Để phân lập được các hợp chất trong bất kỳ một thực vật nào mà không làm ảnh hưởng tới thành phần hóa học có trong đối tượng thì trước trước khi ngâm chiết bằng dung môi hữu cơ, mẫu thực vật phải được đưa đi khử men ngay sau khi thu mẫu và sấy khô ở điều kiện thích hợp [2].
Về nguyên tắc ngâm chiết mẫu thực vật có thể tiến hành theo 2 cách phổ biến sau:
1. Chiết và phân lập các hợp chất từ mẫu thực vật bằng các loại dung môi có độ phân cực tăng dần: ete dầu hỏa hoặc n-hexan, clorofom, etylaxetat, methanol hoặc etanol vv…
2. Chiết tổng bằng các ancol (methanol, etanol) hay hệ dung môi ancol: nước. Sau đó sàng lọc các hợp chất bằng các loại dung môi có độ phân cực tăng dần như phương pháp 1 để thu được các dịch chiết có chứa các hợp chất có độ phân cực tương đối giống nhau.
Việc chiết mẫu thực vật là cây kim tiền thảo (Desmodium styracifolium (Osb.) Merr.) được thực hiện theo phương án 2 (sơ đồ 2.1).
2.2. Đối tƣợng và phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phương pháp xử lý mẫu
Nguyên liệu để nghiên cứu gồm toàn bộ phần thân và lá của cây kim tiền thảo, được thu hái vào tháng 7, 8 năm 2013 tại huyện Phú Bình, tỉnh Thái Nguyên.
Cây kim tiền thảo (còn được gọi với tên khác như: vảy rồng, mắt trâu, đồng tiền lông) được PGS. TS. Lê Ngọc Công khoa Sinh kĩ thuật nông nghiệp- Trường Đại Học Sư Phạm Thái Nguyên - Đại Học Thái Nguyên. Xác định có tên khoa học là: Desmodium styracifolium (Osb.) Merr, thuộc họ cánh bướm- Fabaceae .
Mẫu cây tươi được thu hái gồm cả thân, lá được rửa sạch, sau đó sấy khô ở nhiệt độ 40-500C cho tới khi khô hoàn toàn. Mẫu khô được cắt nhỏ và ngâm chiết trong metanol 900
ở nhiệt độ phòng nhiều lần, liên tục trong 15 ngày, 2 ngày chiết dịch 1 lần.
20
Sau khi cất loại dung môi bằng máy cất quay, áp suất thấp, nhiệt độ 400 C căn được cô đến đặc dưới dạng xirô. Tiếp theo, cặn được lắc, chiết lần lượt bằng các loại dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, clorofom, etylaxetat và n-butanol. Các dịch chiết được đuổi kiệt dung môi bằng thiết bị cất quay ở nhiệt độ 400C dưới áp suất thấp. Các cặn thô được phân chia bằng sắc kí cột nhồi silicagel với các hệ dung môi rửa giải có độ phân cực tăng dần để phân lập các chất có độ phân cực gần giống nhau, kêt tinh phân đoạn và kết tinh lại trong hệ dung môi thích hợp để thu được các chất sạch.
2.2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất từ các dịch chiết
Để thực hiện, phân lập được những hợp chất sạch từ các dịch thô khác nhau của cây kim tiền thảo, chúng tôi đã phối hợp sử dụng các phương pháp sắc kí và kết tinh lại trong dung môi thích hợp. Cụ thể các phương pháp gồm:
- Sắc kí lớp mỏng (SKLM).
- Sắc kí cột silicagel, dùng silicagel Merck 63-200nm. - Kết tinh phân đoạn và kết tinh lại.
2.2.3. Phương pháp khảo sát và xác định cấu trúc hóa học các hợp chất
Các chất kết tinh phân lập ra được xác định những hằng số vật lý đặc trưng: màu sắc, mùi vị, hệ số Rf, điểm nóng chảy, ghi các loại phổ như: phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1
H-NMR, phổ 13C-NMR và các phổ phân giải cao. Các số liệu phổ thực nghiệm của các chất sạch được dùng để nhận dạng cấu trúc hóa học của chúng.
2.3. Dụng cụ, hóa chất và thiết bị nghiên cứu
2.3.1. Dụng cụ và hóa chất
Các loại dung môi để ngâm chiết mẫu là các loại tinh khiết (pure), còn các loại dung môi dùng để sắc kí cột, sắc kí lớp mỏng, dùng để kết tinh lại là hóa chất loại tinh khiết phân tích (PA).
Sắc kí lớp mỏng dùng bản mỏng đế nhôm DC-Alufolien Kiesegel 60 F254 tráng sẵn, độ dày 0,2 mm được sử dụng để xác định sơ bộ số thành phần có trong các dịch chiết, các phân đoạn chạy cột và kiểm tra sơ bộ độ sạch của sản phẩm thu được.
21
Các hệ dung môi khai triển SKLM:
1. n-hexan- etylaxatat 70 : 10 Hệ A 2. n-hexan- etylaxatat 50 : 10 Hệ B 3. n-hexan- etylaxatat 75: 25 Hệ C 4. Clorofom- methanol 70: 10 Hệ D 5. Clorofom- methanol 50: 10 Hệ E 6. Dung dịch HCl 2N.
Các bản SKLM sau khi sấy khô được soi dưới đèn tử ngoại (UV- BIOBLOCK) ở bước sóng λ= 254 nm và 365 nm. Thuốc thử để hiện màu là vanillin 1% trong dung dịch methanol H2SO4 5%, sau đó sấy trên 1000C.
Các giá trị Rf trong hệ dung môi triển khai có biểu thức: Rf = Chiều dài di chuyển của chất thử
Chiều dài di chuyển của dung môi
2.3.2. Thiết bị nghiên cứu
- Nhiệt độ nóng chảy đo trên máy boetus (Đức), hoặc trên máy Eletronthermal IA-9200.
- Phổ hồng ngoại ghi trên máy IMPACT- 410 dạng viên nén KBr
- Phổ 1H-NMR và 13C-NMR ghi trên máy Bruker 500Hz, nội chuẩn TMS, dung môi CDCl3, DMSO, aceton-D6.
- Phổ MS ghi trên máy MC-MSD Trap –SL
2.4. Các dịch chiết từ cây kim tiền thảo (Desmodium styracifolium (Osb.) Merr.)
2.4.1. Các dịch chiết
Toàn bộ phần trên mặt đất của cây kim tiền thảo đã phơi khô ở nơi thoáng ít nắng to, nghiền nhỏ được ngâm chiết kiệt bằng MeOH : H2O (85:15) ở nhiệt độ phòng cho đến khi thu được dịch không màu. Dịch chiết được cất loại hết dung môi ở áp suất giảm đến dạng cao khô, xác đinh khối lượng cặn khô, sau đó thêm nước vào cặn và lần lượt chiết với các loại dung môi: n-hexan và ethyl acetate.
Các dịch chiết nói trên được làm khan bằng Na2SO4, lọc và cất kiệt dung môi bằng cất quay dưới áp suất giảm ở nhiệt độ ≤ 500C. Cặn được sấy khô và cân để xác định trọng lượng. Như vậy từ toàn bộ phần trên mặt đất (thân, lá) của cây kim tiền thảo đã thu nhận được 2 loại cặn là n-hexan và ethyl acetate với các ký hiệu tương ứng là: cặn trong n-hexan (DSH), cặn ethyl acetate (DSE).
22
Sơ đồ 2.1: Quy trình ngâm chiết mẫu cây kim tiền thảo
DSH.5
1. Thêm 50ml H2O
2. Chiết phân lớp lần lượt với n-hexan, EtOAc và n-butanol
1
2. Ngâm chiết trong MeOH : H2 to phòng
3. Quay cất chân không, loại methanol
chiết n-hexan Mẫu (1,2 kg) Phân đoạn 5 55555 3 EtOAc Dịch H2O còn lại Phân đoạn 5 DSE.5 DSE.8 Cặn EtOAc Cặn n-hexan Phân đoạn 8 55555 3
Phân đoạn 7 Phân đoạn 10
23
Bảng 2.1: Khối lƣợng chất tổng số đƣợc chiết từng phân đoạn của cây kim tiền thảo (Desmodium styracifolium (Osb.) Merr.)
Khối lượng nguyên liệu khô (g)
Khối lượng cặn cồn tổng số ( g)
Khối lượng cặn chiết (g) n- hexan Etylaxetat
1200 302,05 7 6,5
2.4.2 Khảo sát đặc tính các dịch chiết
2.4.2.1 Xác định đường khử
- Lấy 4-5 ml dịch chiết trong etanol (cặn tổng) với 4-5 ml thuốc thử Felinh, đun sôi 2-3 phút, nếu có kết tủa da cam của Cu2O chứng tỏ có mặt đường.
2.4.2.2 Xác định định tính ankaloit
- Xác định bằng thuốc thử Dragendooc. Thuốc thử Dragendooc được chuẩn bị từ hai dung dịch sau:
Dung dịch 1: Lấy 0,85 gam NaHSO3 hòa tan trong 40 ml nước cất và 10 ml axit axetic băng.
Dung dịch 2: Lấy 8 gam KI hòa tan trong 20 ml nước cất.
Lấy 2ml dung dịch 1 trộn với 5ml dung dịch 2 và thêm 20 ml axit axetic sau đó thêm nước đến 100 ml là được thuốc thử Dragendooc.
Nếu có mặt ancaloit thì thấy xuất hiện màu da cam sáng khi cho dịch chiết tác dụng với thuốc thử Dragendooc.
2.4.2.3 Xác định định tính steroid
- Phản ứng màu libecman-Bơcsa. Thực hiện theo 2 cách:
Cách 1: Thực hiện theo ston: cho vài ml dịch chiết tổng vào ống nghiệm, thêm vài giọt CH3COOH đặc và vài ml hỗn hợp (CH3CO)2O: H2SO4 (50:1). Màu thay đổi từ hồng sang xanh lá cây.
Cách 2: Thực hiện theo Brietcoc: cho vài mg dịch chiết trong CHCl3, thêm vào 2ml thuốc thử (CH3CO)2O: H2SO4 (20:1). Màu sẽ chuyển từ đỏ - hồng - xanh lá cây – chàm tùy thuộc vào các loại steroid.
24
2.4.2.4. Xác định định tính poliphenol
- Phản ứng với dung dịch FeCl3 1%: lấy khoảng 1ml dịch chiết etylaxetat phản ứng với FeCl3 1%, nếu phản ứng tạo ra màu xanh lục tức là dịch chiết có chất có gốc phenol.
2.4.2.5 Xác định định tính flavoit
- Phản ứng xianidin: Lấy 1ml dịch chiết etylaxetat cho vào ống nghiệm, thêm vài giọt HCl đặc + 1 mảnh Mg, đun nhẹ, dung dịch chuyển sang màu hồng.
- Phản ứng với NH3 đặc, màu vàng chỗ chấm đậm hơn chứng tỏ có flovonoit.
2.4.2.6. Xác định định tính cumarin
- Cho vào 2 ống nghiệm 2 ml dịch chiết trong methanol, ống 1 thêm 0,5 ml NaOH 10%. Sau đun cả 2 ống nghiệm trên bếp cách thủy đến sôi rồi làm lạnh. Thêm vào mỗi ống 4 ml nước cất. Quan sát thấy chất lỏng ống 1 trong suốt hơn so với ống 2 và khi axit hóa bằng vài giọt HCl đặc nếu có kết tủa bông thì kết luận có cumarin.
2.4.2.7. Xác định định tính saponin
-Sự tạo bọt: cho vào 2 ống nghiệm, ống 1 cho 5 ml dung dịch HCl 0,1N. Ống 2 cho 5 ml dung dịch NaOH 0,1N. Cho vào mỗi ống 3-5 giọt dịch chiết tổng, lắc đều, để yên, quan sát. Nếu độ bền của cột bọt ống 1 bền hơn ống 2 chứng tỏ mẫu nghiên cứu có saponin tritecpen, ngược lại có saponin steroid.
-Phản ứng màu Liberman: dung dịch chiết + 2 ml (CH3CO)2O, lắc đều rồi cho từ từ H2SO4 đặc từ đáy lên, xuất hiện màu đỏ tím nếu có saponin.
2.4.2.8. Xác định định tính glycozit tim
Phản ứng Kelle-Kiliani: thuốc thử Kelle-Kiliani gồm 2 dung dịch: Dung dịch 1: 100 ml CH3COOH loãng + 1 ml FeCl3 5%.
Dung dịch 2: 100 ml H2SO4 đặc + 1ml FeCl3 5%.
Lấy vài mg cặn dịch chiết cho vào ống nghiệm, thêm 1 ml dung dịch 1, lắc đều cho tan, thêm từ từ 1-2 ml dung dịch 2 theo thành ống nghiệm, quan sát sự
25
xuất hiện màu giữa 2 lớp chất lỏng. Không xuất hiện màu là phản ứng âm tính với glycozit tim.
2.4.3 Thử hoạt tính sinh học
* Đối tượng thử: Thử hoạt tính chống oxi hóa PDDH, được thực hiện tại phòng Hóa sinh ứng dụng- viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam.
* Nguyên tắc: Các chất có khả năng kháng oxi hóa sẽ trung hòa gốc tự do bằng cách cho hydrogen, làm giảm độ hấp thụ tại bước sóng cực đại và màu của dung dịch phản ứng sẽ nhạt dần, chuyển từ tím sang vàng nhạt. Phản ứng trung hòa gốc DPPH của các chất kháng oxy hóa được minh họa bằng phản ứng dưới đây:
Hình 2.1 Phản ứng trung hòa gốc DPPH
Bảng 2.2: Kết quả thử hoạt tính sinh học của dịch chiết tổng cây kim tiền thảo
STT Ký hiệu mẫu EC50 (μg/ml)
1 kim tiền thảo >128
Tham khảo Resveratrol 8,3
26
2.5. Phân lập, tinh chế các chất từ cây kim tiền thảo (Desmodium
styracifolium (Osb.) Merr.) 2.5.1. Dịch chiết n-hexan
Từ 7 gam cặn dịch n-hexan của toàn bộ phần trên mặt đất (thân, lá) của cây kim tiền thảo, kí hiệu (DSH) được tiến hành phân lập các chất trên sắc kí cột silicagel với cỡ hạt 0,040-0,063 mm. Hệ dung môi rửa giải là: n- hexan : etylaxetat với tỷ lệ theo độ tăng dần của độ phân cực dung môi từ 0 đến 100% etylaxetat (Cụ thể: hệ dung môi n-hexan: etylaxetat lần lượt các tỉ lệ 95-5, 90- 10… đến 0-100). Các phân đoạn được thu từng lọ nhỏ, được kiểm tra bằng sắc kí lớp mỏng (bản mỏng), các phân đoạn giống nhau đem gộp lại và cất loại dung môi để thu được chất sạch.
2.5.1.1. Chất DSH.5
Ở phân đoạn thứ 5 sau khi cất loại dung môi, thu được 150 mg cặn, tiếp tục cho cặn thu được lên cột silicagel tiến hành rửa giải cột bằng hệ dung môi (n-hexan - etylaxetat = 98:2), phát hiện bằng vanalin 1% trong dung dịch methanol-H2SO4 5%, thu được 18mg tinh thể hình kim có màu trắng, có Rf = 0,78 trong hệ dung môi A ( n-hexan-etylaxetat= 70: 10). Tiến hành đo phổ chất DSH.5 và so sánh các thông tin phổ đo được chúng tôi thấy các thông số tương đương phổ của Lupeol.
2.5.1.2. Chất DSH.7
Tại phân đoạn thứ 7 dung dịch thu được sau khi cất loại dung môi, cặn thu được (175mg) được tiếp tục đưa lên cột silicagel tiến hành rửa giải cột bằng hệ dung môi (n-hexan - etylaxetat= 95: 5 ). kiểm tra bằng sắc kí lớp mỏng phát hiện bằng vanalin 1% trong dung dịch methanol-H2SO4 5%, thu được 22 mg chất rắn vô định hình có Rf= 0,75 trong hệ dung môi B (n-hexan - etylaxetat = 50:10, nóng chảy ở 640C.
Tiến hành đo phổ của hợp chất DSH.7 chúng tôi nhận thấy hợp chất DSH.7 là một ancol mạnh dài có công thức phân tử được xác định là: C32H66O
27
Sau khi so sánh các dữ liệu trên các phổ đo được hợp chất DSH.7 là: dotriancontan-1ol.
2.5.1.3. Chất DSH.10
Phân đoạn thứ 10 thu được 210mg cặn. Sau khi tiến hành rửa giải cột bằng hệ dung mỗi n-hexan-etylaxetat (90:10) đối với lượng cặn thu được ở phân đoạn này. Dung dịch thu được tiến hành cất loại dung môi thu được 21mg tinh thể hình kim, không màu, nhiệt độ nóng chảy ở 139-1400
C có Rf= 0,72 trong hệ dung môi C (n-hexan - etylaxetat = 75:25).
Dựa vào các phương pháp vật lý để khảo sát cấu trúc của chất DSH.10 chúng tôi xác định được hợp chất DSH.10 là hợp chất -sitosterol.
2.5.2 Dịch chiết etylaxetat
Cất loại dung môi dưới áp suất giảm, sau đó làm khô bằng Na2SO4 khan. Với phương pháp làm tương tự như các phần 2.4.1 và 2.4.2 từ 6,5 gam dịch chiết ethyl acetate được đưa lên cột silica gel với cỡ hạt 0,040-0,063 mm, giải hấp bằng dung môi chlorofom: metanol (với lượng metanol tăng dần:0-30%) thu được 10 phân đoạn. Kiểm tra cặn thu được trên sắc kí lợp mỏng và hiện màu bằng thuốc thử vanilin - H2SO4 5%, sau đó có phân đoạn giống nhau được dồn lại đem cất loại dung môi.
2.5.2.1. Chất DSE.5
Phân đoạn thứ 5 thu được 120mg cặn, sau đó được làm sạch lại trên cột silicagel (hệ dung môi: chlorofom - metanol = 97: 3) thu được 38 mg chất DSE.5. Đây là chất bột màu trắng dạng vô định hình có Rf= 0,75 trong hệ dung môi chlorofom - metanol tỉ lệ (70:10) và có nhiệt độ nóng chảy 238-2400C. Tiến hành đo chất DSE.5 chúng tôi thu được các thông tin phổ như sau:
Phổ FT-IR có các đỉnh phổ νOH = 3419cm-1, νCH = 2937cm-1, νC=O =1693 cm-1, νC=C = 1456 cm-1 và νC=C = 1379cm-1 .
Phổ 1
H-NMR (500MHz, DMSO-1H). δ(ppm): 0,77ppm (3H, s, 24-CH3), 0,81ppm (3H, s, 26-CH3), 0,86ppm (3H, d, J 6,4Hz, 30-CH3), 0,90ppm (1H, d,
28 J 4,2Hz, 25-CH3), 0,92ppm (3H, s, 29-CH3), 0,94ppm (3H, d, J 6,2Hz, 23- CH3), 1,09ppm (3H, s, 27-CH3), 3,20ppm (1H, dd, J 6,1Hz và 9,1Hz, H-3), 0,72ppm (1H, d, J 11,2Hz, H-5), 2,19ppm (1H, d, J 11,2Hz, H-18) 5,24ppm (1H, td, J 3,5Hz và 6,9Hz), 125,38ppm. 13 C-NMR (DMSO-C13CPD). δ(ppm): C1: 38,23 ppm (t), C2: 28,25ppm (t), C3: 7684ppm (d), C4: 38,37ppm (s), C5: 54,78ppm (d), C6: 17,08ppm (t), C7: 32,71ppm (t), C8: 30,01ppm (s), C9: 46,82ppm (d), C10: 36,52ppm (s), C11: 23,26ppm (t), C12: 124,57ppm (d), C13: 138,18ppm (s), C14: 41,64ppm (s), C15: 28,58ppm (t), C16: 23,08ppm (t), C17: 47,02ppm (s), C18: 52,38ppm (d), C19: 38,99 ppm (d), C20: 38,50ppm (d), C21: 30,18 ppm (t), C22: 36,82ppm (t), C23: 28,25ppm (q), C24: 17,00ppm (q), C25: 15,22ppm (q), C26: 18,00 (q), C27: 22,84ppm (q), C28: 179,27ppm (s), C29: 21,07ppm (q), C30: 16,91 (q). 2.5.2.2. Chất DSE.8
Phân đoạn thứ 8 thu được 150 mg cặn. Tiến hành rửa giải cột bằng hệ dung môi chlorofom - metanol tỉ lệ (83:17) thu được 24 mg chất rắn vô định hình, nóng chảy ở 269-2700
C, có Rf = 0,53 trong hệ dung môi E (chlorofom – metanol = 50:10) kí hiệu là chất DSE.8. Bằng các phương pháp xác định cấu trúc chúng tôi xác định chất DSE.8 là β-Stiosterol-3-O-β-D-glucopyranosit.
29
CHƢƠNG 3: THẢO LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Nguyên tắc chung
Trong quá trình nghiên cứu hóa thực vật cần phải tôn trọng nguyên tắc chung là không được làm thay đổi cấu trúc hóa học của các chất sẵn có trong thực vật và không làm ảnh hưởng đến thành phần hoá học của chúng tại thời điểm lấy mẫu. Như vậy, ngay sau khi mẫu thu hái xong phải được diệt men để tránh sự chuyển hoá do các quá trình sinh tổng hợp xảy ra ở thực vật, sấy khô ở nhiệt độ thích hợp, bảo quản mẫu trong điều kiện khô ráo.
Để tách các chất ra khỏi thực vật có thể được tiến hành bằng nhiều cách khác nhau: ép lấy dầu béo, cất lôi cuốn bằng hơi nước để tách các tinh dầu,