức phân tử

C17H10O3 với điểm chảy 138- 1400C Bằng các phương pháp quang phổ hiện đại đã xác định được công thức cấu tạo của Lanceolatin B như sau:

O O

O

28 Lanceolatin B

Trên tạp chí Soedin phát hành năm 1973 đã công bố kết quả nghiên cứu của tác giả Chernobrovaya.N.V [13] về việc phân lập thành công 2 hợp chất là 2‖-O-D-Xylopyranosyl hay có tên khác: Homoadonivernite với công thức phân tử: C26H28O15 và 2‖-O-D-Xylopyranosyl tên khác là Desmodin có công thức phân tử C26H28O14 cả 2 chất này đều có điểm chảy tương đương nhau là 198-

2030C và cấu trúc hóa học của chúng được xác định như sau:

17

O

OH HO

O OH HO

O

OH OH

OH

O O

OH O

OH

O

OH HO

HO

OH O

30 2‖-O-D-Xylopyranosyl hay Desmodin

Năm 2009 từ loài thực vật Desmodium hyterophyllum thu hái tại Thái

Nguyên, phòng thí nghiệm hoá hữu cơ trường đai học Sư phạm Thái nguyên Tác giả Nghiêm Thị Hương và Phạm Văn Thỉnh đã phân lập được hợp chất vitexin và các dẫn xuất của nó [3]

31- Vitexin

18

1.4.3 Một số đại diện nhóm dẫn xuất polyphenol

Từ loài Desmodium gangeticum tác giả Purushothaman.K.K, Brin.A.J và

Kitagawa.I [31], đã phân lập thành công được 4 chất: Desmodin có công thức phân tử C22H22O6, Gangetin tồn tại dạng tinh thể kết tinh trong hỗn hợp đietylete/hexan, công thức phân tử C26H28O5, Hợp chất 3-Me ether hay có tên gọi khác là Desmocarpin dạng tinh thể không tan trong nước và hexan nhưng tan trong methanol và etylaxetat có công thức phân tử C16H14O5 và hợp chất Gangetinin, công thức C26H26O5

Về nguyên tắc ngâm chiết mẫu thực vật có thể tiến hành theo 2 cách phổ biến sau:

1 Chiết và phân lập các hợp chất từ mẫu thực vật bằng các loại dung môi

có độ phân cực tăng dần: ete dầu hỏa hoặc n-hexan, clorofom, etylaxetat, methanol hoặc etanol vv…

2 Chiết tổng bằng các ancol (methanol, etanol) hay hệ dung môi ancol:

nước Sau đó sàng lọc các hợp chất bằng các loại dung môi có độ phân cực tăng dần như phương pháp 1 để thu được các dịch chiết có chứa các hợp chất có độ phân cực tương đối giống nhau

Việc chiết mẫu thực vật là cây kim tiền thảo (Desmodium styracifolium (Osb.)

Merr.) được thực hiện theo phương án 2 (sơ đồ 2.1)

2.2 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phương pháp xử lý mẫu

Nguyên liệu để nghiên cứu gồm toàn bộ phần thân và lá của cây kim tiền thảo, được thu hái vào tháng 7, 8 năm 2013 tại huyện Phú Bình, tỉnh Thái Nguyên

Cây kim tiền thảo (còn được gọi với tên khác như: vảy rồng, mắt trâu, đồng tiền lông) được PGS TS Lê Ngọc Công khoa Sinh kĩ thuật nông nghiệp- Trường Đại Học Sư Phạm Thái Nguyên - Đại Học Thái Nguyên Xác định có

tên khoa học là: Desmodium styracifolium (Osb.) Merr, thuộc họ cánh bướm-

Fabaceae

Mẫu cây tươi được thu hái gồm cả thân, lá được rửa sạch, sau đó sấy khô ở nhiệt độ 40-500C cho tới khi khô hoàn toàn Mẫu khô được cắt nhỏ và ngâm chiết trong metanol 900

ở nhiệt độ phòng nhiều lần, liên tục trong 15 ngày, 2 ngày chiết dịch 1 lần

20

Sau khi cất loại dung môi bằng máy cất quay, áp suất thấp, nhiệt độ 400

C căn được cô đến đặc dưới dạng xirô Tiếp theo, cặn được lắc, chiết lần lượt bằng các loại dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, clorofom, etylaxetat

và n-butanol Các dịch chiết được đuổi kiệt dung môi bằng thiết bị cất quay ở nhiệt độ 400C dưới áp suất thấp Các cặn thô được phân chia bằng sắc kí cột nhồi silicagel với các hệ dung môi rửa giải có độ phân cực tăng dần để phân lập các chất có độ phân cực gần giống nhau, kêt tinh phân đoạn và kết tinh lại trong

hệ dung môi thích hợp để thu được các chất sạch

2.2.2 Phương pháp phân lập các hợp chất từ các dịch chiết

Để thực hiện, phân lập được những hợp chất sạch từ các dịch thô khác nhau của cây kim tiền thảo, chúng tôi đã phối hợp sử dụng các phương pháp sắc kí và kết tinh lại trong dung môi thích hợp Cụ thể các phương pháp gồm:

- Sắc kí lớp mỏng (SKLM)

- Sắc kí cột silicagel, dùng silicagel Merck 63-200nm

- Kết tinh phân đoạn và kết tinh lại

2.2.3 Phương pháp khảo sát và xác định cấu trúc hóa học các hợp chất

Các chất kết tinh phân lập ra được xác định những hằng số vật lý đặc trưng: màu sắc, mùi vị, hệ số Rf, điểm nóng chảy, ghi các loại phổ như: phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1

H-NMR, phổ 13C-NMR và các phổ phân giải cao Các số liệu phổ thực nghiệm của các chất sạch được dùng để nhận dạng cấu trúc hóa học của chúng

2.3 Dụng cụ, hóa chất và thiết bị nghiên cứu

2.3.1 Dụng cụ và hóa chất

Các loại dung môi để ngâm chiết mẫu là các loại tinh khiết (pure), còn các loại dung môi dùng để sắc kí cột, sắc kí lớp mỏng, dùng để kết tinh lại là hóa chất loại tinh khiết phân tích (PA)

Sắc kí lớp mỏng dùng bản mỏng đế nhôm DC-Alufolien Kiesegel 60 F254tráng sẵn, độ dày 0,2 mm được sử dụng để xác định sơ bộ số thành phần có trong các dịch chiết, các phân đoạn chạy cột và kiểm tra sơ bộ độ sạch của sản phẩm thu được

(UV-Các giá trị Rf trong hệ dung môi triển khai có biểu thức:

Rf = Chiều dài di chuyển của chất thử

Chiều dài di chuyển của dung môi

2.3.2 Thiết bị nghiên cứu

- Nhiệt độ nóng chảy đo trên máy boetus (Đức), hoặc trên máy Eletronthermal IA-9200

- Phổ hồng ngoại ghi trên máy IMPACT- 410 dạng viên nén KBr

- Phổ 1H-NMR và 13C-NMR ghi trên máy Bruker 500Hz, nội chuẩn TMS, dung môi CDCl3, DMSO, aceton-D6

- Phổ MS ghi trên máy MC-MSD Trap –SL

2.4 Các dịch chiết từ cây kim tiền thảo (Desmodium styracifolium (Osb.) Merr.)

2.4.1 Các dịch chiết

Toàn bộ phần trên mặt đất của cây kim tiền thảo đã phơi khô ở nơi thoáng

ít nắng to, nghiền nhỏ được ngâm chiết kiệt bằng MeOH : H2O (85:15) ở nhiệt

độ phòng cho đến khi thu được dịch không màu Dịch chiết được cất loại hết dung môi ở áp suất giảm đến dạng cao khô, xác đinh khối lượng cặn khô, sau

đó thêm nước vào cặn và lần lượt chiết với các loại dung môi: n-hexan và ethyl acetate

Các dịch chiết nói trên được làm khan bằng Na2SO4, lọc và cất kiệt dung môi bằng cất quay dưới áp suất giảm ở nhiệt độ ≤ 500C Cặn được sấy khô và cân để xác định trọng lượng Như vậy từ toàn bộ phần trên mặt đất (thân, lá) của cây kim tiền thảo đã thu nhận được 2 loại cặn là n-hexan và ethyl acetate với các ký hiệu tương ứng là: cặn trong n-hexan (DSH), cặn ethyl acetate (DSE)

2 Ngâm chiết trong MeOH : H 2 to phòng

3 Quay cất chân không, loại methanol

Phân đoạn 5

Cặn EtOAc Cặn n-hexan

Phân đoạn 8

55555 3

23

Bảng 2.1: Khối lƣợng chất tổng số đƣợc chiết từng phân đoạn

của cây kim tiền thảo (Desmodium styracifolium (Osb.) Merr.)

Khối lượng nguyên

liệu khô (g)

Khối lượng cặn cồn tổng số ( g)

Khối lượng cặn chiết (g) n- hexan Etylaxetat

Dung dịch 1: Lấy 0,85 gam NaHSO3 hòa tan trong 40 ml nước cất và 10

ml axit axetic băng

Dung dịch 2: Lấy 8 gam KI hòa tan trong 20 ml nước cất

Lấy 2ml dung dịch 1 trộn với 5ml dung dịch 2 và thêm 20 ml axit axetic sau đó thêm nước đến 100 ml là được thuốc thử Dragendooc

Nếu có mặt ancaloit thì thấy xuất hiện màu da cam sáng khi cho dịch chiết tác dụng với thuốc thử Dragendooc

2.4.2.3 Xác định định tính steroid

- Phản ứng màu libecman-Bơcsa Thực hiện theo 2 cách:

Cách 1: Thực hiện theo ston: cho vài ml dịch chiết tổng vào ống nghiệm, thêm vài giọt CH3COOH đặc và vài ml hỗn hợp (CH3CO)2O: H2SO4 (50:1) Màu thay đổi từ hồng sang xanh lá cây

Cách 2: Thực hiện theo Brietcoc: cho vài mg dịch chiết trong CHCl3, thêm vào 2ml thuốc thử (CH3CO)2O: H2SO4 (20:1) Màu sẽ chuyển từ đỏ - hồng - xanh lá cây – chàm tùy thuộc vào các loại steroid

24

2.4.2.4 Xác định định tính poliphenol

- Phản ứng với dung dịch FeCl3 1%: lấy khoảng 1ml dịch chiết etylaxetat phản ứng với FeCl3 1%, nếu phản ứng tạo ra màu xanh lục tức là dịch chiết có chất có gốc phenol

- Cho vào 2 ống nghiệm 2 ml dịch chiết trong methanol, ống 1 thêm 0,5

ml NaOH 10% Sau đun cả 2 ống nghiệm trên bếp cách thủy đến sôi rồi làm lạnh Thêm vào mỗi ống 4 ml nước cất Quan sát thấy chất lỏng ống 1 trong suốt hơn so với ống 2 và khi axit hóa bằng vài giọt HCl đặc nếu có kết tủa bông thì kết luận có cumarin

2.4.2.7 Xác định định tính saponin

- Sự tạo bọt: cho vào 2 ống nghiệm, ống 1 cho 5 ml dung dịch HCl 0,1N Ống 2 cho 5 ml dung dịch NaOH 0,1N Cho vào mỗi ống 3-5 giọt dịch chiết tổng, lắc đều, để yên, quan sát Nếu độ bền của cột bọt ống 1 bền hơn ống 2 chứng

tỏ mẫu nghiên cứu có saponin tritecpen, ngược lại có saponin steroid

- Phản ứng màu Liberman: dung dịch chiết + 2 ml (CH3CO)2O, lắc đều rồi cho từ từ H2SO4 đặc từ đáy lên, xuất hiện màu đỏ tím nếu có saponin

2.4.2.8 Xác định định tính glycozit tim

Phản ứng Kelle-Kiliani: thuốc thử Kelle-Kiliani gồm 2 dung dịch:

Dung dịch 1: 100 ml CH3COOH loãng + 1 ml FeCl3 5%

Dung dịch 2: 100 ml H2SO4 đặc + 1ml FeCl3 5%

Lấy vài mg cặn dịch chiết cho vào ống nghiệm, thêm 1 ml dung dịch 1, lắc đều cho tan, thêm từ từ 1-2 ml dung dịch 2 theo thành ống nghiệm, quan sát sự

Hình 2.1 Phản ứng trung hòa gốc DPPH

Bảng 2.2: Kết quả thử hoạt tính sinh học của dịch chiết tổng

cây kim tiền thảo

Nhận xét: Mẫu thử có khả năng kháng oxy hóa DPPH ở nồng độ > 128 μg/ml

26

2.5 Phân lập, tinh chế các chất từ cây kim tiền thảo (Desmodium

styracifolium (Osb.) Merr.)

2.5.1 Dịch chiết n-hexan

Từ 7 gam cặn dịch n-hexan của toàn bộ phần trên mặt đất (thân, lá) của cây kim tiền thảo, kí hiệu (DSH) được tiến hành phân lập các chất trên sắc kí cột silicagel với cỡ hạt 0,040-0,063 mm Hệ dung môi rửa giải là: n- hexan : etylaxetat với tỷ lệ theo độ tăng dần của độ phân cực dung môi từ 0 đến 100% etylaxetat (Cụ thể: hệ dung môi n-hexan: etylaxetat lần lượt các tỉ lệ 95-5, 90-10… đến 0-100) Các phân đoạn được thu từng lọ nhỏ, được kiểm tra bằng sắc

kí lớp mỏng (bản mỏng), các phân đoạn giống nhau đem gộp lại và cất loại dung môi để thu được chất sạch

2.5.1.1 Chất DSH.5

Ở phân đoạn thứ 5 sau khi cất loại dung môi, thu được 150 mg cặn, tiếp tục cho cặn thu được lên cột silicagel tiến hành rửa giải cột bằng hệ dung môi (n-hexan - etylaxetat = 98:2), phát hiện bằng vanalin 1% trong dung dịch methanol-H2SO4 5%, thu được 18mg tinh thể hình kim có màu trắng, có Rf = 0,78 trong hệ dung môi A ( n-hexan-etylaxetat= 70: 10) Tiến hành đo phổ chất DSH.5 và so sánh các thông tin phổ đo được chúng tôi thấy các thông số tương đương phổ của Lupeol

2.5.1.2 Chất DSH.7

Tại phân đoạn thứ 7 dung dịch thu được sau khi cất loại dung môi, cặn thu

được (175mg) được tiếp tục đưa lên cột silicagel tiến hành rửa giải cột bằng hệ

dung môi (n-hexan - etylaxetat= 95: 5 ) kiểm tra bằng sắc kí lớp mỏng phát hiện bằng vanalin 1% trong dung dịch methanol-H2SO4 5%, thu được 22 mg chất rắn vô định hình có Rf= 0,75 trong hệ dung môi B (n-hexan - etylaxetat = 50:10, nóng chảy ở 640C

Tiến hành đo phổ của hợp chất DSH.7 chúng tôi nhận thấy hợp chất DSH.7 là một ancol mạnh dài có công thức phân tử được xác định là: C32H66O

27

Sau khi so sánh các dữ liệu trên các phổ đo được hợp chất DSH.7 là: dotriancontan-1ol

2.5.1.3 Chất DSH.10

Phân đoạn thứ 10 thu được 210mg cặn Sau khi tiến hành rửa giải cột bằng

hệ dung mỗi n-hexan-etylaxetat (90:10) đối với lượng cặn thu được ở phân đoạn này Dung dịch thu được tiến hành cất loại dung môi thu được 21mg tinh thể hình kim, không màu, nhiệt độ nóng chảy ở 139-1400

C có Rf= 0,72 trong hệ dung môi C (n-hexan - etylaxetat = 75:25)

Dựa vào các phương pháp vật lý để khảo sát cấu trúc của chất DSH.10 chúng tôi xác định được hợp chất DSH.10 là hợp chất -sitosterol

2.5.2 Dịch chiết etylaxetat

Cất loại dung môi dưới áp suất giảm, sau đó làm khô bằng Na2SO4 khan Với phương pháp làm tương tự như các phần 2.4.1 và 2.4.2 từ 6,5 gam dịch chiết ethyl acetate được đưa lên cột silica gel với cỡ hạt 0,040-0,063 mm, giải hấp bằng dung môi chlorofom: metanol (với lượng metanol tăng dần:0-30%) thu được 10 phân đoạn Kiểm tra cặn thu được trên sắc kí lợp mỏng và hiện màu bằng thuốc thử vanilin - H2SO4 5%, sau đó có phân đoạn giống nhau được

dồn lại đem cất loại dung môi

Phân đoạn thứ 5 thu được 120mg cặn, sau đó được làm sạch lại trên cột silicagel (hệ dung môi: chlorofom - metanol = 97: 3) thu được 38 mg chất DSE.5 Đây là chất bột màu trắng dạng vô định hình có Rf= 0,75 trong hệ dung môi chlorofom - metanol tỉ lệ (70:10) và có nhiệt độ nóng chảy 238-2400C Tiến hành đo chất DSE.5 chúng tôi thu được các thông tin phổ như sau:

Phổ FT-IR có các đỉnh phổ νOH = 3419cm-1, νCH = 2937cm-1, νC=O =1693

cm-1, νC=C = 1456 cm-1 và νC=C = 1379cm-1

Phổ 1

H-NMR (500MHz, DMSO-1H) δ(ppm): 0,77ppm (3H, s, 24-CH3), 0,81ppm (3H, s, 26-CH3), 0,86ppm (3H, d, J 6,4Hz, 30-CH3), 0,90ppm (1H, d,

28

J 4,2Hz, 25-CH3), 0,92ppm (3H, s, 29-CH3), 0,94ppm (3H, d, J 6,2Hz,

23-CH3), 1,09ppm (3H, s, 27-CH3), 3,20ppm (1H, dd, J 6,1Hz và 9,1Hz, H-3), 0,72ppm (1H, d, J 11,2Hz, H-5), 2,19ppm (1H, d, J 11,2Hz, H-18) 5,24ppm (1H, td, J 3,5Hz và 6,9Hz), 125,38ppm

13

C-NMR (DMSO-C13CPD) δ(ppm): C1: 38,23 ppm (t), C2: 28,25ppm (t), C3: 7684ppm (d), C4: 38,37ppm (s), C5: 54,78ppm (d), C6: 17,08ppm (t), C7: 32,71ppm (t), C8: 30,01ppm (s), C9: 46,82ppm (d), C10: 36,52ppm (s), C11: 23,26ppm (t), C12: 124,57ppm (d), C13: 138,18ppm (s), C14: 41,64ppm (s), C15: 28,58ppm (t), C16: 23,08ppm (t), C17: 47,02ppm (s), C18: 52,38ppm (d), C19: 38,99 ppm (d), C20: 38,50ppm (d), C21: 30,18 ppm (t), C22: 36,82ppm (t), C23: 28,25ppm (q), C24: 17,00ppm (q), C25: 15,22ppm (q), C26: 18,00 (q), C27: 22,84ppm (q), C28: 179,27ppm (s), C29: 21,07ppm (q), C30: 16,91 (q)

2.5.2.2 Chất DSE.8

Phân đoạn thứ 8 thu được 150 mg cặn Tiến hành rửa giải cột bằng hệ dung môi chlorofom - metanol tỉ lệ (83:17) thu được 24 mg chất rắn vô định hình, nóng chảy ở 269-2700

C, có Rf = 0,53 trong hệ dung môi E (chlorofom – metanol = 50:10) kí hiệu là chất DSE.8 Bằng các phương pháp xác định cấu trúc chúng tôi xác định chất DSE.8 là β-Stiosterol-3-O-β-D-glucopyranosit

Để tách các chất ra khỏi thực vật có thể được tiến hành bằng nhiều cách khác nhau: ép lấy dầu béo, cất lôi cuốn bằng hơi nước để tách các tinh dầu, ngâm chiết bằng dung môi hữu cơ… Tuy nhiên có hai phương pháp phổ biến hơn cả để tách các chất ra khỏi thực vật:

Cách 1: Trước tiên chiết bằng dung môi rượu-nước để tách hầu hết các

chất ra khỏi thực vật Sau đó chiết sàng lọc bằng các dung môi từ không phân cực đến các dung môi có độ phân cực tăng dần Các dịch chiết chứa các hợp chất có độ phân cực gần nhau sẽ được cất đuổi dung môi, bảo quản dùng cho các quá trình tách tiếp theo

Cách 2: Chiết và phân lập các chất mẫu thực vật bằng các loại dung môi

từ không phân cực đến có độ phân cực tăng dần như lần lươt là: n-hexan, clorofom, etylaxetat, n-butanol, metanol(etanol), etanol-nước

Việc chiết lấy chất từ lá thực vật (Desmodium styracifolium ) được thực

hiện theo cách 1 (sơ đồ 2.1)

Các dịch chiết tổng số và các phần chiết thô đem thử nghiệm với các tác động sinh học và độc tố tế bào nhằm giúp cho việc định hướng tìm kiếm các chất có hoạt tính sinh lý cao trong những dịch chiết

Kết quả thử hoạt tính khả năng kháng oxy hóa DPPH nêu trong bảng (2.2)

30

3.2 Phân tích định tính và phát hiện các nhóm chất

Dùng các thuốc thử đặc hiệu để phát hiện các nhóm hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh lý cao trong thực vật [3] cho thấy trong dịch chiết bằng tổng số của

cây Desmodium styracifolium (Osb.) Merr., có chứa streroit, triterpenoit, các hợp

chất flavonoit, cũng ở các phần dịch chiết này còn có các đường khử, ancaloit Không phát hiện được dẫn xuất các hợp chất xianua các glycozit tim trong các dịch chiết của cây kim tiền thảo Kết quả của các phản ứng định tính để xác định các nhóm hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh lý cao được chỉ ra ở bảng 3.1

Bảng 3.1: Phát hiện các nhóm chất trong cây kim tiền thảo

3 Steroit Libecman-Bơcsa Từ hồng đến xanh lá cây ++

4 Flavonoit Xianidin

Từ vàng da cam, đến

7 Glycozit tim Kelle-Kiliani Không có hiện tượng gì -

Ghi chú: Dấu (+): Phản ứng dương tính

Dấu: (++): Phản ứng dương tính rất rõ Dấu (-): Không có

3.3 Phân lập và nhận dạng các hợp chất có trong các dịch chiết khác nhau của cây kim tiền thảo

Các dịch chiết đều là những hỗn hợp phức tạp chứa các hợp chất khác nhau Để phân lập từng chất ra khỏi hỗn hợp đã sử dụng các phương pháp sắc

Khi phân lập các thành phần hoá học từ cây kim tiền thảo có tên khoa học

là Desmodium styracifolium (Osb.) Merr., được thực hiện như trong sơ đồ 2.1 Bằng

phương pháp phân lập trên, từ dịch chiết bằng n- hexan của cây kim tiền thảo chúng tôi đã thu được 3 hợp chất sạch là: một tritecpen, một ancol mạch dài và một steroit; còn dịch chiết etylaxetat phân lập được một β-sitosterolglucozit và axit ursolic

3.3.1 Chất DSH.5 - Lupeol

DSH.5 là chất bột rắn trắng (18 mg), nhiệt độ nóng chảy: 188 – 189 0

C Phổ IR của DSH.5 cho biết một số dao động liên kết ở các tần số (ν cm-1) đặc trưng như: 3338(OH), 2875 và 2968 (CH), 1638 (C=C) Phổ LC/MS của DSH.5 cho biết pic giả phân tử mất nước với ion [M-H2O+H]+ = 409 ứng với công thức C30H49 Do vậy, hợp chất DSH.5 có công thức phân tử là C30H50O

Phân tích các phổ 1

H-NMR, 13C-DEPT và HSQC của DSH.5 cho biết một số tín hiệu đặc thù với 7 nhóm metyl (CH3) ở các độ dịch chuyển hóa học 0,96 (3H, s, H-23); 1,03 (3H, s, H-24); 0,76 (s); (3H, s, H-25); 0,84 (3H, s, H-26); 0,95 (3H, s, H-27); 0,79 (3H, s, H-28); 1,68 (3H, s, H-30); một nhóm metylen olefin (CH2) liên kết đôi cho độ chuyển dịch hoá học ở δH 4,684/4,679

và 4,564/4,559, (2H, dd, J=5Hz, H-29)

Phân tích phổ 13

C-NMR và DEPT của DSH.5 còn cho biết có tổng số 30

C trong phân tử gồm: 7 nhóm CH3 ở các δC 27,48 (C-23); 15,37 (C-24); 16,13 (C-25); 16,00 (C-26); 14,57 (C-27); 18,0 (C-28); 19,33 (C-30).; 11 nhóm CH2

ở các δC 38.74 (C-1); 27,48 (C-2); 18,34 (C-6); 34,32 (C-7); 20,96 (C-11);