Tiếp tục rửa giải cột bằng dung mụi etylaxetat thu đƣợc khối chất rắn vụ định hỡnh, RfDx100 = 62, núng chảy ở 279-280 oC. Cỏc số liệu phổ của InE1 (xem mục 2.4.2.1) so sỏnh với dữ liệu phổ của chất β-Sitosterol – glucopyranosit chuẩn và điểm chảy của hỗn hợp InE1 với β-sitosterol –
glucopyranosit chuẩn khụng đổi, cho phộp khẳng định InE1 là một
phytoglucopyranosit với tờn β-Sitosterol– glucopyranosit và cụng thức cấu tạo nhƣ sau : ( xem phổ phần phụ lục)
3.2.6.Triterpen – (Axit 3β,23-dihydroxylup-20(29)-en-27,28-dioic/ InE2)
InE2 cũng thu đƣợc từ dịch etylaxetat của Cõy thuốc dầu, nú là những tinh thể hỡnh kim, màu trắng, cú khối lƣợng 8mg, RfB x100 = 50, núng chảy ở 313-316 C.
Phổ khối phõn giải cao HR/ESI/HRMS cho pic phõn tử mất nƣớc m/z 485.3267 [M-H2O]+, ứng với cụng thức phõn tử C30H45O5. Do vậy, cú thể thấy InE2 cú cụng thức phõn tử là: C30H46O6. Kết luận ban đầu cú thể khẳng định InE2 là một triterpen.
Cỏc phổ 13
C-NMR và DEPT cho biết trong InE2 cũng cú 30 nguyờn tử C phự hợp với cụng thức tổng thu đƣợc từ phổ MS phõn giải cao của nú . Trong đú cú 8 C bậc 4 ở cỏc độ dịch chuyển húa học 41.6 (C-4), 40.2 (C-8), 37.1 (C-10), 59.4 (C-14), 55.9 (C-17), 150.1 (C-20), 178.1 (C-27) và 179.0 (C-28) ; cú 6 cỏc bon bậc 3 (6 nhúm metin CH) là : 75.0 (C-3), 48.38 (C-5), 51.0 (C-9), 39.5 (C-13), 51.6 (C-18) và 46.8 (C-19) ; cú 12 C bậc 2 (12 nhúm metylen CH2) với cỏc độ dịch chuyển húa học: 38.3 (C-1), 26.2 (C-2), 18.1 (C-6), 34.1 (C-7), 20.5 (C-11), 25.97 (C-12), 27.6 (C-15), 37.0 (C-16), 30.3 (C-21), 36.9 (C-22), 69.7 (C-23) và 109.7 (t, C-29); cũn lại 4 nhúm metyl (CH3) ở cỏc độ dịch chuyển húa học 11.3 (C-24), 16.79 (C-25), 16.82 (C-26) và 18.7 (C-30). Từ cỏc phổ 1H-NMR, DEPT và phổ 2 chiều HSQC của InE2
Bảng 3.1 : Cỏc số liệu phổ 1 H, 13C-NMR và của InE2 TT C/H δC ppm δH ppm Cn TT C/H δC ppm δH ppm Cn 1 38.3 1.69; 0.91 CH2 16 37.0 1.61 CH2 2 26.2 1.61 CH2 17 55.9 - C 3 75.0 3.55 CH 18 51.6 1.61 CH 4 41.6 - C 19 46.8 3.09 CH 5 48.38 - CH 20 150.1 - C 6 18.1 1.32 CH2 21 30.3 1.40; 1.97 CH2 7 34.1 1.4; 2.37 CH2 22 36.9 1.94 CH2 8 40.2 - C 23 69.7 3.3; 3.58 CH2 9 51.0 1.47 CH 24 11.3 0.78 CH3 10 37.1 - C 25 16.79 0.89 CH3 11 20.5 2.05 CH2 26 16.82 1.02 CH3 12 25.97 1.63 CH2 27 178.1 - CO 13 39.5 2.32 CH 28 179.0 - CO 14 59.4 - C 29 109.7 4.61; 4.74 CH2 15 27.6 1.35; 2.03 CH2 30 18.7 1.68 CH3 Tổng số 4CH3 12CH2 6 CH 8C Phổ 1
H-NMR cũn cho cỏc tớn hiệu đặc trƣng của cỏc nhúm metyl (CH3) với tớn hiệu singlet trong InE2 ở cỏc δHMe 0.78; 0.89; 1.02; 1.68 ppm; 2 tớn hiệu H của cỏc nhúm carbinol bậc 3 ở δH = 3.55 và bậc 2 ở δH = 3.30 và 3.58 ppm và cỏc tớn hiệu proton của nhúm metylen olefin doublet-doublet ở δH = 4.61 và 4.74 ppm. Phõn tớch cỏc dữ liệu phổ HMBC của InE2 cho thấy một số tƣơng tỏc xa dị hạt nhõn trong nú đƣợc tổng kết trong bảng 3.2
Bảng 3.2 : Cỏc dữ liệu phổ NMR và cỏc tƣơng tỏc xa (HMBC) của InE2 TT C/H δC ppm δH ppm Cn Tƣơng tỏc xa H→C 1 38.3 1.69; 0.91 CH2 2; 10 2 26.2 1.61 CH2 1;3 3 75.0 3.55 CH 4;5;23;24 4 41.6 - C - 5 48.38 0.90 CH 6;7;10 6 18.1 1.32 CH2 5;7 7 34.1 1.4; 2.37 CH2 6; 9 8 40.2 - C - 9 51.0 1.47 CH 5;10;26 10 37.1 - C - 11 20.5 1.25;1.55 CH2 12;13 12 25.97 1.63 CH2 9;11; 13 13 39.5 2.32 CH 14;17; 27 14 59.4 - C - 15 27.6 1.35; 2.03 CH2 14;16;17; 27 16 37.0 1.61 CH2 13;14;17;28 17 55.9 - C - 18 51.6 1.61 CH 17;19;20;28 19 46.8 3.09 CH - 20 150.1 - C - 21 30.3 1.40; 1.97 CH2 19;22 22 36.9 1.40; 1.65;1.94 CH2 19; 17;21;28 23 69.7 3.3; 3.58 CH2 3;4;5;24 24 11.3 0.78 CH3 4;5 25 16.79 0.89 CH3 1;5;9;10 26 16.82 1.02 CH3 8;9;14 27 178.1 - CO - 28 179.0 - CO - 29 109.7 4.61; 4.74 CH2 19;(20);30 30 18.7 1.68 CH3 29;20
Dựa vào cỏc phõn tớch số liệu phổ MS phõn giải cao, phổ NMR 1 và 2D của InE2 nhƣ trờn và kết hợp với cỏc tài liệu tham khảo [7], [27], [44],
[45], [50], [53], [54], [57], [58] chỳng tụi xỏc định InE2 là một triterpen
thuộc khung lupan với tờn gọi axit 3β,23-dihydroxylup-20(29)-en-27,28-dioic và cụng thức cấu tạo nhƣ sau :
HO OH OH O O OH 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Axit 3β,23-dihydroxylup-20(29)-en-27,28-dioic
Hợp chất axit 3β,23-dihydroxylup-20(29)-en-27,28-dioic lần đầu tiờn phõn lập đƣợc từ thực vật Indigofera Zolingeriana Miq..
KẾT LUẬN
1. Lần đầu tiờn cõy Thuốc dầu (Indigofera Zolingeriana Miq.) mọc hoang dó tại Quảng Ninh đƣợc thu hỏi, xỏc định tờn khoa học và tiến hành nghiờn cứu húa thực vật đó thu đƣợc 06 chất sạch bao gồm 03 hợp chất bộo, 2 hợp chất phytosterol và 1 hợp chất triterpen.
2. Khảo sỏt định tớnh cỏc lớp chất trong cõy Indigofera Zolingeriana Miq. cho thấy cú : phytosterol, flavonoit,ankaloit, và 06 hợp chất sạch phõn lập từ Indigofera Zolingeriana Miq. đó đƣợc xỏc định một số tớnh chất vật lý và ghi cỏc loại phổ cần thiết (IR, MS và 1D, 2D-NMR) cho việc xỏc định cấu trỳc húa học của chỳng.
3. Trờn cơ sở cỏc dữ liệu phổ của 06 chất, đó xỏc định đƣợc cấu trỳc húa học của 5 chất đú là: Dotriacontan-1-ol (InH1); Axit tetratriacontanoic (InH2); β-Sitosterol (InH4); β-Sitosterol– glucopyranosit (InE1); Axit 3β,23-dihydroxilup-20(29)-en-27,28-dioic (InE2).
4. Lần đầu tiờn phõn lập đƣợc 1 hợp chất triterpen axit 3β,23- dihydroxilup-20(29)-en-27,28-dioic từ cõy Indigofera Zolingeriana và cũng là chất lần đầu tiờn phõn lập đƣợc từ họ Indigofera.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
A. Tiếng Việt
1 Danh lục cỏc loài thực vật tập 2. NXB Nụng nghiệp, 2003, tr.810-815
2 Nguyễn Văn Quang và cỏc cộng sự; Nghiờn cứu chiết xuất cỏc hoạt chất sinh học từ Cõy thuốc dầu chữa chấn thƣơng cho Vận động viờn, Bỏo cỏo tiến độ nghiờn cứu khoa học (2009-2010)
3 Vừ Văn Chi, Dƣơng Đức Tiến, Phõn loại học thực vật, thực vật bậc cao; NXB Đại học và Trung học Hà Nội, 1978
4 Vừ Văn Chi, Từ điển cõy thuốc Việt Nam, 1999, tr. 207-211.
B. Tiếng nƣớc ngoài
5 Ahmad, V.U. et al., 5- Hydroxy-3,6,7,2′,5′-pentamethoxyflavone from Inula grantioides, Phytochemistry, 30, 1991, p.1040-1041.
6 Aziz-ur-rehman, Abdul Malik, Naheed Riaz, Habib Ahmad, Sarfraz Ahmad Nawaz and Muhammad Iqbal Choudhary, Lipoxygenase Inhibiting
Constituents from Indigofera hetrantha, Chem. Pharm. Bull., 53, 2005, p.263-266.
7 Akira Ikuta, Hideji Itokawa, Triterpenoids of Paeonia japonica callus tissue,
Phytochemistry, 27(9), 1988, p.2813-2815.
8 Bacon, J.D. et al., Flavonol glycosides of Nerisyrenia cruciferae. Phytochemistry, 15, 1976, p.1087-1088.
9 Burger, A.P.N. et al., O-(Dihydrobenzofuranyl)-dibenzo-α-pyrones from
Umtiza listerana, Phytochemistry, 22, 1983, p.2813.
10 Chapman & Hall/CRC, DNP on CD – ROM, 2006, Version 15:1. 11 Carter, C.L. et al., Nature (London), 164, 1949, p.575 (isol)
12 Calanasan, C.A. et al., A diterpenoid sulphate and flavonoids from Wedelia asperrima, Phytochemistry, 47, 1998, p.1093-1099.
13 Philip E. Pfeffer, Kathleen M. Valentine, Barton G. Moyer, David L. Gustine, Assessment of 13c-shift parameters in di- and tri-O-(3- nitropropanoyl)-d-Glucopyranoses, Carbohydrate Research, 73(1), 1979,
14 Christine A. Williams, J. B. Harborne, H. T. Clifford, Flavonoid patterns in the monocotyledons. Flavonols and flavones in some families associated with the Poaceae, Phytochemistry, 10(5), 1971, p.1059-1063.
15 Dvid A. Young, Robert W. Sterner, Acylated kaempferol glycosides from
Aconitum (ranunculaceae), Phytochemistry, 20(8), 1981, p.2055-2056. 16 De Moraes E Souza, M.A. et al., Arylbenzofurans from Indigofera
microcarpa, Phytochemistry, 27, 1988, p.1817.
17 Dominguez, X.A. et al., Flavonoids from Dalea scandens var. Paucifolia and Dalea thyrsiflora, Phytochemistry, 19, 1980, p.1262-1263.
18 Finnegan, R.A. et al., J. Pharm. Sci., 54, 1965, p.1136. (isol, ester) 19 Freudenberg, K. et al., Tet. Lett., 17, 1959, p.19 (isol)
20 Garcez, W.S. et al., A nitropropanoyl-glucopyranoside from Indigofera suffruticosa, Phytochemistry, 28, 1989, p.1251-1252.
21 Gnanasunderam, C. et al., Hiptagin and other aliphatic nitro esters in Lotus pedunculatus, Phytochemistry, 25, 1986, p.409
22 Gupta, S.R. et al., The glucosides of Butea monosperma, Phytochemistry, 9, p.1970, 2231.
23 Harlow, M.C. et al., Isolation of nitro compounds from Astragalus species, Phytochemistry, 14, 1975, p.1421.
24 Hayashi, T. et al., Isoflavones from Dipteryx odorata. Phytochemistry, 13, 1974, p.1943.
25 Hegarty, M.P. et al., Aust. J. Chem., 24, 1971, p.371; 45, 1992, p.1021 (isol, cryst struct)
26 Isao Kubo, Yoshihiro Yokokawa, (+)-Afzelechin 3-rhamnoside from
Cassipourea gerrardii, Phytochemistry, 31(3), 1992, p.1075-1077.
27 J. Anaya, MC. Caballero, M. Grande, J.J. Navarro, I. Tapia, J.F. Almeida .
A lupeol derivative from Salvia pratensis, Phytochemistry, 28(8), 1989,
p.2206-2208
28 Gao, S. et al., Chin. Chem. Lett., 15, 2004, p.313-315 (Lysidicisides) 29 Kostanecki, S. et al., Ber., (footnote), 34, 1901, p.3723 (isol)
30 Kulkarni, M.M. et al., Four 6-hydroxyflavonols from Blumea malcomii Phytochemistry, 26, 1987, p.2079-2083.
31 Khun, D.A. et al., Arch. Mikrobiol., 36, 1960, p.175; 51, 1965, p.71 (isol) 32 Kubo, I. et al., Two tyrosinase inhibiting flavonol glycosides from Buddleia
coriacea. Phytochemistry, 31, 1992, p.1075-1077.
34 Maugard, T. et al., Identification of an indigo precursor from leaves of Isatis tinctoria (Woad), Phytochemistry, 58, 2001, p.897-904.
35 Miyamura, M. et al., Seven aromatic compounds from bark of Cinnamomum cassia, Phytochemistry, 22, 1983, p.215.
36 Oesch, J. et al., J.C.S., 105, 1914, p.2350-2357 (isol) 37 Perkin, A.G. et al., J.C.S., 91, 1907, p.279-288 (isol)
38 Philip E. Pfeffer, Kathleen M. Valentine, Barton G. Moyer, David L. Gustine, Assessment of 13C-shift parameters in di- and tri-O-(3- nitropropanoyl)-d-Glucopyranoses, Carbohydr. Res. 73, 1979, p.1-8. 39 C.W. Ford, Flavonoids from Phaseolus atropurpureus, Phytochemistry,
10(11), 1971, p.2807-2810.
40 Hans Geiger, Ulrich Lang, Edith Britsch, Tom J. Mabry, Ursula Suhr- Schỹcker, George Vander Velde, Hugh Waldrum, Die flavonolglykoside von Equisetum telmateja, Phytochemistry, 17(2), 1978, p.336-337.
41 Seckin ệzden, Nedime Dỹrỹst, Kenjiro Toki, Norio Saito, Toshio Honda, Acylated kaempferol glycosides from the flowers of Delphinium formosum,
Phytochemistry, 49(1), 1998, p.241-245.
42 Heba H. Barakat, Ahmed M. Souleman, Sahar A. m. Hussein, Ola A. Ibrahiem, Mahmoud A. m. Nawwar, Flavonoid galloyl glucosides from the pods of Acaciafarnesiana, Phytochemistry, 51(1), 1999, p.139-142.
43 Karin W. M. Zuurbier, Suen-Ying Fung, Johannes J. C. Scheffer, Robert Verpoorte, Formation of aromatic intermediates in the biosynthesis of bitter acids in Humulus lupulus, Phytochemistry, 38(1), 1995, p.77-82.
44 Reiko Tanaka, Kimiyo Masuda, Shunyo Matsunaga, Lup-20(29)-en-3β,15α- diol and ocotillol-II from the stem bark of Phyllanthus flexuosus,
Phytochemistry, 32(2), 1993, p.472-474.
45 Reynolds, W.F.,McLean, S., Poplawski, J., Enriquez, R. G., Escobar, L. L., Total assignment of 13C and 1H spectra of three isomeric triterpenol
derivatives by 2D NMR: an investigation of the potential utility of 1H chemical shifts in structural investigations of complex natural products,
Tetrahedron, 42, 1986, p.3419.
46 Robertson, A. et al., J.C.S., 30, 1933. (Indican)
47 Rolf D. Schmid, Jeffrey B. Harborne, Mass spectrometric identification of a kaempferol tetraglycoside from Solanum seed, Phytochemistry, 12(9), 1973, p. 2269-2273
48 Tinto, W. F., Blair, L. C., Ali, A., Reynolds, W. F.and McLean, S., Lupane Triterpenoids of Salacia cordata , J. Nat. Prod. 55(3), 1992, p.395.
50 Salimuzzaman Siddiqui, Farrukh Hafeez, Sabira Begum, Bina S. Siddiqui, Oleanderol, a New Pentacyclic Triterpene from the leaves of Nerium oleander,J. Nat. Prod., 51(2), 1988, p.229–233.
51 Sen, A.K. et al., Couroupitine a, a new alkaloid from Couroupita guianensis
Tet. Lett., 15(7), 1974, p.609-610.
52 Selvam, C. et al., A new cyclooxygenase (COX) inhibitory pterocarpan from Indigofera aspalathoides: structure elucidation and determination of binding orientations in the active sites of the enzyme by molecular docking,
Tet. Lett., 45(22), 2004, p.4311-4314.
53 Siddiqui, S., Hafeez, F., Begum, S. and Siddiqui, B. S., Oleanderol, a New Pentacyclic Triterpene from the Leaves of Nerium oleander, J. Nat. Prod.,
51(2), 1988, p.229-233.
54 Valdir A. Facundo, Carlos Humberto S. Andrade, Edilberto R. Silveira, Raimundo Braz-Filho, Charles D. Hufford, Triterpenes and flavonoids from
Combretum leprosum, Phytochemistry, 32(2), 1993, p.411-415.
55 Vecchietti, V. et al., Alkaloid and lignan constituents of Cinnamosma madagascariensis. Phytochemistry, 18, 1979, p.1847.
56 Walmir S. Garcez, Fernanda R. Garcez, Neli K. Honda, Antonio J.R. da Silva, Majak, W. et al., Phytochemistry, 35, 1994, p.901-903 (isol)
57 Wenkert, E., Baddely, G. V., Burfit,I. R. and Moreno, L.N., Org.Magn. Reson. 11, 1978, p.337.
58 Winston F. Tinto, Lynn C. Blair, Azzam Alli, William F. Reynolds, Stewart McLean, Lupane Triterpenoids of Salacia cordata, J. Nat. Prod., 55(3),
1992, p.395–398. C. Trang Web 59 http://www.discoverlife.org/mp/20q?go=http://plants.usda.gov/java/Classifi cationServlet%3Fsource%3Dprofile%26symbol%3DFabaceae%26display% 3D31 60 http://vi.wikipedia.org/wiki/Chi_Ch%C3%A0m 61 http://vi.wikipedia.org/wiki/Indigofera_tinctoria 62 http://www.vietlyso.com/forums/showthread.php?t=12372 63 http://www.lrchueuni.edu.vn/dongy/show_target.plx?url=/thuocdongy/C/Ch amMeo.htm&key=&char=C
65 http://www.lrchueuni.edu.vn/dongy/show_target.plx?url=/thuocdongy/C/Ch amDai.htm&key=&char=C
66 http://agriviet.com/file/1-Danh-muc-thuc-vat-viet-nam/
PHỤ LỤC
2. Phổ của cỏc chất
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ...1
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN CÁC THỰC VẬT CHI INDIGOFERA VÀ THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CỦA CHÚNG ...3
1.1. Khỏi quỏt về thực vật chi Indigofera và cõy thuốc dầu (Indigofera zollingeriana Miq) ...3
1.2. Thành phần húa học chi Indigofera...6
1.2.1. Cỏc nghiờn cứu húa thực vật loài Indigofera zollingeriana Miq. ...6
1.2.2. Thành phần húa học của chi Indigofera ...7
1.2.2.1. Nhúm chất ancaloit. ...7
1.2.2.2. Nhúm chất flavonoit. [10] ... 11
1.2.2.3. Cỏc hợp chất terpenoit. [10] ... 15
1.2.2.4. Cỏc hợp chất glycosit khỏc. [10] ... 16
1.3. Ứng dụng của thực vật chi Chàm trong thực tế. ... 17
CHƢƠNG 2. PHẦN THỰC NGHIỆM ... 21
2.1. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIấN CỨU ... 21
2.1.1. Thu mẫu cõy, xỏc định tờn khoa học và phƣơng phỏp xử lý mẫu. ... 21
2.1.2. Phƣơng phỏp ngõm chiết và phõn lập cỏc hợp chất từ dịch chiết ... 23
2.1.3. Thử hoạt tớnh sinh học ... 23
2.1.4. Phƣơng phỏp khảo sỏt cấu trỳc hoỏ học cỏc chất ... 23
2.2. DỤNG CỤ, HOÁ CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIấN CỨU ... 23
2.2.1. Dụng cụ, hoỏ chất ... 23
2.2.2. Thiết bị nghiờn cứu ... 24
2.3. THU NHẬN CÁC DỊCH CHIẾT TỪ CÂY THUỐC DẤU ... 25
2.3.1. Thu nhận cỏc dịch chiết ... 25 2.3.2. Khảo sỏt định tớnh cỏc dịch chiết ... 26 2.3.2.1. Phỏt hiện cỏc hợp chất sterol ... 26 2.3.2.2. Phỏt hiện cỏc ancaloit... 27 2.3.2.3. Phỏt hiện cỏc flavonoit ... 27 2.3.2.4. Phỏt hiện cỏc cumarin ... 27 2.3.2.5. Định tớnh cỏc glucosit tim ... 28
2.4. PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ CÁC CHẤT ... 31
2.4.1 Cặn dịch chiết n-hexan (In H) ... 32
2.4.1.1. Ancol mạch dài (InH1) ... 32
2.4.1.2. Axit bộo no (InH2) ... 32
2.4.1.3. Este bộo mạch dài (InH3) ... 32
2.4.1.4. -Sitosterol (InH4) ... 33
2.4.2 Cặn dịch chiết etylaxetat (InE) ... 33
2.4.2.1. -Sitosterol-glucopyranosit (InE1) ... 34
2.4.2.2. Tritecpen (Axit 3β,23-dihydroxilup-20(29)-en-27,28-dioic)- (InE2) ... 34
CHƢƠNG 3.37THẢO LUẬN KẾT QUẢ NGHIấN CỨU ... 37
3.1. Nguyờn tắc chung. ... 37
3.2. Phõn lập và nhận dạng cỏc hợp chất cú trong cỏc dịch chiết khỏc nhau của cõy Indigofera Zolingeriana Miq. ... 37
3.2.1. Ancol mạch dài - (Dotriacontan-1-ol, InH1)... 38
3.2.2. Axit bộo no (Axit tetratriacontanoic - InH2) ... 38
3.2.3. Este bộo no (InH3) ... 39
3.2.4. β-Sitosterol (InH4) ... 39
3.2.5. β-Sitosterol – glucopyranosit (InE1) ... 40
3.2.6. Triterpen (Axit 3β,23-dihydroxilup-20(29)-en-27,28-dioic/ InE2) ... 41
KẾT LUẬN ... 52
TÀI LIỆU THAM KHẢO ... 53
PHỤ LỤC ... 58
1. Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định. ... 58
2. Phổ của các chất. ... 59
2.1. Phổ Dotriacontan-1-ol (InH1) ... 59
2.2. Phổ Axit tetratriacontanoic (InH2) ... 65
2.3. Phổ Este axit bộo no (InH3) ... 70
2.4. Phổ β-Sitosterol (InH4) ... 76