2.4.2.1 Xác định đường khử
- Lấy 4-5 ml dịch chiết trong etanol (cặn tổng) với 4-5 ml thuốc thử Felinh, đun sôi 2-3 phút, nếu có kết tủa da cam của Cu2O chứng tỏ có mặt đường.
2.4.2.2 Xác định định tính ankaloit
- Xác định bằng thuốc thử Dragendooc. Thuốc thử Dragendooc được chuẩn bị từ hai dung dịch sau:
Dung dịch 1: Lấy 0,85 gam NaHSO3 hòa tan trong 40 ml nước cất và 10 ml axit axetic băng.
Dung dịch 2: Lấy 8 gam KI hòa tan trong 20 ml nước cất.
Lấy 2ml dung dịch 1 trộn với 5ml dung dịch 2 và thêm 20 ml axit axetic sau đó thêm nước đến 100 ml là được thuốc thử Dragendooc.
Nếu có mặt ancaloit thì thấy xuất hiện màu da cam sáng khi cho dịch chiết tác dụng với thuốc thử Dragendooc.
2.4.2.3 Xác định định tính steroid
- Phản ứng màu libecman-Bơcsa. Thực hiện theo 2 cách:
Cách 1: Thực hiện theo ston: cho vài ml dịch chiết tổng vào ống nghiệm, thêm vài giọt CH3COOH đặc và vài ml hỗn hợp (CH3CO)2O: H2SO4 (50:1). Màu thay đổi từ hồng sang xanh lá cây.
Cách 2: Thực hiện theo Brietcoc: cho vài mg dịch chiết trong CHCl3, thêm vào 2ml thuốc thử (CH3CO)2O: H2SO4 (20:1). Màu sẽ chuyển từ đỏ - hồng - xanh lá cây – chàm tùy thuộc vào các loại steroid.
24
2.4.2.4. Xác định định tính poliphenol
- Phản ứng với dung dịch FeCl3 1%: lấy khoảng 1ml dịch chiết etylaxetat phản ứng với FeCl3 1%, nếu phản ứng tạo ra màu xanh lục tức là dịch chiết có chất có gốc phenol.
2.4.2.5 Xác định định tính flavoit
- Phản ứng xianidin: Lấy 1ml dịch chiết etylaxetat cho vào ống nghiệm, thêm vài giọt HCl đặc + 1 mảnh Mg, đun nhẹ, dung dịch chuyển sang màu hồng.
- Phản ứng với NH3 đặc, màu vàng chỗ chấm đậm hơn chứng tỏ có flovonoit.
2.4.2.6. Xác định định tính cumarin
- Cho vào 2 ống nghiệm 2 ml dịch chiết trong methanol, ống 1 thêm 0,5 ml NaOH 10%. Sau đun cả 2 ống nghiệm trên bếp cách thủy đến sôi rồi làm lạnh. Thêm vào mỗi ống 4 ml nước cất. Quan sát thấy chất lỏng ống 1 trong suốt hơn so với ống 2 và khi axit hóa bằng vài giọt HCl đặc nếu có kết tủa bông thì kết luận có cumarin.
2.4.2.7. Xác định định tính saponin
-Sự tạo bọt: cho vào 2 ống nghiệm, ống 1 cho 5 ml dung dịch HCl 0,1N. Ống 2 cho 5 ml dung dịch NaOH 0,1N. Cho vào mỗi ống 3-5 giọt dịch chiết tổng, lắc đều, để yên, quan sát. Nếu độ bền của cột bọt ống 1 bền hơn ống 2 chứng tỏ mẫu nghiên cứu có saponin tritecpen, ngược lại có saponin steroid.
-Phản ứng màu Liberman: dung dịch chiết + 2 ml (CH3CO)2O, lắc đều rồi cho từ từ H2SO4 đặc từ đáy lên, xuất hiện màu đỏ tím nếu có saponin.
2.4.2.8. Xác định định tính glycozit tim
Phản ứng Kelle-Kiliani: thuốc thử Kelle-Kiliani gồm 2 dung dịch: Dung dịch 1: 100 ml CH3COOH loãng + 1 ml FeCl3 5%.
Dung dịch 2: 100 ml H2SO4 đặc + 1ml FeCl3 5%.
Lấy vài mg cặn dịch chiết cho vào ống nghiệm, thêm 1 ml dung dịch 1, lắc đều cho tan, thêm từ từ 1-2 ml dung dịch 2 theo thành ống nghiệm, quan sát sự
25
xuất hiện màu giữa 2 lớp chất lỏng. Không xuất hiện màu là phản ứng âm tính với glycozit tim.
2.4.3 Thử hoạt tính sinh học
* Đối tượng thử: Thử hoạt tính chống oxi hóa PDDH, được thực hiện tại phòng Hóa sinh ứng dụng- viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam.
* Nguyên tắc: Các chất có khả năng kháng oxi hóa sẽ trung hòa gốc tự do bằng cách cho hydrogen, làm giảm độ hấp thụ tại bước sóng cực đại và màu của dung dịch phản ứng sẽ nhạt dần, chuyển từ tím sang vàng nhạt. Phản ứng trung hòa gốc DPPH của các chất kháng oxy hóa được minh họa bằng phản ứng dưới đây:
Hình 2.1 Phản ứng trung hòa gốc DPPH
Bảng 2.2: Kết quả thử hoạt tính sinh học của dịch chiết tổng cây kim tiền thảo
STT Ký hiệu mẫu EC50 (μg/ml)
1 kim tiền thảo >128
Tham khảo Resveratrol 8,3
26