NGHIÊN cứu THÀNH PHẦN HOÁ học cây INDIGOFERA ZOLLINGERIANA MIQ , họ FABACEAE ở QUẢNG NINH

DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1: Danh sách một số loài thực vật chi Chàm ở Việt Nam 4 Bảng 1.2: Một số hợp chất ancaloit khung indol,được phân lập từ cây Indigofera spp và Indigofera

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

DƯƠNG VĂN HÙNG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC

CÂY INDIGOFERA ZOLLINGERIANA MIQ.,

HỌ FABACEAE Ở QUẢNG NINH

Chuyên ngành: Hoá hữu cơ

Mã số : 60.44.27

LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

DƯƠNG VĂN HÙNG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC

CÂY INDIGOFERA ZOLLINGERIANA MIQ.,

HỌ FABACEAE Ở QUẢNG NINH

Chuyên ngành: Hoá hữu cơ

Mã số : 60.44.27

LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC

THÁI NGUYÊN - 2010

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN VĂN

EI-MS : Electron Impact Mass Spectroscopy

ESI-MS : Electron Spray Ionization Mass Spectroscopy

FT-IR : Fourier Transform Infrared Spectroscopy

NMR : Nuclear Magnetic Resonance

1

H-NMR : 1H-Nuclear Magnetic Resonance

13

C-NMR : 13C- Nuclear Magnetic Resonance

DEPT : Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer

COSY : Correlated Spectroscopy

HMQC : Heteronuclear Multiple - Quantum Coherence

HMBC : Heteronuclear multiple - Bond Correlation

 Các lĩnh vực khác

MIC : Minimum inhibitory concentration

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1: Danh sách một số loài thực vật chi Chàm ở Việt Nam 4

Bảng 1.2: Một số hợp chất ancaloit khung indol,được phân lập từ

cây Indigofera spp và Indigofera tinctoria

Bảng 2.3: Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định các

cặn chiếtcủa cây Indigofera zollingeriana Miq

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Ảnh 1.2 Hoa và quả cây Indigofera zollingeriana Miq 28 Hình 3.1 Phổ 1

MỞ ĐẦU

Lãnh thổ Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, với 3/4 diện tích cả nước là núi rừng trùng điệp, địa hình chia cắt nên điều kiện khí hậu cũng rất đa dạng, có nhiều tiểu vùng khí hậu khá đặc trưng Tất cả các yếu tố trên đã góp phần làm cho hệ thực vật Việt Nam rất đa dạng, phong phú

và đặc sắc Những dẫn liệu thống kê cho thấy, chỉ trong 50 năm, số loài cây

cỏ làm thuốc ở nước ta đã được phát hiện tăng lên nhanh chóng (Lã Đình Mỡi, 2007)

Năm 1952: Cả 3 nước Đông Dương mới thống kê được 1.350 loài cây làm thuốc

Năm 1986: Việt Nam thống kê được 1.836 loài cây làm thuốc

Năm 1996: Việt Nam thống kê được 3.200 loài cây làm thuốc

Năm 2005: Việt Nam thống kê được khoảng 4.000 loài cây làm thuốc

Những hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học được phân lập từ cây cỏ

đã được ứng dụng nhiều trong các ngành công nghiệp (hương liệu, mỹ phẩm, dược phẩm, …) cũng như ngành nông nghiệp (thuốc bảo vệ thực vật, thuốc kích thích tăng trưởng, …) Chúng được dùng để sản xuất thuốc chữa bệnh, thuốc bảo vệ thực vật, làm nguyên liệu cho ngành công nghiệp thực phẩm và

mĩ phẩm v.v

Kho tàng cây thuốc và bài thuốc chữa bệnh trên đất nước ta rất phong

phú và đa dạng Theo số liệu thống kê mới nhất có trên 12000 loài, trong đó

có trên 3200 loài thực vật được sử dụng làm thuốc trong y học dân gian [4]

Từ cơ sở trên cho thấy, nguồn cây thuốc dân gian cũng như các bài thuốc của đồng bào dân tộc vẫn là kho tàng vô cùng quí giá để khám phá, tìm

kiếm các loại thuốc mới có hiệu lực cao cho công tác phòng và chữa bệnh

Nghiên cứu để khai thác, kế thừa, ứng dụng và phát triển nguồn thực vật làm

thuốc đã, đang và sẽ là vấn đề có giá trị khoa học, kinh tế và xã hội rất lớn ở nước ta

Việc nghiên cứu cây thuốc sẽ giúp cho chúng ta hiểu rõ về thành phần

và cấu trúc hoá học, hoạt tính sinh học, tác dụng dược lí của cây thuốc Từ đó, người ta có thể tạo ra các chất mới có hoạt tính sinh học cao hơn để làm thuốc chữa bệnh

Vị thuốc dân gian có tên là Cây thuốc dầu với tên khoa học là Indigofera

zollingeriana Miq thuộc chi Chàm, họ Đậu (Fabaceae) mọc hoang khá phổ biến

ở Việt Nam Bằng cách theo dõi trực quan, chủ quan, vị thuốc này có đặc điểm sinh học và thu hoạch sử dụng làm thuốc như sau: Thuộc cây lá kép, có hoa màu hồng, quả dài hình trụ, có thể gieo hạt hoặc triết cành để trồng nơi đất khô ráo, đất đỏ Thu hoạch quanh năm, bộ phận thu hoạch là vỏ cây, thân cây, cành cây,

lá cây.Toàn bộ đem phơi khô âm can Có thể để dùng tươi

Dân gian dùng vị thuốc này để chữa chấn thương cấp phần mềm (gân,

cơ, dây chằng) mà không cần chỉ định phẫu thuật với tác dụng giảm đau, tiêu viêm, chống phù nề, tan máu tụ [2]

Mới đây, ở Việt Nam các nhà khoa học của Viện Khoa học thể dục thể thao đã nghiên cứu sử dụng vị thuốc này để chữa các chấn thương cấp phần mềm (gân, cơ, dây chằng) với tác dụng giảm đau, tiêu viêm, chống phù nề và tan máu tụ mà không cần chỉ định phẫu thuật, Tuy nhiên, cây này còn ít được nghiên cứu về mặt hóa học cả trong và ngoài nước Do vậy, chúng tôi chọn

cây này làm đối tượng nghiên cứu với tên đề tài: “Nghiên cứu thành phần

hoá học cây Indigofera zollingeriana Miq., họ Fabaceae ở Quảng Ninh”

Với Mục đích nghiên cứu: Xác định, tìm hiểu thành phần và cấu trúc

hoá học của các hợp chất có trong cây Indigofera zollingeriana

Các loài chủ yếu là cây bụi, một vài loài là cây thân thảo hoặc cây thân

gỗ nhỏ, cao tới 5-6 m, phần lớn rụng lá vào mùa khô hay mùa đông Lá kép lông chim lẻ với 5-31 lá chét, kích thước dài của lá dao động từ 3 tới 25 cm Hoa nhỏ, mọc thành chùm dài 2-15 cm [60]

Theo tài liệu Danh lục các loài thực vật Việt Nam, hiện nay nước ta đã phát hiện được 25 loài thuộc chi Chàm, chúng phân bố khắp nơi ở Việt Nam nhưng chủ yếu vẫn là khu vực Miền Nam [1]

Bảng 1.1 Danh sách một số loài thực vật chi Chàm ở Việt Nam [1]

Các loài chàm thường bị ấu trùng của một số loài côn trùng trong bộ

Cánh vẩy (Lepidoptera) phá hại, chẳng hạn như Agrotis segetum[60]

Cây thuốc dầu hay còn gọi là chàm lá nhọn, muỗng lá nhọn, chàm quả

trụ, có tên khoa học là Indigofera zollingeriana Miq, do TS Đỗ Hữu Thư,

Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam xác định Tiêu bản được lưu giữ tại Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật

Ảnh 1.1 Cây Indigofera zollingeriana Miq

Ảnh 1.2 Hoa và quả cây Indigofera zollingeriana Miq

Cây Indigofera zollingeriana Miq thuộc chi Chàm (Indigofera), họ đậu (Fabaceae), Lớp thực vật hai lá mầm (Magnoliopsida), Ngành thực vật có hoa

(Magnoliophyta), Giới Plantae [59]

* Đặc điểm phân bố: Cây thuốc dầu được phân bố khắp nơi ở Việt Nam, được trồng ở một số nông trường Ngoài ra, còn phát hiện có ở Trung Quốc, Đài Loan, Lào, Thái Lan, Malaixia, Inđônêxia [1]

* Dạng sống và sinh thái : Cây bụi cao 2-3 m, cành lá sum suê nằm ngang Thường gặp ở bãi cỏ ven đường, tràng cây bụi, ven rừng rậm, trong rừng thưa, ở độ cao 1200m, ra hoa vào tháng 8-9, có quả tháng 10-11 [1]

* Công dụng: Cây phân xanh, cải tại đất cho các vùng đồi núi thấp Cây che bóng cho chè và cà phê Lá làm thức ăn cho động vật nuôi Dân gian dùng vị thuốc này để chữa chấn thương cấp phần mềm ( gân, cơ, dây chằng) mà không cần chỉ định phẫu thuật với tác dụng giảm đau, tiêu viêm, chống phù

nề, tan máu tụ [1], [4]

1.2 Thành phần hóa học chi Indigofera

1.2.1 Các nghiên cứu hóa thực vật loài Indigofera zollingeriana Miq

Cho đến nay đã có khoảng 15 loài thực vật chi Indigofera được nghiên

cứu hoá thực vật [10], đã phân lập và nhận dạng được một số chất thuộc nhiều nhóm chất khác nhau là tecpenoit, flavonoit, ancaloit, glycosit, axit, este… Trên thế giới, cho đến nay vẫn chưa có một công bố nào nghiên cứu về

thành phần hóa học của cây Indigofera zollingeriana

Trong nước, Viện khoa học thể dục thể thao đã có đề tài nghiên cứu chiết xuất các hoạt chất sinh học từ cây thuốc dầu chữa chấn thương cho VĐV do BSCKI Nguyễn Văn Quang chủ nhiệm đề tài [2]

Theo kết quả nghiên cứu của đề tài trên cho thấy cây thuốc dầu có chứa nhiều các hợp chất khác nhau như các chất terpenoit (kể cả các chất khung

steran) có hoạt tính chống viêm, giảm đau, chống ung thư, kháng khuẩn; và một số các lớp chất khác như: ancaloit, caroten, …

Cũng theo kết quả đó Nguyễn Văn Quang cùng các cộng sự đã phân lập được một chất là Indigotin (C16H10N2O2), là tiền chất để bán tổng hợp các chất chống viêm, chống phù nề và chống ung thư

N H

H N O

O

1 Indigotin

Như vậy, cho đến nay người ta mới chỉ phát hiện được một chất là

indigotin trong thực vật Indigofera zollingeriana Miq

1.2.2 Thành phần hóa học của chi Indigofera

1.2.2.1 Nhóm chất ancaloit

A Các ancaloit khung indol

Bảng 1.2 Một số hợp chất ancaloit khung indol,được phân lập từ cây

Indigofera spp và Indigofera tinctoria [10]

N H O

Indigofera spp

T nc =364 oC

Chống ung thư phổi Lewis và chống ung thư Walker 256 carcinosarcoma ở chuột

T nc = 57-58 oC Kìm hãm sự tăng trưởng, nảy mầm của rau diếp

Bảng 1.3 Một số hợp chất ancaloit glycosit [10]

Tên chất

Nhóm thế

Nguồn thực vật

Tính chất vật

T nc =151 -153oC

T nc =104 -105oC

và

Indigofera linnaei

T nc =139 -141oC

Từ thực vật Indigofera endecaphylla người ta đã xác định được 3 hợp

chất ancaloit glycosit nhưng chưa xác định được cấu trúc hóa học của chúng gồm [10]:

Chất có ký hiệu Endecaphyllin I có công thức phân tử C16H26N2O12, nhiệt độ nóng chảy 139-140 o

C

Có đề xuất cho rằng chất Endecaphyllin I được tạo bởi 2 gốc nitroankanoyl glucozơ có liên quan đến glucozơ 3-nitropropanoat, đó là đề xuất có chứa một este khác với 3-nitropropanoyl thông thường

Chất có tên là Endecaphyllin C1 với công thức phân tử C12H18N2O12, nhiệt độ nóng chảy 145-146,5 oC, là một ancaloit cũng được phân lập ra từ

cây Indigofera endecaphylla

Chất còn lại có tên là Endecaphyllin A2, công thức phân tử

7 Axit 3-nitropropanoic

O

N O

O H O

Indigofera spp

T nc =64-65oC Chống trực khuẩn lao

8 Etyl 3-nitropropanoat

[11], [19], [18]

O

N O

O O

Indigofera endecaphylla

T nc = 161-165oc

N H 2 O

O

N H 2

Indigofera Pseudomonas

Có độc tính hại gan và gây quái thai

Bảng 1.5 Một số hợp chất có khung flavonol

Ký hiệu, Tên chất

Nhóm thế

Nguồn thực vật Tính chất vật lý, hoạt tính sinh học

Chất ức chế mạnh Lipoxygenaza [5], [30]

[14], [39], [47] [8], [40], [33] [15]

[29],36]

T nc =139-140oC Chất ức chế COX-1 Kháng viêm

O H

O H O

Indigofera hetrantha

T nc =141-142oC Chất ức chế mạnh

Lipoxygenaza

Indigofera microcarpa

T nc =111oC

15

[16]

methoxyphenyl)-3-methyl-5,6-

T nc =123oC

T nc 191.5oC

O

Indigofera suffruticosa

Tnc=217oc

1.2.2.3 Các hợp chất terpenoit [10]

Từ loài Indigofera longeracemosa người ta đã tách ra được một điterpen

có tên là Indigoferabieton Công thức phân tử C23H30O5, tnc=168-170 oC

18

O O

O

O

O

19

3-methyl-1-(2,4,6-

trihydroxylphenyl)-1-butanon

O H O

Chất ức chế mạnh

Chất ức chế mạnh

Lipoxygenaza

T nc

=112-115oC

1.3 Ứng dụng của thực vật chi Chàm trong thực tế

Như đã giới thiệu ở mục 1.2 thì các lớp chất trong chi Indigofera khá

đa dạng và phong phú : Ancaloit, flavonoit, tecpenoit, axit, este, aminoaxit,… nhưng số lượng chất được biết đến thì chưa nhiều, chủ yếu là các ancaloit khung indol, ancaloit glycosit với phần genin là axit 3-nitropropanoic, và khoảng hơn 10 chất là flavonoit…

Một số chất đã được nghiên cứu hoạt tính sinh học và được sử dụng phục vụ đời sống con người, đặc biệt trong việc sản xuất thuốc chữa bệnh

Chất Indirubin là một ancaloit được phân lập từ cây Indigofera spp có tác dụng ức ức chế ung thư phổi Lewis carcinoma và ung thư Walker 256

carcinosarcoma ở chuột [10], [51], [34]

Uroxanthin được phát hiện có trong các loài Polygonum tinctorium, Isatis

tinctoria, Celosia argentea và Indigofera spp, là tiền chất của Indigotin

BNC23-O có tác dụng ức chế sự tăng trưởng, nảy mầm của rau diếp [10], [46]

Chất có tên là Indospin là một amino axit từ loài Indigofera spicata và

Indigofera endecaphylla rất độc với gan và đặc biệt có thể gây quái thai [10], [25]

Chất axit 3-nitropropanoic được phân lập từ cây Indigofera spp có tác

dụng tích cực đối với việc chống trực khuẩn lao [10]

Một số loài, đặc biệt là Indigofera tinctoria và Indigofera suffruticosa

được sử dụng để sản xuất thuốc nhuộm màu chàm [60]

Một vài loài trong chi này được dùng để làm dịu các vết thương Thuốc

từ chúng nói chung có tác dụng làm mất cảm giác đau với tính chất chống

viêm sưng tấy, chứ không là thuốc giảm đau Indigofera articulata được sử dụng để chống đau răng, còn Indigofera oblongifolia được dùng để chống viêm vì các vết cắn của côn trùng hay của rắn, các vết sưng tấy Indigofera

suffruticosa và Indigofera aspalthoides cũng đã từng được sử dụng để chống

viêm sưng Nước chiết từ Indigofera arrecta được dùng để điều trị các vết

loét [60]

Chàm quả cong (chàm nhuộm) (Indigofera tinctoria, indigo naturalis)

là loài cây chàm phổ biến nhất trong số khoảng 700 loài chàm

Cây chàm Indigofera tinctoria là một loại cây bụi, họ Đậu (Fabaceae),cao 50 - 70 cm Lá kép lông chim lẻ, 7 - 15 lá chét tròn Hoa màu

đỏ vàng Loài này là một trong các nguồn cung cấp nguyên thủy của thuốc nhuộm màu chàm Nó sinh sống trong khu vực nhiệt đới và ôn đới của châu

Á, cũng như một phần của châu Phi, nhưng nguồn gốc của nó là không rõ ràng do nó đã được gieo trồng trên khắp thế giới trong nhiều thế kỷ Cây chàm quả cong chứa một chất glycosit là indican chất này khi bị thủy phân cho glucozơ và indoxyl Chất indoxyl sau khi bị oxi hóa trong không khí biến thành chất chàm indigo màu xanh đậm, rất bền [61], [64],

Loài Indigofera tinctoria toàn cây có vị đắng tính mát, có tác dụng

thanh nhiệt, lương huyết, giải độc Rễ có tác dụng lợi tiểu, lá giải độc tiêu

viêm Lá cây Indigofera tinctoria thường được dùng chữa viêm họng, sốt Ở

trộn với mật ong chữa tưa lưỡi, viêm lợi chẩy máu Ngoài ra, nước hãm toàn cây dùng chữa động kinh và rối loạn về thần kinh [4], [60]

Trong y học cổ truyền rễ và bột indigo naturalis được dùng làm thuốc chữa sốt, giải độc, lợi tiểu Theo nghiên cứu mới đây tại Đài loan thì indigo

naturalis rất hiệu nghiệm trong việc trị bệnh vảy nến (psoriasis) Vảy nến là

một bệnh da mạn tính mà hiện nay chưa có cách chữa dứt bệnh mà chỉ có một vài phương cách làm thuyên giảm Khi mắc bệnh này, trên da (thường là ở cánh tay, khuỷu tay và ống chân) có xuất hiện những mảng vảy cá (plaques) lúc đầu mầu đỏ sau chuyển sang mầu trắng bạc [64]

Theo báo cáo đăng trên Archives of Dermatology thử nghiệm lâm sàng thực hiện trên 42 bệnh nhân mắc bệnh vảy nến ít nhất được hai năm đã chứng

tỏ là indigo naturalis dùng dưới dạng phomát (ointment) tỏ ra an toàn và hiệu

nghiệm Bác sĩ Yin-Ku Lin thuộc Đại học Taoyuan (Đài loan), trưởng nhóm

nghiên cứu nói “ Loại thuốc steroid hiện đang dùng có thể gây những phản

ứng phụ như làm mỏng da, còn chất indigo naturalis này có phản ứng phụ ít hơn nhiều” Thậy vậy không có bệnh nhân nào trong nhóm thử nghiệm bị

phản ứng phụ nghiêm trọng, ngoại trừ một vài người bị dị ứng da nhẹ

Trong thử nghiệm, phomát indigo naturalis được bôi lên một bên cơ

thể của bệnh nhân còn bên kia cơ thể thì bôi pla-xơ-bô (thuốc tâm lý không có hoạt tính, không độc hại) Kết quả cho thấy là tình trạng các tổn thương có

bôi phomát indigo naturalis đã cải thiện 81 phần trăm, trong khi đó các tổn

thương bôi thuốc pla-xơ-bô chỉ thuyên giảm 26 phần trăm Trong số các bệnh

mà các tổn thương đã được bôi indigo naturalis thì 25 người lành bệnh hoàn

toàn hoặc gần như hoàn toàn

Theo các nhà nghiên cứu thì Indigo naturalis sử dụng lâu dài có thể có

tác dụng kích thích lên hệ dạ dày-ruột non và gây trở ngại cho gan Hiện nay, các nghiên cứu hãy còn đang tiếp diễn để tìm cách cải thiện sự hấp thụ của

loại phomát này (Indigo plant may treat chronic skin disease- Reuters-

11/18/2008)

Chàm bụi Indigofera suffruticosa là loài cây của nhiệt đới châu Mỹ, được

nhập vào Ấn Độ và các nước Đông Nam Á, cây được trồng để lấy lá làm chất nhuộm ở Cao Bằng, Lạng Sơn, Bắc Cạn, Tuyên Quang, Quảng Nam, Đà Nẵng…và cũng là cây phân xanh để cải tạo đất rất tốt cho các chân ruộng mầu đồng bằng và cho các vùng đồi núi Cây cũng chứa chất glycozit indican như chàm nhuộm Cây được xem như thuốc hạ nhiệt, tiêu viêm, xổ, chống co thắt, lợi tiểu và lợi tiêu hóa Ở Ấn Độ, người ta dùng chữa giang mai và động kinh Nước sắc lá làm toát mồ hôi còn nước sắc rễ và hạt dùng để tẩy giun

trong cơ thể người, chữa bệnh đường tiết niệu và chống mụn nhọt, lở loét [4],

CHƯƠNG 2

PHẦN THỰC NGHIỆM

2.1 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

2.1.1 Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phương pháp xử lý mẫu

Nguyên liệu để nghiên cứu là lá cây Thuốc dầu (Indigofera

zollingeriana Miq,) còn có tên gọi khác theo địa phương là cây chàm lá nhọn,

muỗng lá nhọn, chàm quả trụ được thu hái 2/2010 tại Quảng Ninh

Mẫu cây nghiên cứu hoá thực vật đã được TS Đỗ Hữu Thư (Viện Sinh thái tài nguyên Sinh vật - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam) giám định

tên khoa học là Indigofera zollingeriana Miq họ họ Đậu (Fabaceae)

Ảnh 2.1 Cây Indigofera zollingeriana Miq

Ảnh 2.2 Hoa và quả cây Indigofera zollingeriana Miq

Mẫu cây tươi (9 kg) được diệt men ở nhiệt độ 110 0C 10 phút trong trong tủ sấy, sau đó hong khô ở nơi thoáng mát rồi sấy ở nhiệt độ 50 - 60 0

C tới khi độ ẩm dưới 10% thu được 0,8 kg mẫu khô

2.1.2 Phương pháp ngâm chiết và phân lập các hợp chất từ dịch chiết

Mẫu khô (0,8 kg) đã nghiền nhỏ được ngâm chiết lần lượt với từng loại dung môi có độ phân cực tăng dần: n-Hexan, etylaxetat, metanol trong thiết bị siêu âm, ở nhiệt độ ≤ 50 0C, thời gian ngâm mỗi lần 1 giờ Mẫu nghiên cứu được ngâm với từng loại dung môi trên mỗi loại 5x5lit Gộp mỗi loại dịch chiết (n-hexan, EtOAc và MeOH) riêng biệt và làm khô bằng Na2SO4 khan Sau đó, các dịch chiết trên được lọc qua giấy lọc và loại bỏ dung môi bằng

thiết bị cất quay ở nhiệt ≤ 50 0C dưới áp xuất giảm, thu được thu được 3 cặn tương ứng n –Hexan, etylaxetat và metanol

Để phân lập các chất sạch từ hỗn hợp các chất có trong từng loại dịch

chiết các phương pháp sắc ký (Sắc ký lớp mỏng (SKLM), Sắc ký cột thường

Silica gel Merck 63-200 nm, Sắc ký cột pha đảo (C18) bằng các dung môi và

hệ dung môi thích hợp) đã được sử dụng phối hợp cùng các phương pháp kết tinh phân đoạn và kết tinh lại

Quá trình nghiên cứu sẽ nêu chi tiết ở phần thực nghiệm

2.1.3 Thử hoạt tính sinh học

Thử hoạt tính vi sinh vật kiểm định đối với 2 loại cặn thô thu được ở trên tại Phòng thử hoạt tính sinh học -Viện Hoá học -Viện khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.1.4 Phương pháp khảo sát cấu trúc hoá học các chất

Các chất phân lập được ở dạng tinh khiết là đối tượng để khảo sát các đặc trưng vật lý: màu sắc, mùi, dạng thù hình, Rf, điểm nóng chảy (Mp), đo

độ quang hoạt (αD) v.v Sau đó, tiến hành ghi các phổ tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR), cacbon-13 (13C-NMR), phổ DEPT, phổ HSQC và phổ HMBC với các

kỹ thuật một chiều (1D-NMR) và hai chiều (2D-NMR) tuỳ theo chất cụ thể Các

số liệu thực nghiệm của các chất sạch được dùng xác định cấu trúc hoá học của chúng

2.2.Công cụ, hóa chất và thiết bị nghiên cứu

2.2.1 Dụng cụ, hoá chất

Các dung môi để ngâm chiết mẫu đều dùng loại tinh khiết (pure), khi dùng cho các loại sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng, sắc ký lớp mỏng điều chế sử dụng loại tinh khiết phân tích (pa)

Sắc ký lớp mỏng tự chế với các kích thước khác nhau đã dùng loại

silica gel G60 của hãng Merck tráng trên tấm thuỷ tinh và hoạt hoá ở nhiệt độ

độ dày 0,2 mm (Art 5554)

Các hệ dung môi triển khai SKLM:

STT Hệ dung môi (Tỉ lệ thể tích) Kí hiệu

Các giá trị Rf trong hệ dung môi triển khai biểu thị là Rf A (B, C)x100

Sắc ký cột thường sử dụng silica gel Merck 60, cỡ hạt 70 - 230 mesh (0,040 - 0,063 mm) và 230-400 mesh (0,063 - 0,200 mm)

2.2.2 Thiết bị nghiên cứu

- Nhiệt độ nóng chảy đo trên kính hiển vi Boёtus (Đức) hoặc trên máy Electrothermal IA-9200

- Góc quay cực []D đo trên máy Polartronic-D, chiều dài cuvet = 1cm

- Phổ hồng ngoại ghi trên máy IMPACT - 410 (Viện Hoá học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt nam) dưới dạng viên nén KBr

- Phổ khối lượng ghi trên máy MS-Engine-5989-HP (Viện Hoá học -Khoa học và Công nghệ Việt nam) ion hóa bằng va chạm electron (EI) ở 70eV, sử dụng

cao (FT-ICR-HRMS Varian), hoặc trên máy sắc ký lỏng ghép khối phổ với đầu

dò MSD (LC-MSD-Trap-SL) sử dụng mode ESI và đầu dò DAD

- Phổ 1H và 13C-NMR ghi trên máy Bruker 500MHz AVANCE, nội chuẩn TMS, dung môi CDCl3, CD3OD, DMSO-d6

2.3 Thu nhận các dịch chiết từ cây thuốc dầu

2.3.1 Thu nhận các dịch chiết

Mẫu tươi sau khi diệt men, sấy khô, nghiền nhỏ rồi ngâm, chiết kiệt với n-hexan ở nhiệt độ phòng cho đến khi nhạt màu Phần bã tiếp tục ngâm, chiết lần lượt với etylaxetat và metanol Các dịch chiết n-hexan, etylaxetat, metanol được làm khan bằng Na2SO4 Sau đó, lọc lấy dịch chiết đem cất loại dung môi

ở áp suất giảm ở nhiệt độ ≤ 50 0C thu được các cặn tương ứng Đem cân để

xác định khối lượng các cặn.Việc thu nhận các dịch chiết từ cây Indigofera

zollingeriana Miq xem sơ đồ 2.1

Sơ đồ 2.1: Sơ đồ ngâm chiết mẫu lá cây Indigofera zollingeriana

Các phân đoạn dịch chiết nói trên được làm khan bằng Na2SO4, lọc rồi cất kiệt dung môi dưới áp suất giảm, cặn được sấy khô và cân đến khối lượng

không đổi Như vậy từ cây Indigofera zollingeriana Miq , đã thu được 3 loại

cặn chiết Ký hiệu lần lượt là: InH, InE, InM

Ký hiệu:

InH: Cặn chiết n-Hexan của cây Indigofera zollingeriana Miq

InE: Cặn chiết EtOAc của cây Indigofera zollingeriana Miq

InM: Cặn chiết MeOH của cây Indigofera zollingeriana Miq

Kết quả thu nhận các dịch chiết từ cây thuốc dấu được nêu trong bảng 2.1

Bảng 2.1 : Khối lượng cặn chiết thu được từ cây Indigofera zollingeriana Miq

Mẫu thu vào

tháng

02/2010

Khối lượng mẫu khô (g)

Khối lượng cặn chiết thu được (g)

thử, dung dịch xuất hiện màu xanh trong 1 thời gian là phản ứng dương tính

Lấy 0,01g cặn của các phân đoạn, thêm 10ml mêtanol, đun nóng cho tan

và lọc qua giấy lọc Lấy 2ml nước lọc vào ống nghiệm, thêm một ít bột magiê (Mg) hoặc Zn, sau đó cho vào 5 giọt HCl đậm đặc, đun trong bình cách thuỷ vài phút Dung dịch xuất hiện màu đỏ, hoặc màu hồng là phản ứng dương tính với các flavonoit

2.3.2.4 Phát hiện các cumarin

Dịch để thử định tính được chuẩn bị như mục 2.3.2.1 Lấy vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 2 ml dịch thử cho vào một trong 2 ống đó 0,5 ml dung dịch NaOH 10% Đun cách thuỷ cả hai ống trên đến sôi, để nguội rồi cho thêm 4

ml nước cất vào mỗi ống Nếu chất lỏng ở ống có kiềm trong hơn ở ống không kiềm có thể xem là phản ứng dương tính, nếu đem axit hoá ống có kiềm bằng một vài giọt HCl đậm đặc sẽ làm cho dịch đang trong vẩn đục và màu vàng xuất hiện có thể tạo ra tủa là phản ứng dương tính

Ngoài ra, có thể làm phản ứng điazo hoá với axit sulfanilic trong môi trường axit, nếu cho màu da cam đến cam nhạt, cho kết quả dương tính đối với cumarin

2.3.2.5 Định tính các glucosit tim

Chuẩn bị dịch thử định tính cũng làm như mục 2.3.2.1

+ Phản ứng Legal: cho vào ống nghiệm 0,5ml dịch thử, thêm vào 1 giọt dung dịch natri prussiat 0,5% và 2 giọt NaOH 10% nếu xuất hiện màu đỏ là phản ứng dương tính với vòng butenolit

+ Phản ứng Keller - Kilian: Thuốc thử gồm 2 dung dịch

Dung dịch 1: 100ml axit axetic loãng + 1ml FeCl3 5%

Dung dịch 2: 100ml axit H2SO4 đậm đặc + 1ml FeCl3 5%

Cách tiến hành: Lấy 0,01g cặn các dịch chiết cho vào ống nghiệm thêm vào 1ml dung dịch 1, lắc đều cho tan hết, nghiêng ống nghiệm và cho từ từ 1ml dung dịch 2 theo thành ống nghiệm, quan sát sự xuất hiện của màu đỏ hay nâu đỏ, giữa hai lớp chất lỏng Nếu không xuất hiện màu là phản ứng âm tính với các glucosit tim

2.3.2.6 Định tính các saponin

Chuẩn bị dịch thử như ở mục 2.3.2.1 lấy 2 ống nghiệm mỗi ống cho

2ml dịch thử Ống 1 cho 1 ml HCl loãng, ống 2 cho 1 ml NaOH loãng rồi bịt miệng ống nghiệm, lắc trong vòng 5 phút theo chiều dọc, quan sát sự xuất hiện và mức độ bền vững của bọt Nếu bọt cao quá 3 - 4 cm và bền trên 15 phút là phản ứng dương tính

Kết quả phân tích định tính các nhóm chất trong lá cây Thuốc dầu

(Indigofera zollingeriana) được nêu trong bảng 2.2

Bảng 2.2 : Kết quả định tính các nhóm chất trong cây

STT Nhóm

Cặn tổng

Bao gồm những vi khuẩn và nấm kiểm định gây bệnh ở người:

- Bacillus subtilis: là trực khuẩn gram (+), sinh bào tử, thường

không gây bệnh

- Staphylococcus aureus: cầu khuẩn gram (+), gây mủ các vết

thương, vết bỏng, gây viêm họng, nhiễm trùng có mủ trên da và các cơ quan nội tạng

- Lactobacillus fermentum: vi khuẩn gram (+), là loại vi khuẩn đường

ruột lên men có ích, thường có mặt trong hệ tiêu hoá của người và động vật

- Escherichia coli: vi khuẩn gram (-), gây một số bệnh về đường tiêu

hoá như viêm dạ dày, viêm đại tràng, viêm ruột, viêm lỵ trực khuẩn

- Pseudomonas aeruginosa: vi khuẩn gram (-), trực khuẩn mủ xanh,

gây nhiễm trùng huyết, các nhiễm trùng ở da và niêm mạc, gây viêm đường tiết niệu, viêm màng não, màng trong tim, viêm ruột

- Salmonella enterica: vi khuẩn gram (-), vi khuẩn gây bệnh thương hàn,

nhiễm trùng đường ruột ở người và động vật

- Candida albicans: là nấm men, thường gây bệnh tưa lưỡi ở trẻ em và

các bệnh phụ khoa

2.3.3.2 Môi trường nuôi cấy

MHB (Mueller-Hinton Broth), MHA (Mueller-Hinton Agar); TSB (Tryptic Soy Broth); TSA (Tryptic Soy Agar) cho vi khuẩn; SDB (Sabouraud-2% dextrose broth) và SA (Sabouraud-4% dextrose agar) cho nấm

2.3.3.3 Cách tiến hành

a Pha loãng mẫu thử:

Mẫu ban đầu được pha loãng trong DMSO và nước cất tiệt trùng thành một dãy 05 nồng độ theo yêu cầu và mục đích thử Nồng độ thử cao nhất đối với dịch chiết là 256g/ml và với chất sạch là 128g/ml

b Thử hoạt tính

Lấy 10l dung dịch mẫu thử ở các nồng độ vào đĩa 96 giếng, thêm 200l dung dịch vi khuẩn và nấm có nồng độ 5.105CFU/ml, ủ ở 37o

C/24h

- Giá trị MIC được xác định tại giếng có nồng độ chất thử thấp nhất ức chế

sự phát triển của vi sinh vật

- Giá trị IC50 được tính toán dựa trên số liệu đo độ đục của môi trường

nuôi cấy bằng máy quang phổ TECAN và phần mềm raw data

- Giá trị MBC được xác định bằng số khuẩn lạc trên đĩa thạch

Bảng 2.3: Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định các cặn chiết

của cây Indigofera zollingeriana Miq

Bacillus subtilis

Staphylococcus aureus

Salmonella enterica

Escherichia coli

Pseudomonas aeruginosa

Candida albican

Nhận xét: Các mẫu thử không thể hiện hoạt tính kháng các chủng vi sinh vật

và nấm kiểm định

2.4 Phân lập và tinh chế các chất

2.4.1 Cặn dịch chiết n-hexan (In H)

Lấy 6 g cặn chiết hexan đem tách trên cột silica gel, rửa giải cột bằng hệ dung môi etylaxetat-hexan theo tỷ lệ tăng dần từ 0-100% Dịch rửa giải thoát

ra từ cột đƣợc thu ở những khoảng cách nhỏ (5÷10 ml/ phân đoạn) Kiểm tra cặn thu đƣợc bằng sắc ký lớp mỏng và hiện màu bằng thuốc thử vanilin-

H2SO4 5%, sau đó các phân đoạn giống nhau đƣợc dồn lại rồi đem cất loại dung môi

2.4.1.1 Ancol mạch dài (InH1)

Là chất rắn vô định hình, màu trắng thu đƣợc từ dịch n-hexan, có điểm chảy 83-84 0

C., khối lƣợng 17,4mg

1

H-NMR (500 MHz, CDCl3);  (ppm): 0,88 (3H, t, Me); 1,25-1,36 (60H, broad, 30 nhóm CH2); 1,56 (2H, m, CH2); 3,64 (2H, t, CH2)

13

C-NMR (125 MHz, CDCl3);  (ppm): 63,13 (t, C-1); 32,9 – 22,7 (t, C-2 – C-31 ); 14,1 (q, C-32)

2.4.1.2 Axit béo no (InH2)

Là chất rắn vô định hình, màu trắng thu đƣợc từ dịch n-hexan, có điểm chảy 79-81 0

C Khối lƣợng 14.8mg

1

H-NMR (500 MHz, CDCl3);  (ppm): 0,87 (3H, t, Me); 1,25-1,36 (60H, broad, 30 nhóm CH2); 1,57 (2H, m, CH2); 2,36 (2H, t, CH2)

13

C-NMR (125 MHz, CDCl3);  (ppm): 176,5 (s, C-1); 34,7 – 22,7 (t, C-2 – C-33 ); 14,1 (q, C-34)

2.4.1.3 Este béo mạch dài (InH3)

Là chất rắn vô định hình, màu trắng thu đƣợc từ dịch n-hexan, có điểm chảy 86-87 0

C.khối lƣợng 16,8mg

1

H-NMR (500 MHz, CDCl );  (ppm): 0,88 (6H, t, 2Me); 1,27-1,30

t, CH2); 4,07 (2H, t, CH2)

13

C-NMR (125 MHz, CDCl3);  (ppm): 174,18 (s, C=O); 64,38 (t, CH2O); 34,33 – 22,46 (t, các CH2 ) ; 14,1 (q, 2CH3)

-Thủy phân 35 mg InH3 trong hỗn hợp metanol + HCl 5% 16 giờ trong thiết

bị đun hồi lưu Sau khi phản ứng xảy ra hoàn toàn (kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng SKLM) dịch phản ứng được trung hòa bằng NaHCO3 đến pH=7 Thêm nước và chiết bằng n - hexan 03 x 50 ml, dịch chiết được làm khan bằng Na2SO4 và đuổi hết dung môi Cặn cô khô được ghi phổ GC/MS để nhận dạng cấu trúc

2.4.1.4 -Sitosterol (InH4)

Rửa giải cột bằng hệ dung môi n-hexan - etyl axetat (20:1), thu được khối chất rắn vô định hình, tách lặp lại trên cột silicagel và kết tinh lại trong n-hexan đã thu được những tinh thể hình kim, không màu, có khối lượng 23mg, RfBx100 = 50, nóng chảy ở 138-140C, khối lượng 15,5mg

Phổ 1

H-NMR (500 MHz, CDCl3);  (ppm): 0,68 (3H, s, Me-18); 1,01 (3H, s, 19-Me); 2 cụm doublet  0,81 và 0,88 (23H, d, J 7,7Hz, Me-26 và Me-27); 0,83 (3H, t, 7.32Hz, Me-29); 0,92 (3H, d, J 10 Hz, Me-21); 3,58 (1H,

m, H-3); 5,42 (1H, d, J 5Hz, H-6)

Phổ 13

C-NMR (125 MHz, CDCl3);  (ppm): 140,78 (s, C-5); 121,73 (d, C-6); 71,84 (d, C-3); 56,79 (d, C-14); 56,09 (d, C-17); 50,17 (d, C-9); 45,87 (d, C-24); 42,32 (s, C-13); 42,35 (t, C-4); 39,80 (t, C-12); 37,28 (t, C-1); 36,52 (s, C-10); 36,16 (d, C-20); 31,93 (d, C-8); 31,90 (t, C-7); 31,68 (t, C-2); 29,19 (d, C-25); 28,26 (t, C-16); 26,13 (t, C-23); 24,31 (t, C-15); 21,10 (t, C-11); 19,05 (q, C-26); 19,40 (q, C-19); 19,82 (q, C-27); 18,79 (q, C-21); 11,99 (q, C-29); 11,87 (q, C-18); 23,10 (t, C-28); 42,35 (t, C-4)

2.4.2 Cặn dịch chiết etylaxetat (InE)

Dịch chiết EtOAc được làm khan bằng Na2SO4 Sau đó cất loại dung môi dưới áp suất giảm, thu được 26,8g cặn khô Kiểm tra sắc ký lớp mỏng thấy các chất chủ yếu tập trung ở cặn thô Thực hiện thí nghiệm tương tự như mục 2.4.1 từ 20g cặn thô EtOAc đem tách trên cột silicagel Rửa giải cột bằng

hệ dung môi chloroform-metanol tăng dần theo độ phân cực tăng dần (thành phần MeOH tăng từ: 0-100%), dịch rửa giải được thu ở những thể tích nhỏ (510ml/phân đoạn) Kiểm tra cặn thu được bằng sắc ký lớp mỏng và hiện màu bằng thuốc thử vanilin - H2SO4 5% sau đó các phân đoạn giống nhau được dồn lại rồi đem cất loại dung môi và đem đi tinh chế bằng phương pháp kết tinh lại nhiều lần trong dung môi thích hợp

2.4.2.1 -Sitosterol-glucopyranosit (InE1)

Tiếp tục rửa giải cột bằng dung môi etylaxetat thu được khối chất rắn

vô định hình, RfDx100 = 62, nóng chảy ở 279-280 oC, khối lượng 12.9mg

Phổ 13

C-NMR (125 MHz, DMSO-d6), (ppm) : 140,06 (s, C-5), 121,82 (d, C-6), 100,85 (d, C-1’), 78,86 (d, C-3), 76,19 (d, C-5’), 75,58 (d, C-3’), 73,29 (d, C-2’), 69,61 (d, C-4’), 61,52 (t, C-6’), 56,59 (d, C-14), 55,9 (d, C-17), 49,94 (d, C-9), 47,94 (d, C-24), 42,05 (s, C-13), 40,21 (t, C-12), 39,49 (t, C-4), 38,39 (t, C-1), 36,98 (s, C-10), 36,43 (d, C-20), 35,84 (t, C-22), 33,67 (d, C-8), 31,62 (t, C-7), 29,29 (t, C-16), 28,61 (t, C-25), 28,89 (t, C-2), 27,97 (t, C-23), 24,04 (t, C-15), 23,98 (t, C-28), 20,83 (t, C-11), 19,39 (q, C-19), 18,94 (q, C-21), 20,66 (q, C-26), 18,94 (q, C-27), 11,81 (q, C-29), 11,56 (q, C-18)

2.4.2.2.Tritecpen (Axit3β,23-dihydroxilup-20(29)-en-27,28-dioic-InE2)

Rửa giải cột bằng hệ dung môi etyl axetat-metanol (9:1), thu được một khối chất rắn vô định hình, tách lặp lại trên cột silicagel với hệ dung môi etyl axetat-metnol (9:1), và kết tinh lại trong axeton đã thu được những tinh thể hình kim, màu trắng, có khối lượng 8mg, RfB x100 = 50, nóng chảy ở 313-316 C

Phổ HR-MS : m/z (%) : 485,3267 [M-H2O]+ tương ứng công thức tổng:

C30H45O5

Phổ 1

H-NMR (500 MHz, TMS, CD3OD-CDCl3), (ppm) : 1.69; 0.91 (2H, H1), 1.61 (2H, H2), 3.55(1H, H3), 1.32(2H, H6), 1.4; 2.37(2H, H7), 1,47(1H, H9), 2.05(2H, H11), 1.63(2H, H12), 2.32(1H, H13), 1.35; 2.03(2H, H15), 1.61(2H, H16), 1.61(1H, 18H), 3.09(1H, 19H), 1.40; 1.97(2H, H21), 1.94(2H, H22), 3.3; 3.58(2H, H23), 0.78(3H, H24), 0.89(3H, H25), 1.02(3H, H26), 4.61; 4.74(2H, H29), 1.68( 2H, H30)

Phổ 13

C-NMR (125 MHz, CDCl3-MeOD), (ppm) : 38.3 (t, C-1), 26.2 (t, C-2), 75.0 (d, C-3), 41.6 (s, C-4), 48.38 (d, C-5), 18.1 (t, C-6), 34.1 (t, C-7), 40.2 (s, C-8), 51.0 (d, C-9), 37.1 (s, C-10), 20.5 (t, C-11), 25.97 (t, C-12), 39.5 (d, C-13), 59.4 (s, C-14), 27.6 (t, C-15), 37.0 (t, C-16), 55.9 (s, C-17),