Cỏc chất phõn lập đƣợc ở dạng tinh khiết là đối tƣợng để khảo sỏt cỏc đặc trƣng vật lý: màu sắc, mựi, dạng thự hỡnh, Rf, điểm núng chảy (Mp), đo độ quang hoạt (αD) v.v.. Sau đú, tiến hành ghi cỏc phổ tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ khối lƣợng (MS), phổ cộng hƣởng từ hạt nhõn proton (1H-NMR), cacbon-13 (13C-NMR), phổ DEPT, phổ HSQC và phổ HMBC với cỏc kỹ thuật một chiều (1D-NMR) và hai chiều (2D-NMR) tuỳ theo chất cụ thể. Cỏc số liệu thực nghiệm của cỏc chất sạch đƣợc dựng xỏc định cấu trỳc hoỏ học của chỳng.
2.2.Cụng cụ, húa chất và thiết bị nghiờn cứu
2.2.1. Dụng cụ, hoỏ chất
Cỏc dung mụi để ngõm chiết mẫu đều dựng loại tinh khiết (pure), khi dựng cho cỏc loại sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng, sắc ký lớp mỏng điều chế sử dụng loại tinh khiết phõn tớch (pa).
silica gel G60 của hóng Merck trỏng trờn tấm thuỷ tinh và hoạt hoỏ ở nhiệt độ độ dày 0,2 mm (Art. 5554).
Cỏc hệ dung mụi triển khai SKLM:
STT Hệ dung mụi (Tỉ lệ thể tớch) Kớ hiệu
1 n-Hexan - EtOAc (8 : 1) hệ A 2 n-Hexan - EtOAc (4 : 1) hệ B 3 n-Hexan - EtOAc (2 : 1) hệ C 4 Cloroform - metanol (9 : 1) hệ D 5 Cloroform - metanol (5 : 1) hệ E 6 Cloroform - metanol (3 : 1) hệ F
Cỏc sắc ký lớp mỏng (SKLM) đƣợc soi dƣới đốn tử ngoại ở 254 nm (cho loại kieselgel 60F254), sau đú phun thuốc thử vanilin - H2SO4 5% và sấy ở trờn 100 oC, để phỏt hiện cỏc hợp chất.
Cỏc giỏ trị Rf trong hệ dung mụi triển khai biểu thị là Rf A (B, C)x100. Sắc ký cột thƣờng sử dụng silica gel Merck 60, cỡ hạt 70 - 230 mesh (0,040 - 0,063 mm) và 230-400 mesh (0,063 - 0,200 mm).
2.2.2. Thiết bị nghiờn cứu
- Nhiệt độ núng chảy đo trờn kớnh hiển vi Boёtus (Đức) hoặc trờn mỏy Electrothermal IA-9200.
- Gúc quay cực []D đo trờn mỏy Polartronic-D, chiều dài cuvet = 1cm. - Phổ hồng ngoại ghi trờn mỏy IMPACT - 410 (Viện Hoỏ học - Viện Khoa học và Cụng nghệ Việt nam) dƣới dạng viờn nộn KBr.
- Phổ khối lƣợng ghi trờn mỏy MS-Engine-5989-HP (Viện Hoỏ học -Khoa học và Cụng nghệ Việt nam) ion húa bằng va chạm electron (EI) ở 70eV, sử dụng
cao (FT-ICR-HRMS Varian), hoặc trờn mỏy sắc ký lỏng ghộp khối phổ với đầu dũ MSD (LC-MSD-Trap-SL) sử dụng mode ESI và đầu dũ DAD.
- Phổ 1H và 13C-NMR ghi trờn mỏy Bruker 500MHz AVANCE, nội chuẩn TMS, dung mụi CDCl3, CD3OD, DMSO-d6.
2.3. Thu nhận cỏc dịch chiết từ cõy thuốc dầu 2.3.1. Thu nhận cỏc dịch chiết
Mẫu tƣơi sau khi diệt men, sấy khụ, nghiền nhỏ rồi ngõm, chiết kiệt với n-hexan ở nhiệt độ phũng cho đến khi nhạt màu. Phần bó tiếp tục ngõm, chiết lần lƣợt với etylaxetat và metanol. Cỏc dịch chiết n-hexan, etylaxetat, metanol đƣợc làm khan bằng Na2SO4. Sau đú, lọc lấy dịch chiết đem cất loại dung mụi ở ỏp suất giảm ở nhiệt độ ≤ 50 0C thu đƣợc cỏc cặn tƣơng ứng. Đem cõn để xỏc định khối lƣợng cỏc cặn.Việc thu nhận cỏc dịch chiết từ cõy Indigofera zollingeriana Miq xem sơ đồ 2.1
Cỏc phõn đoạn dịch chiết núi trờn đƣợc làm khan bằng Na2SO4, lọc rồi cất kiệt dung mụi dƣới ỏp suất giảm, cặn đƣợc sấy khụ và cõn đến khối lƣợng khụng đổi. Nhƣ vậy từ cõy Indigofera zollingeriana Miq , đó thu đƣợc 3 loại cặn chiết Ký hiệu lần lƣợt là: InH, InE, InM
Ký hiệu:
InH: Cặn chiết n-Hexan của cõy Indigofera zollingeriana Miq InE: Cặn chiết EtOAc của cõy Indigofera zollingeriana Miq InM: Cặn chiết MeOH của cõy Indigofera zollingeriana Miq
Kết quả thu nhận cỏc dịch chiết từ cõy thuốc dấu đƣợc nờu trong bảng 2.1
Bảng 2.1 : Khối lƣợng cặn chiết thu đƣợc từ cõy Indigofera zollingeriana Miq
Mẫu thu vào thỏng 02/2010
Khối lƣợng mẫu khụ (g)
Khối lƣợng cặn chiết thu đƣợc (g)
n-Hexan EtOAc MeOH
Lỏ, cành 800 6,8 ( InH) 28,6 ( InE) 35,9 (InM) 2.3.2. Khảo sỏt định tớnh cỏc dịch chiết 2.3.2.1. Phỏt hiện cỏc hợp chất sterol
Lấy 0,01g cặn của cỏc phõn đoạn, thờm 2 ml dung dịch NaOH 10% đun cỏch thuỷ đến khụ. Hoà tan cặn trong 3 ml cloroform - lấy dịch cloroform để làm phản ứng định tớnh cỏc sterol và thuốc thử Lieberman - Bourchardt (gồm hỗn hợp 1 ml anhydric axetic + 1 ml cloroform để lạnh ở 00C, sau đú cho thờm 1 giọt H2SO4 đậm đặc). Lấy 1 ml dịch chloroform rồi thờm 1 giọt thuốc
2.3.2.2. Phỏt hiện cỏc ancaloit
Lấy 0.01g cặn cỏc phõn đoạn, thờm 5ml HCl, khuấy đều, lọc qua giấy lọc, lấy vào 3 ống nghiệm, mỗi ống 1ml nƣớc lọc axit.
Ống (1): 1 - 2 giọt dung dịch silicostungtic axit 5%, nếu cú tủa trắng và nhiều là phản ứng dƣơng tớnh.
Ống (2): 1 - 2 giọt thuốc thử Dragendorff, nếu xuất hiện màu da cam là phản ứng dƣơng tớnh.
Ống (3): 3 - 5 giọt thuốc thử Mayer, nếu xuất hiện tủa trắng là phản ứng dƣơng tớnh.
2.3.2.3. Phỏt hiện cỏc flavonoit
Lấy 0,01g cặn của cỏc phõn đoạn, thờm 10ml mờtanol, đun núng cho tan và lọc qua giấy lọc. Lấy 2ml nƣớc lọc vào ống nghiệm, thờm một ớt bột magiờ (Mg) hoặc Zn, sau đú cho vào 5 giọt HCl đậm đặc, đun trong bỡnh cỏch thuỷ vài phỳt. Dung dịch xuất hiện màu đỏ, hoặc màu hồng là phản ứng dƣơng tớnh với cỏc flavonoit.
2.3.2.4. Phỏt hiện cỏc cumarin
Dịch để thử định tớnh đƣợc chuẩn bị nhƣ mục 2.3.2.1. Lấy vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 2 ml dịch thử cho vào một trong 2 ống đú 0,5 ml dung dịch NaOH 10%. Đun cỏch thuỷ cả hai ống trờn đến sụi, để nguội rồi cho thờm 4 ml nƣớc cất vào mỗi ống. Nếu chất lỏng ở ống cú kiềm trong hơn ở ống khụng kiềm cú thể xem là phản ứng dƣơng tớnh, nếu đem axit hoỏ ống cú kiềm bằng một vài giọt HCl đậm đặc sẽ làm cho dịch đang trong vẩn đục và màu vàng xuất hiện cú thể tạo ra tủa là phản ứng dƣơng tớnh.
Ngoài ra, cú thể làm phản ứng điazo hoỏ với axit sulfanilic trong mụi trƣờng axit, nếu cho màu da cam đến cam nhạt, cho kết quả dƣơng tớnh đối với cumarin.
2.3.2.5. Định tớnh cỏc glucosit tim
Chuẩn bị dịch thử định tớnh cũng làm nhƣ mục 2.3.2.1.
+ Phản ứng Legal: cho vào ống nghiệm 0,5ml dịch thử, thờm vào 1 giọt dung dịch natri prussiat 0,5% và 2 giọt NaOH 10% nếu xuất hiện màu đỏ là phản ứng dƣơng tớnh với vũng butenolit.
+ Phản ứng Keller - Kilian: Thuốc thử gồm 2 dung dịch. Dung dịch 1: 100ml axit axetic loóng + 1ml FeCl3 5% Dung dịch 2: 100ml axit H2SO4 đậm đặc + 1ml FeCl3 5%
Cỏch tiến hành: Lấy 0,01g cặn cỏc dịch chiết cho vào ống nghiệm thờm vào 1ml dung dịch 1, lắc đều cho tan hết, nghiờng ống nghiệm và cho từ từ 1ml dung dịch 2 theo thành ống nghiệm, quan sỏt sự xuất hiện của màu đỏ hay nõu đỏ, giữa hai lớp chất lỏng. Nếu khụng xuất hiện màu là phản ứng õm tớnh với cỏc glucosit tim.
2.3.2.6. Định tớnh cỏc saponin
Chuẩn bị dịch thử nhƣ ở mục 2.3.2.1. lấy 2 ống nghiệm mỗi ống cho 2ml dịch thử. Ống 1 cho 1 ml HCl loóng, ống 2 cho 1 ml NaOH loóng rồi bịt miệng ống nghiệm, lắc trong vũng 5 phỳt theo chiều dọc, quan sỏt sự xuất hiện và mức độ bền vững của bọt. Nếu bọt cao quỏ 3 - 4 cm và bền trờn 15 phỳt là phản ứng dƣơng tớnh.
Kết quả phõn tớch định tớnh cỏc nhúm chất trong lỏ cõy Thuốc dầu (Indigofera zollingeriana) đƣợc nờu trong bảng 2.2.
Bảng 2.2 : Kết quả định tớnh cỏc nhúm chất trong cõy STT Nhúm chất Thuốc thử Hiện tƣợng Cặn tổng 1 Sterol Lieberman- Bourchardt Màu xanh Màu vàng +
2 Ancaloit Dragendorff Vàng da cam +
3 Flavonoit Zn(Mg) + HCl Dung dịch nhạt màu dẫn đến màu đỏ nhạt + H2SO4 đặc Hồng nhạt + NaOH đặc Vàng + FeCl3 5% Xanh thẫm +
4 Cumarin Phản ứng tạo kết tủa
bụng Cú kết tủa _
5 Glucosit trợ tim
FeCl3 trong
CH3COOH +H2SO4đ Vàng nõu rừ _ 6 Saponin Phản ứng tạo bọt Bọt bền trong NaOH _ Chỳ giải : + : Phản ứng dƣơng tớnh
─ : Phản ứng õm tớnh
2.3.3. Thử hoạt tớnh khỏng vi sinh vật kiểm định (antimicrobial activity)
2.3.3.1. Cỏc chủng vi sinh vật kiểm định.
Bao gồm những vi khuẩn và nấm kiểm định gõy bệnh ở ngƣời:
- Bacillus subtilis: là trực khuẩn gram (+), sinh bào tử, thƣờng khụng gõy bệnh.
- Staphylococcus aureus: cầu khuẩn gram (+), gõy mủ cỏc vết thƣơng, vết bỏng, gõy viờm họng, nhiễm trựng cú mủ trờn da và cỏc cơ quan nội tạng.
- Lactobacillus fermentum: vi khuẩn gram (+), là loại vi khuẩn đƣờng ruột lờn men cú ớch, thƣờng cú mặt trong hệ tiờu hoỏ của ngƣời và động vật.
- Escherichia coli: vi khuẩn gram (-), gõy một số bệnh về đƣờng tiờu hoỏ nhƣ viờm dạ dày, viờm đại tràng, viờm ruột, viờm lỵ trực khuẩn.
- Pseudomonas aeruginosa: vi khuẩn gram (-), trực khuẩn mủ xanh, gõy nhiễm trựng huyết, cỏc nhiễm trựng ở da và niờm mạc, gõy viờm đƣờng tiết niệu, viờm màng nóo, màng trong tim, viờm ruột.
- Salmonella enterica: vi khuẩn gram (-), vi khuẩn gõy bệnh thƣơng hàn, nhiễm trựng đƣờng ruột ở ngƣời và động vật.
- Candida albicans: là nấm men, thƣờng gõy bệnh tƣa lƣỡi ở trẻ em và cỏc bệnh phụ khoa.
2.3.3.2. Mụi trường nuụi cấy.
MHB (Mueller-Hinton Broth), MHA (Mueller-Hinton Agar); TSB (Tryptic Soy Broth); TSA (Tryptic Soy Agar) cho vi khuẩn; SDB (Sabouraud- 2% dextrose broth) và SA (Sabouraud-4% dextrose agar) cho nấm.
2.3.3.3. Cỏch tiến hành
a. Pha loóng mẫu thử:
Mẫu ban đầu đƣợc pha loóng trong DMSO và nƣớc cất tiệt trựng thành một dóy 05 nồng độ theo yờu cầu và mục đớch thử. Nồng độ thử cao nhất đối với dịch chiết là 256g/ml và với chất sạch là 128g/ml.
b. Thử hoạt tớnh
Lấy 10l dung dịch mẫu thử ở cỏc nồng độ vào đĩa 96 giếng, thờm 200l dung dịch vi khuẩn và nấm cú nồng độ 5.105CFU/ml, ủ ở 37o
- Giỏ trị MIC đƣợc xỏc định tại giếng cú nồng độ chất thử thấp nhất ức chế sự phỏt triển của vi sinh vật.
- Giỏ trị IC50 đƣợc tớnh toỏn dựa trờn số liệu đo độ đục của mụi trƣờng nuụi cấy bằng mỏy quang phổ TECAN và phần mềm raw data.
- Giỏ trị MBC đƣợc xỏc định bằng số khuẩn lạc trờn đĩa thạch.
d. Chất tham khảo
- Khỏng sinh Ampicillin cho cỏc chủng vi khuẩn Gram (+) với cỏc giỏ trị MIC trong khoảng 0.004 – 1.20 g/ml.
- Khỏng sinh Cefotaxim cho cỏc chủng vi khuẩn Gram (-) với giỏ trị MIC trong khoảng 0.07 – 9.6 g/ml.
- Khỏng nấm Nystatin cho chủng nấm với giỏ trị MIC trong khoảng 1.8- 3.0 g/ml.
Bảng 2.3: Kết quả thử hoạt tớnh khỏng vi sinh vật kiểm định cỏc cặn chiết của cõy Indigofera zollingeriana Miq
STT Tờn mẫu
Nồng độ ức chế 50% sự phỏt triển của vi sinh võt và nấm kiểm định - IC50 (g/ml) Gram (+) Gram (-) Nấm Lactobacil lus fermentum Bacillus subtilis Staphylococcus aureus Salmonella enterica Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Candida albican 1 InE >256 >256 >256 >256 >256 >256 >256 2 InM >256 >256 >256 >256 >256 >256 >256
Nhận xột: Cỏc mẫu thử khụng thể hiện hoạt tớnh khỏng cỏc chủng vi sinh vật và nấm kiểm định.
2.4.Phõn lập và tinh chế cỏc chất
2.4.1 Cặn dịch chiết n-hexan (In H)
Lấy 6 g cặn chiết hexan đem tỏch trờn cột silica gel, rửa giải cột bằng hệ dung mụi etylaxetat-hexan theo tỷ lệ tăng dần từ 0-100%. Dịch rửa giải thoỏt ra từ cột đƣợc thu ở những khoảng cỏch nhỏ (5ữ10 ml/ phõn đoạn). Kiểm tra cặn thu đƣợc bằng sắc ký lớp mỏng và hiện màu bằng thuốc thử vanilin- H2SO4 5%, sau đú cỏc phõn đoạn giống nhau đƣợc dồn lại rồi đem cất loại dung mụi.
2.4.1.1. Ancol mạch dài (InH1)
Là chất rắn vụ định hỡnh, màu trắng thu đƣợc từ dịch n-hexan, cú điểm chảy 83-84 0 C., khối lƣợng 17,4mg 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3); (ppm): 0,88 (3H, t, Me); 1,25-1,36 (60H, broad, 30 nhúm CH2); 1,56 (2H, m, CH2); 3,64 (2H, t, CH2). 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3); (ppm): 63,13 (t, C-1); 32,9 – 22,7 (t, C-2 – C-31 ); 14,1 (q, C-32).
2.4.1.2. Axit bộo no (InH2)
Là chất rắn vụ định hỡnh, màu trắng thu đƣợc từ dịch n-hexan, cú điểm chảy 79-81 0 C. Khối lƣợng 14.8mg 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3); (ppm): 0,87 (3H, t, Me); 1,25-1,36 (60H, broad, 30 nhúm CH2); 1,57 (2H, m, CH2); 2,36 (2H, t, CH2). 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3); (ppm): 176,5 (s, C-1); 34,7 – 22,7 (t, C-2 – C-33 ); 14,1 (q, C-34).
2.4.1.3. Este bộo mạch dài (InH3)
Là chất rắn vụ định hỡnh, màu trắng thu đƣợc từ dịch n-hexan, cú điểm chảy 86-87 0
C.khối lƣợng 16,8mg
t, CH2); 4,07 (2H, t, CH2).
13
C-NMR (125 MHz, CDCl3); (ppm): 174,18 (s, C=O); 64,38 (t, CH2- O); 34,33 – 22,46 (t, cỏc CH2 ) ; 14,1 (q, 2CH3).
Thủy phõn 35 mg InH3 trong hỗn hợp metanol + HCl 5% 16 giờ trong thiết bị đun hồi lƣu. Sau khi phản ứng xảy ra hoàn toàn (kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng SKLM) dịch phản ứng đƣợc trung hũa bằng NaHCO3 đến pH=7. Thờm nƣớc và chiết bằng n - hexan 03 x 50 ml, dịch chiết đƣợc làm khan bằng Na2SO4 và đuổi hết dung mụi. Cặn cụ khụ đƣợc ghi phổ GC/MS để nhận dạng cấu trỳc.
2.4.1.4. -Sitosterol (InH4)
Rửa giải cột bằng hệ dung mụi n-hexan - etyl axetat (20:1), thu đƣợc khối chất rắn vụ định hỡnh, tỏch lặp lại trờn cột silicagel và kết tinh lại trong n-hexan đó thu đƣợc những tinh thể hỡnh kim, khụng màu, cú khối lƣợng 23mg, RfBx100 = 50, núng chảy ở 138-140C, khối lƣợng 15,5mg
Phổ 1
H-NMR (500 MHz, CDCl3); (ppm): 0,68 (3H, s, Me-18); 1,01 (3H, s, 19-Me); 2 cụm doublet 0,81 và 0,88 (23H, d, J 7,7Hz, Me-26 và Me-27); 0,83 (3H, t, 7.32Hz, Me-29); 0,92 (3H, d, J 10 Hz, Me-21); 3,58 (1H, m, H-3); 5,42 (1H, d, J 5Hz, H-6).
Phổ 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3); (ppm): 140,78 (s, C-5); 121,73 (d, C-6); 71,84 (d, C-3); 56,79 (d, C-14); 56,09 (d, C-17); 50,17 (d, C-9); 45,87 (d, C-24); 42,32 (s, C-13); 42,35 (t, C-4); 39,80 (t, C-12); 37,28 (t, C- 1); 36,52 (s, C-10); 36,16 (d, C-20); 31,93 (d, C-8); 31,90 (t, C-7); 31,68 (t, C-2); 29,19 (d, C-25); 28,26 (t, C-16); 26,13 (t, C-23); 24,31 (t, C-15); 21,10 (t, C-11); 19,05 (q, C-26); 19,40 (q, C-19); 19,82 (q, C-27); 18,79 (q, C-21); 11,99 (q, C-29); 11,87 (q, C-18); 23,10 (t, C-28); 42,35 (t, C-4).
2.4.2 Cặn dịch chiết etylaxetat (InE)
Dịch chiết EtOAc đƣợc làm khan bằng Na2SO4. Sau đú cất loại dung mụi dƣới ỏp suất giảm, thu đƣợc 26,8g cặn khụ. Kiểm tra sắc ký lớp mỏng thấy cỏc chất chủ yếu tập trung ở cặn thụ. Thực hiện thớ nghiệm tƣơng tự nhƣ mục 2.4.1 từ 20g cặn thụ EtOAc đem tỏch trờn cột silicagel. Rửa giải cột bằng hệ dung mụi chloroform-metanol tăng dần theo độ phõn cực tăng dần (thành phần MeOH tăng từ: 0-100%), dịch rửa giải đƣợc thu ở những thể tớch nhỏ (510ml/phõn đoạn). Kiểm tra cặn thu đƣợc bằng sắc ký lớp mỏng và hiện màu bằng thuốc thử vanilin - H2SO4 5% sau đú cỏc phõn đoạn giống nhau đƣợc dồn lại rồi đem cất loại dung mụi và đem đi tinh chế bằng phƣơng phỏp kết tinh lại nhiều lần trong dung mụi thớch hợp.
2.4.2.1. -Sitosterol-glucopyranosit (InE1)
Tiếp tục rửa giải cột bằng dung mụi etylaxetat thu đƣợc khối chất rắn vụ định hỡnh, RfDx100 = 62, núng chảy ở 279-280 oC, khối lƣợng 12.9mg Phổ FT-IR max (cm-1): 3390 (rộng); 2934, 1644, 1464, 1461, 1373, 1073, 1026. Phổ EI-MS : m/z (%) : 396 [(M-1) C6H12O6]+ . Phổ 1 H-NMR (500 MHz, DMSO-d6), (ppm): 0,70 (3H, s); 0,93 (3H,
Phổ 13 C-NMR (125 MHz, DMSO-d6), (ppm) : 140,06 (s, C-5), 121,82 (d, C-6), 100,85 (d, C-1’), 78,86 (d, C-3), 76,19 (d, C-5’), 75,58 (d, C-3’), 73,29 (d, C-2’), 69,61 (d, C-4’), 61,52 (t, C-6’), 56,59 (d, C-14), 55,9 (d, C- 17), 49,94 (d, C-9), 47,94 (d, C-24), 42,05 (s, C-13), 40,21 (t, C-12), 39,49 (t, C-4), 38,39 (t, C-1), 36,98 (s, C-10), 36,43 (d, C-20), 35,84 (t, C-22), 33,67 (d, C-8), 31,62 (t, C-7), 29,29 (t, C-16), 28,61 (t, C-25), 28,89 (t, C-2), 27,97 (t, C-23), 24,04 (t, C-15), 23,98 (t, C-28), 20,83 (t, C-11), 19,39 (q, C-19), 18,94 (q, C-21), 20,66 (q, C-26), 18,94 (q, C-27), 11,81 (q, C-29), 11,56 (q, C-18). 2.4.2.2.Tritecpen (Axit3β,23-dihydroxilup-20(29)-en-27,28-dioic-InE2)
Rửa giải cột bằng hệ dung mụi etyl axetat-metanol (9:1), thu đƣợc một khối chất rắn vụ định hỡnh, tỏch lặp lại trờn cột silicagel với hệ dung mụi etyl axetat-metnol (9:1), và kết tinh lại trong axeton đó thu đƣợc những tinh thể hỡnh kim, màu trắng, cú khối lƣợng 8mg, RfB x100 = 50, núng chảy ở 313-316 C.
Phổ HR-MS : m/z (%) : 485,3267 [M-H2O]+ tƣơng ứng cụng thức tổng: C30H45O5. Phổ 1 H-NMR (500 MHz, TMS, CD3OD-CDCl3), (ppm) : 1.69; 0.91 (2H, H1), 1.61 (2H, H2), 3.55(1H, H3), 1.32(2H, H6), 1.4; 2.37(2H, H7), 1,47(1H, H9), 2.05(2H, H11), 1.63(2H, H12), 2.32(1H, H13), 1.35; 2.03(2H, H15), 1.61(2H, H16), 1.61(1H, 18H), 3.09(1H, 19H), 1.40; 1.97(2H, H21), 1.94(2H, H22), 3.3; 3.58(2H, H23), 0.78(3H, H24), 0.89(3H, H25), 1.02(3H, H26), 4.61; 4.74(2H, H29), 1.68( 2H, H30). Phổ 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3-MeOD), (ppm) : 38.3 (t, C-1), 26.2 (t, C-2), 75.0 (d, C-3), 41.6 (s, C-4), 48.38 (d, C-5), 18.1 (t, C-6), 34.1 (t, C- 7), 40.2 (s, C-8), 51.0 (d, C-9), 37.1 (s, C-10), 20.5 (t, C-11), 25.97 (t, C-12), 39.5 (d, C-13), 59.4 (s, C-14), 27.6 (t, C-15), 37.0 (t, C-16), 55.9 (s, C-17),
51.6 (d, C-18), 46.8 (d, C-19), 150.1 (s, C-20), 30.3 (t, C-21), 36.9 (t, C-22), 69.7 (t, C-23), 11.3 (q, C-24), 16.79 (q, C-25), 16.82 (q, C-26), 178.1 (s, C- 27), 179.0 (s, C-28), 109.7 (t, C-29), 18.7 (q, C-30).
CHƢƠNG 3.
THẢO LUẬN KẾT QUẢ NGHIấN CỨU
3.1. Nguyờn tắc chung.
Để phõn lập đƣợc cỏc hợp chất trong bất kỳ một thực vật nào mà khụng làm ảnh hƣởng tới thành phần hoỏ học cú trong nú thỡ trƣớc khi ngõm chiết bằng dung mụi hữu cơ, mẫu thực vật phải đƣợc đƣa đi khử men ngay sau khi thu mẫu và sấy khụ ở điều kiện thớch hợp.
Về nguyờn tắc việc ngõm chiết mẫu thực vật cú thể tiến hành theo 2 cỏch phổ biến sau.
1. Chiết và phõn lập cỏc hợp chất từ mẫu thực vật bằng cỏc loại dung mụi cú độ phõn cực tăng dần: ete dầu hoả hoặc n-hexan, cloroform, etylaxetat, metanol hoặc etanol v.v....
2. Chiết tổng bằng cỏc ancol (metanol, etanol) hay hệ dung mụi