styracifolium (Osb.) Merr.) 2.5.1. Dịch chiết n-hexan
Từ 7 gam cặn dịch n-hexan của toàn bộ phần trên mặt đất (thân, lá) của cây kim tiền thảo, kí hiệu (DSH) được tiến hành phân lập các chất trên sắc kí cột silicagel với cỡ hạt 0,040-0,063 mm. Hệ dung môi rửa giải là: n- hexan : etylaxetat với tỷ lệ theo độ tăng dần của độ phân cực dung môi từ 0 đến 100% etylaxetat (Cụ thể: hệ dung môi n-hexan: etylaxetat lần lượt các tỉ lệ 95-5, 90- 10… đến 0-100). Các phân đoạn được thu từng lọ nhỏ, được kiểm tra bằng sắc kí lớp mỏng (bản mỏng), các phân đoạn giống nhau đem gộp lại và cất loại dung môi để thu được chất sạch.
2.5.1.1. Chất DSH.5
Ở phân đoạn thứ 5 sau khi cất loại dung môi, thu được 150 mg cặn, tiếp tục cho cặn thu được lên cột silicagel tiến hành rửa giải cột bằng hệ dung môi (n-hexan - etylaxetat = 98:2), phát hiện bằng vanalin 1% trong dung dịch methanol-H2SO4 5%, thu được 18mg tinh thể hình kim có màu trắng, có Rf = 0,78 trong hệ dung môi A ( n-hexan-etylaxetat= 70: 10). Tiến hành đo phổ chất DSH.5 và so sánh các thông tin phổ đo được chúng tôi thấy các thông số tương đương phổ của Lupeol.
2.5.1.2. Chất DSH.7
Tại phân đoạn thứ 7 dung dịch thu được sau khi cất loại dung môi, cặn thu được (175mg) được tiếp tục đưa lên cột silicagel tiến hành rửa giải cột bằng hệ dung môi (n-hexan - etylaxetat= 95: 5 ). kiểm tra bằng sắc kí lớp mỏng phát hiện bằng vanalin 1% trong dung dịch methanol-H2SO4 5%, thu được 22 mg chất rắn vô định hình có Rf= 0,75 trong hệ dung môi B (n-hexan - etylaxetat = 50:10, nóng chảy ở 640C.
Tiến hành đo phổ của hợp chất DSH.7 chúng tôi nhận thấy hợp chất DSH.7 là một ancol mạnh dài có công thức phân tử được xác định là: C32H66O
27
Sau khi so sánh các dữ liệu trên các phổ đo được hợp chất DSH.7 là: dotriancontan-1ol.
2.5.1.3. Chất DSH.10
Phân đoạn thứ 10 thu được 210mg cặn. Sau khi tiến hành rửa giải cột bằng hệ dung mỗi n-hexan-etylaxetat (90:10) đối với lượng cặn thu được ở phân đoạn này. Dung dịch thu được tiến hành cất loại dung môi thu được 21mg tinh thể hình kim, không màu, nhiệt độ nóng chảy ở 139-1400
C có Rf= 0,72 trong hệ dung môi C (n-hexan - etylaxetat = 75:25).
Dựa vào các phương pháp vật lý để khảo sát cấu trúc của chất DSH.10 chúng tôi xác định được hợp chất DSH.10 là hợp chất -sitosterol.
2.5.2 Dịch chiết etylaxetat
Cất loại dung môi dưới áp suất giảm, sau đó làm khô bằng Na2SO4 khan. Với phương pháp làm tương tự như các phần 2.4.1 và 2.4.2 từ 6,5 gam dịch chiết ethyl acetate được đưa lên cột silica gel với cỡ hạt 0,040-0,063 mm, giải hấp bằng dung môi chlorofom: metanol (với lượng metanol tăng dần:0-30%) thu được 10 phân đoạn. Kiểm tra cặn thu được trên sắc kí lợp mỏng và hiện màu bằng thuốc thử vanilin - H2SO4 5%, sau đó có phân đoạn giống nhau được dồn lại đem cất loại dung môi.
2.5.2.1. Chất DSE.5
Phân đoạn thứ 5 thu được 120mg cặn, sau đó được làm sạch lại trên cột silicagel (hệ dung môi: chlorofom - metanol = 97: 3) thu được 38 mg chất DSE.5. Đây là chất bột màu trắng dạng vô định hình có Rf= 0,75 trong hệ dung môi chlorofom - metanol tỉ lệ (70:10) và có nhiệt độ nóng chảy 238-2400C. Tiến hành đo chất DSE.5 chúng tôi thu được các thông tin phổ như sau:
Phổ FT-IR có các đỉnh phổ νOH = 3419cm-1, νCH = 2937cm-1, νC=O =1693 cm-1, νC=C = 1456 cm-1 và νC=C = 1379cm-1 .
Phổ 1
H-NMR (500MHz, DMSO-1H). δ(ppm): 0,77ppm (3H, s, 24-CH3), 0,81ppm (3H, s, 26-CH3), 0,86ppm (3H, d, J 6,4Hz, 30-CH3), 0,90ppm (1H, d,
28 J 4,2Hz, 25-CH3), 0,92ppm (3H, s, 29-CH3), 0,94ppm (3H, d, J 6,2Hz, 23- CH3), 1,09ppm (3H, s, 27-CH3), 3,20ppm (1H, dd, J 6,1Hz và 9,1Hz, H-3), 0,72ppm (1H, d, J 11,2Hz, H-5), 2,19ppm (1H, d, J 11,2Hz, H-18) 5,24ppm (1H, td, J 3,5Hz và 6,9Hz), 125,38ppm. 13 C-NMR (DMSO-C13CPD). δ(ppm): C1: 38,23 ppm (t), C2: 28,25ppm (t), C3: 7684ppm (d), C4: 38,37ppm (s), C5: 54,78ppm (d), C6: 17,08ppm (t), C7: 32,71ppm (t), C8: 30,01ppm (s), C9: 46,82ppm (d), C10: 36,52ppm (s), C11: 23,26ppm (t), C12: 124,57ppm (d), C13: 138,18ppm (s), C14: 41,64ppm (s), C15: 28,58ppm (t), C16: 23,08ppm (t), C17: 47,02ppm (s), C18: 52,38ppm (d), C19: 38,99 ppm (d), C20: 38,50ppm (d), C21: 30,18 ppm (t), C22: 36,82ppm (t), C23: 28,25ppm (q), C24: 17,00ppm (q), C25: 15,22ppm (q), C26: 18,00 (q), C27: 22,84ppm (q), C28: 179,27ppm (s), C29: 21,07ppm (q), C30: 16,91 (q). 2.5.2.2. Chất DSE.8
Phân đoạn thứ 8 thu được 150 mg cặn. Tiến hành rửa giải cột bằng hệ dung môi chlorofom - metanol tỉ lệ (83:17) thu được 24 mg chất rắn vô định hình, nóng chảy ở 269-2700
C, có Rf = 0,53 trong hệ dung môi E (chlorofom – metanol = 50:10) kí hiệu là chất DSE.8. Bằng các phương pháp xác định cấu trúc chúng tôi xác định chất DSE.8 là β-Stiosterol-3-O-β-D-glucopyranosit.
29
CHƢƠNG 3: THẢO LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Nguyên tắc chung
Trong quá trình nghiên cứu hóa thực vật cần phải tôn trọng nguyên tắc chung là không được làm thay đổi cấu trúc hóa học của các chất sẵn có trong thực vật và không làm ảnh hưởng đến thành phần hoá học của chúng tại thời điểm lấy mẫu. Như vậy, ngay sau khi mẫu thu hái xong phải được diệt men để tránh sự chuyển hoá do các quá trình sinh tổng hợp xảy ra ở thực vật, sấy khô ở nhiệt độ thích hợp, bảo quản mẫu trong điều kiện khô ráo.
Để tách các chất ra khỏi thực vật có thể được tiến hành bằng nhiều cách khác nhau: ép lấy dầu béo, cất lôi cuốn bằng hơi nước để tách các tinh dầu, ngâm chiết bằng dung môi hữu cơ… Tuy nhiên có hai phương pháp phổ biến hơn cả để tách các chất ra khỏi thực vật:
Cách 1: Trước tiên chiết bằng dung môi rượu-nước để tách hầu hết các
chất ra khỏi thực vật. Sau đó chiết sàng lọc bằng các dung môi từ không phân cực đến các dung môi có độ phân cực tăng dần. Các dịch chiết chứa các hợp chất có độ phân cực gần nhau sẽ được cất đuổi dung môi, bảo quản dùng cho các quá trình tách tiếp theo.
Cách 2: Chiết và phân lập các chất mẫu thực vật bằng các loại dung môi
từ không phân cực đến có độ phân cực tăng dần như lần lươt là: n-hexan, clorofom, etylaxetat, n-butanol, metanol(etanol), etanol-nước. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Việc chiết lấy chất từ lá thực vật (Desmodium styracifolium) được thực hiện theo cách 1 (sơ đồ 2.1).
Các dịch chiết tổng số và các phần chiết thô đem thử nghiệm với các tác động sinh học và độc tố tế bào nhằm giúp cho việc định hướng tìm kiếm các chất có hoạt tính sinh lý cao trong những dịch chiết.
30
3.2. Phân tích định tính và phát hiện các nhóm chất
Dùng các thuốc thử đặc hiệu để phát hiện các nhóm hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh lý cao trong thực vật [3] cho thấy trong dịch chiết bằng tổng số của
cây Desmodium styracifolium (Osb.) Merr., có chứa streroit, triterpenoit, các hợp
chất flavonoit, cũng ở các phần dịch chiết này còn có các đường khử, ancaloit. Không phát hiện được dẫn xuất các hợp chất xianua các glycozit tim trong các dịch chiết của cây kim tiền thảo. Kết quả của các phản ứng định tính để xác định các nhóm hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh lý cao được chỉ ra ở bảng 3.1.
Bảng 3.1: Phát hiện các nhóm chất trong cây kim tiền thảo
STT Nhóm chất Thuốc thử Hiện tƣợng Kết quả
1 Đường khử Felinh Cho kết tủa màu đỏ gạch ++ 2 Ankaloit Dragendooc Màu vàng da cam + 3 Steroit Libecman-Bơcsa Từ hồng đến xanh lá cây ++
4 Flavonoit Xianidin
Từ vàng da cam, đến
hồng, đến đỏ ++
NH3 đặc Màu vàng đậm hơn ++ 5 Poliphenol FeCl3 1% Màu xanh lục ++ 6 Cumarin Axit và kiềm Kết tủa bông ++ 7 Glycozit tim Kelle-Kiliani Không có hiện tượng gì -
8 Saponin Liberman Màu đỏ tím ++
Tạo bọt Bọt bền trong kiềm ++
Ghi chú: Dấu (+): Phản ứng dương tính.
Dấu: (++): Phản ứng dương tính rất rõ. Dấu (-): Không có.
3.3. Phân lập và nhận dạng các hợp chất có trong các dịch chiết khác nhau của cây kim tiền thảo của cây kim tiền thảo
Các dịch chiết đều là những hỗn hợp phức tạp chứa các hợp chất khác nhau. Để phân lập từng chất ra khỏi hỗn hợp đã sử dụng các phương pháp sắc
31
kí cột, chất hấp phụ dùng là silicagel, các hệ dung môi rửa giải thích hợp và thường phải lặp lại nhiều lần.
Việc tinh chế các chất thường dùng phuơng pháp kết tinh lại trong dung môi hoặc hệ dung môi thích hợp. Nhờ cách làm đó đã thu được các đơn chất có độ tinh khiết cao, đáp ứng các yêu cầu để khảo sát tính chất hoá lý và xác định quang phổ của chúng.
Khi phân lập các thành phần hoá học từ cây kim tiền thảo có tên khoa học
là Desmodium styracifolium (Osb.) Merr., được thực hiện như trong sơ đồ2.1. Bằng
phương pháp phân lập trên, từ dịch chiết bằng n- hexan của cây kim tiền thảo chúng tôi đã thu được 3 hợp chất sạch là: một tritecpen, một ancol mạch dài và một steroit; còn dịch chiết etylaxetat phân lập được một β-sitosterolglucozit và axit ursolic.
3.3.1. Chất DSH.5 - Lupeol
DSH.5 là chất bột rắn trắng (18 mg), nhiệt độ nóng chảy: 188 – 189 0 C. Phổ IR của DSH.5 cho biết một số dao động liên kết ở các tần số (ν cm-1) đặc trưng như: 3338(OH), 2875 và 2968 (CH), 1638 (C=C). Phổ LC/MS của DSH.5 cho biết pic giả phân tử mất nước với ion [M-H2O+H]+ = 409 ứng với công thức C30H49. Do vậy, hợp chất DSH.5 có công thức phân tử là C30H50O.
Phân tích các phổ 1
H-NMR, 13C-DEPT và HSQC của DSH.5 cho biết một số tín hiệu đặc thù với 7 nhóm metyl (CH3) ở các độ dịch chuyển hóa học 0,96 (3H, s, H-23); 1,03 (3H, s, H-24); 0,76 (s); (3H, s, H-25); 0,84 (3H, s, H- 26); 0,95 (3H, s, H-27); 0,79 (3H, s, H-28); 1,68 (3H, s, H-30); một nhóm metylen olefin (CH2) liên kết đôi cho độ chuyển dịch hoá học ở δH 4,684/4,679 và 4,564/4,559, (2H, dd, J=5Hz, H-29). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Phân tích phổ 13
C-NMR và DEPT của DSH.5 còn cho biết có tổng số 30 C trong phân tử gồm: 7 nhóm CH3 ở các δC 27,48 (C-23); 15,37 (C-24); 16,13 (C-25); 16,00 (C-26); 14,57 (C-27); 18,0 (C-28); 19,33 (C-30).; 11 nhóm CH2 ở các δC 38.74 (C-1); 27,48 (C-2); 18,34 (C-6); 34,32 (C-7); 20,96 (C-11);
32
25,19 (C-12); 27,44 (C-15); 35,61 (C-16); 29,88 (C-21); 40,03 (C-22) và 109,32 là độ chuyển dịch hoá học của nguyên tử cacbon trong nhóm CH2 chưa no (C-29); 6 nhóm CH ở các δC 79,03 (C-3); 55,34 (C-5); 50,48 (C-9); 38,09 (C-13); 48,34 (C-18) và 48,01 (C-19); và 6 C bậc 4 với các δC bằng 38,88 (C- 4); 40,87 (C-8); 37,20 (C-10); 42,84 (C-14); 43,02 (C-17); và 150,98 (C-20).
Các số liệu phổ NMR của hợp chất DSH.5 được trình bày ở bảng 3.2 và các phổ đồ (Hình 3.3-3.8). Qua phân tích các số liệu phổ của DSH.5 so sánh với số liệu phổ của lupeol trong tài liệu [35] cho phép khẳng định hợp chất DSH.5 thu được từ dịch n-hexan của thực vật kim tiền thảo chính là lupeol (xem hình 3.1).
33
Bảng 3.2. Các số liệu NMR và các tƣơng tác xa trong DSH.5
TT H (δ ppm) C (δ ppm) H → C (HMBC) CHn (DEPT) DSH.5 DSH.5 Lupeol [35] 1 0,91 38.74 38,7 2; 10 CH2 2 27,48 27,4 1; 3 CH2 3 dd, 3,199/3,189 và 3,176/3,166; J=10Hz 79,03 78,9 2; 4 CH 4 - 38,88 38,8 - C 5 0,69/0,67 55,34 55,3 4; 6; 10 CH 6 1,4/1,5 18,34 18,3 5; 7 CH2 7 1,39 34,32 34,2 6; 8 CH2 8 - 40,87 40,8 - C 9 1,29 50,48 50,4 8; 10; 11 CH 10 - 37,20 37,1 - C 11 1,23/1,43 20,96 20,9 9; 12 CH2 12 1,09/1,68 25,19 25,1 11; 13 CH2 13 1,65 38,09 38,0 12; 14; 18 CH 14 - 42,84 42,8 - C 15 1,58/1,7 27,44 27,4 14; 16 CH2 16 1,38/1,48 35,61 35,5 15; 17 CH2 17 - 43,02 43,0 - C 18 1,37 48,34 48,2 13; 17; 19 CH 19 2,38 48,01 47,9 18; 20; 21 CH 20 - 150,98 150,9 - C 21 1,3/1,9 29,88 29,8 19; 22 CH2 22 1,2/1,4 40,03 40,0 21; 23 CH2 23 0,96 (s) 27,48 28,0 4 CH3 24 1,03 (s) 15,37 15,4 4 CH3 25 0,76 (s) 16,13 16,1 10 CH3 26 0,84 (s) 16,00 15,9 8 CH3 27 0,95 (s) 14,57 14,5 14 CH3 28 0,79 (s) 18,0 18,0 17 CH3
34
35
36
Hình 3.4 Phổ 13
37
38
39
40
41
3.3.2. Chất DSH.7 - ancol mạch dài C32H66O (dotriacontan-1ol)
Sau khi đã thu được chất rắn DSH.7 tiếp tục rửa cột bằng hệ dung môi n-hexan-etylaxetat (95:5) thu được 22 mg chất rắn vô định hình có Rf= 0,75 trong hệ dung môi n-hexan - etylaxetat (70:10) , nóng chảy ở 640
C. Quan sát trên phổ 1
H-NMR của chất DSH.7 cho thấy tín hiệu của duy nhất 1 nhóm CH3 ở độ chuyển dịch hóa học δH ở 0,88ppm dạng triplet J=6,5Hz tương ứng với 3 proton. Tín hiệu ở 3,63ppm dạng triplet với J=6,6pHz tương ứng với 2 proton của nhóm CH2 liên kết với oxi trong nhóm OH như vậy chứng tỏ ancol mạch dài là ancol bậc 1, mạch cacbon là mạch hở không phân nhánh. Đường tích phân còn cho thấy tín hiệu của 58 proton ở vùng 1,33ppm và 4 proton ở 1,51 -1,58ppm đều là các tín hiệu của 2 nhóm CH2 ở vị trí bên cạnh nhóm CH2OH Như vậy tổng cộng có 65 proton trong phần gốc ankyl của phân tử chất DSH.7.
Quan sát phổ 13C-NMR và phổ DEPT cho thấy phân tử chât DSH.7 chỉ có một nhóm CH3 có δC= 14,09ppm, không có nguyên tử cacbon bậc 3, bậc bốn nào, một nhóm CH2 có δC= 63,32ppm đặc trương cho nguyên tử cacbon chứa liên kết OH, một nhóm CH2 ở δC= 32,84ppm đặc trưng cho cacbon ở vị trí anpha của nhóm CH2OH các nguyên tử cacbon còn lại cho độ chuyển dịch hoá học trong vùng từ 22 đến 31ppm.
Sơ bộ chúng tôi quy kết công thức của chất DSH.7 là C32H65OH, có cấu trúc như sau và gọi tên theo danh pháp hệ thống là dotriacontan-1-ol.
42
Hình 3.10 Phổ 1
43
Hình 3.11 Phổ 13
44
45
3.3.3. Chất DSH.10: -sitosterol (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chất DSH.10 thu được từ cặn n-hexan của lá và thân cây kim tiền thảo (khi rửa giải cột sắc kí bằng hệ dung môi n-hexan-etyl axetat tỉ lệ (90:10), là những tinh thể hình kim, không màu, nhiệt độ nóng chảy ở 139-1400C, khối lượng 21mg.
Chất DSH.10 tan tốt trong n-hexan, chlorofom, có Rf = 0,72 trong hệ dung môi n-hexan – etylaxetat (75:25). Phân tích phổ 13C-NMR, phổ DEPT cho biết hợp chất này 6 nhóm CH3, 11 nhóm CH2, 9 nhóm CH và 3C bậc bốn. Phổ EI- MS cho biết pic [M+H]+
ở 415 m/z, suy ra chất DSH.10 có khối lượng phân tử 414 amu, từ đó có thể xây dựng công thức phân tử của chất DSH.10 là C29H50O.
So sánh phổ EI-MS, phổ hồng ngoại, phổ 1
H-NMR và phổ 13C-NMR của chất DSH.10 với số liệu phổ EI-MS, phổ hồng ngoại, phổ 1
H-NMR và phổ 13C- NMR của β-sitosterol hoàn toàn giống nhau. Khi trộn lẫn với chất chuẩn cho một hỗn hợp có nhiệt độ nóng chảy không thay đổi. Từ đó có thể kết luận chất DSH.10 làβ-sitosterol.
Độ dịch chuyển hoá học các nguyên tử C của DSH.10 được nêu trong
bảng 3.3. H3C CH3 CH3 H3C CH3 CH3 HO
46
47
Hình 3.15 Phổ 1
48
Hình 3.16 Phổ 13
49
Hình 3.17 Phổ 13
C-DEPT của (DSH.10)
50
Chất này phân lập được từ phân đoạn phân cực thấp của cặn chiết n-hexan và cặn chiết etylaxetat là chất bột vô định hình, tan trong hệ dung môi clorofom– metanol, nóng chảy ở 238-240oC.
Phổ FT-IR cho biết có nhóm OH hấp thụ ở 3419cm-1, nhóm CH ở 2937cm- 1, đặc trưng cho nhóm cacbonyl C=O hấp thụ ở 1693, ở vùng 1456 và 1379 đặc trưng cho liên kết C=C.
Phổ 1
H-NMR cho biết có 7 tín hiệu của nhóm CH3 ở độ dịch chuyển 0,77ppm (3H, s, 24-CH3), 0,81ppm (3H, s, 26-CH3), 0,86 (3H, d, J 6,4Hz, 30- CH3), 0,90ppm (1H, d, J 4,2Hz, 25-CH3), 0,92 (3H, s, 29-CH3), 0,94 (3H, d, J 6,2Hz, 23-CH3), 1,09 (3H, s, 27-CH3). Tín hiệu của proton CH gắn với nhóm OH ở H 3,20ppm (1H, dd, J 6,1Hz và 9,1Hz, H-3), và 0,72ppm (1H, d, J 11,2Hz, H-5) (Hình 3.21). Tín hiệu proton ở độ dịch chuyển H 2,19ppm (1H, d, J 11,2Hz, H-18) của nhóm CH có tương tác với nhóm CH3 là đặc trưng cho các tritecpen thuộc kiểu khung ursan. Ở độ dịch chuyển H 5,24ppm (1H, td, J 3,5Hz và 6,9Hz) là tín hiệu của proton H-12, nhóm CH nối đôi với cacbon tương ứng là δC12 125,38ppm. Tất cả những dữ liệu trên cho phép kết luận DSE.5 là một tritecpen thuộc kiểu khung ursan.
Kết hợp các dữ liệu phổ 13
C-NMR và DEPT (Hình 3.22 và 3.23) cho biết