khảo sát thành phần hóa học và thử hoạt tính kháng khuẩn, chống oxy hoá và kháng viêm của cây tứ bạch long

SỐ TÊN BẢNG SỐ LIỆU TRANG 3.1 Tóm tắt phản ứng định tính hóa học cao phân đoạn 29 3.5 Kết quả phân tích sơ bộ hóa thực vật trên nguyên liệu của cây Tứ Bạch Long 33 3.6 Hiệu suất chiết ca

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THÀNH ĐOÀN TP HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO NGHIỆM THU

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC

VÀ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN, CHỐNG OXY HÓA VÀ

KHÁNG VIÊM CỦA CÂY TỨ BẠCH LONG

(BLEPHARIS MADERASPATENSIS (L.) ROTH)

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

THÁNG 6/2014

VIẾT TẮT THUẬT NGỮ TIẾNG VIẾT

AREC Ampicillin- resistant Escherichia coli

MRSA Methicillin- resistant Staphylococcus aureus

MSSA Methicillin- sensitive Staphylococcus aureus

NSAIDs Non-steroidal anti-inflammatorial drugs

SỐ TÊN BẢNG SỐ LIỆU TRANG

3.1 Tóm tắt phản ứng định tính hóa học cao phân đoạn 29

3.5 Kết quả phân tích sơ bộ hóa thực vật trên nguyên liệu của

cây Tứ Bạch Long

33

3.6 Hiệu suất chiết cao tổng nước bằng phương pháp siêu âm 35 3.7 Hiệu suất chiết cao tổng cồn bằng phương pháp ngấm kiệt 36

3.9 Kết quả định tính bằng phản ứng hóa học trên các phân

đoạn cao

38

3.10 Các nhóm chất hiện diện trong các phân đoạn dịch chiết 39 4.1 Kết quả đường kính kháng khuẩn (mm) trên 2 cao tổng 51 4.2 Kết quả đường kính kháng khuẩn (mm) trên 5 phân đoạn 52 4.3 Kết quả khảo sát MIC của cao chloroform 53 4.4 Kết quả khảo sát MIC của cao ethyl acetat 54 4.5 Kết quả khảo sát MIC của tetracyclin trên các chủng vi

khuẩn

54

4.6 Kết quả khảo sát MIC của clotrimazol trên C albicans 54

5.2 Quy trình khảo sát hoạt tính quét gốc tự do DPPH 59 5.3 Quy trình khảo sát khả năng quét gốc hydroxyl tự do 61 5.4 Năng lực khử của cao tổng và cao chiết Tứ Bạch Long 62 5.5 Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của cao cồn tổng 65 5.6 Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của cao nước tổng 66 5.7 Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của cao phân đoạn ether 67

5.12 Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của vitamin C tinh khiết 72

5.14 Khả năng kháng gốc hydroxyl tự do của Tứ Bạch Long 76 6.1 Quy trình khảo sát khả năng ức chế biến tính albumin 80 6.2 Khả năng ức chế biến tính albumin của các dạng cao chiết

SỐ TÊN ĐỒ THỊ TRANG

5.1 Năng lực khử cao tổng và cao chiết Tứ Bạch Long 62 5.2 Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của cao cồn tổng 65 5.3 Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của cao nước tổng 66 5.4 Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của cao phân đoạn

6.1 Khả năng ức chế biến tính albumin của các dạng cao

chiết từ cây Tứ Bạch Long

2.5 Kết quả soi bột dược liệu Tứ Bạch Long 20 3.1 Chiết xuất cao tổng cồn và các cao phân đoạn từ bột

cây Tứ Bạch Long

28

3.2 Sắc đồ hệ chloroform – ethyl acetat (7:3) 41 3.3 Sắc đồ hệ n-Buthanol - a acetic - nước (7:1:2) 42 3.4 Sắc đồ hệ n-Buthanol – a acetic – nước (4:1:5) 43 3.5 Sắc đồ hệ ethyl acetat – methanol – nước (100:17:13) 44 3.6 Sắc đồ hệ ethyl acetat – a acetic – a formic – nước

7.2 Hình SKLM các phân đoạn thu được từ sắc ký nhanh

– cột khô chạy hệ ethyl acetat – methanol – nước

(100:17:13)

94

7.3 Hình SKLM của các phân đoạn thu được từ sắc ký

nhanh – cột khô với dung môi methanol chạy hệ ethyl

acetat – methanol – nước (100:17:13)

7.6 Các bước phân lập chất 1 và chất 2 100 7.7 SKLM chất 1 hệ ethyl acetat – methanol – nước

(100:17:13)

100

MỤC LỤC

TÓM TẮT / ABSTRACT

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH ẢNH

DANH MỤC ĐỒ THỊ

PHẦN MỞ ĐẦU 1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu chung về Tứ Bạch Long 3

1.1.1 Danh pháp và phân loại 3

1.1.2 Hình thái học 3

1.1.3 Sinh thái học và phân bố 4

1.1.4 Thành phần hóa học 4

1.1.5 Công dụng 5

1.2 Tình hình nghiên cứu và sử dụng cây Tứ Bạch Long 5

1.2.1 Thế giới 5

1.2.2 Trong nước 8

Chương 2: KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC CỦA TBL 9

2.1 Phương pháp nghiên cứu thực vật học 9

2.1.1 Khảo sát đặc điểm hình thái 9

2.1.2 Khảo sát đặc điểm vi học 9

2.1.2.1 Vi phẫu 9

2.1.2.2 Bột dược liệu 9

2.2 Kết quả nghiên cứu thực vật học 10

2.2.1 Khảo sát về đặc điểm hình thái 10

2.2.2 Khảo sát đặc điểm vi học 11

2.2.2.1 Vi phẫu 11

2.2.2.2 Bột dược liệu 18

Chương 3: KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA TBL 21

3.1 Phương pháp nghiên cứu hóa học 21

3.1.1 Tiêu chuẩn hóa nguyên liệu 21

3.1.1.1 Xác định độ ẩm: 21

3.1.1.2 Xác định độ tro trong dược liệu 21

3.1.2 Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật 23

3.1.2.1 Chuẩn bị dịch chiết 23

3.1.2.2 Các phản ứng hóa học khảo sát 24

3.1.3 Chiết xuất dược liệu 27

3.1.3.1 Chiết cao toàn phần từ cây Tứ Bạch Long 27

3.1.3.2 Tách phân đoạn cao toàn phần 28

3.1.4 Phân tích định tính thành phần hóa học các phân đoạn dịch chiết 28

3.1.5 Phương pháp sắc ký lớp mỏng 30

3.2 Kết quả nghiên cứu hóa học 31

3.2.1 Tiêu chuẩn hóa nguyên liệu 31

3.2.1.1 Độ ẩm bột dược liệu 31

3.2.1.2 Độ tro dược liệu 31

3.2.2 Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật 32

3.2.3 Chiết xuất dược liệu 35

3.2.3.1 Chiết xuất các dạng cao tổng 35

3.2.3.2 Chiết xuất các phân đoạn dịch chiết 36

3.2.4 Phân tích định tính thành phần hóa học các phân đoạn dịch chiết 37

3.2.5 Khảo sát SKLM các phân đoạn dịch chiết 40

Chương 4: KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA TBL 49

4.1 Phương pháp khảo sát hoạt tính kháng khuẩn 49

4.1.1 Định tính khả năng kháng khuẩn của cao chiết bằng phương pháp khuếch tán đĩa 49

4.1.2 Định lượng khả năng kháng khuẩn của cao chiết bằng phương pháp MIC 50

4.2 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn 50

4.2.1 Khảo sát khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán đĩa 50

5.1 Phương pháp khảo sát hoạt tính chống oxy hóa 57

5.1.1 Khảo sát năng lực khử 57

5.1.2 Khảo sát khả năng quét gốc tự do 58

5.1.2.1 Khả năng quét gốc tự do DPPH 58

5.1.2.2 Khả năng quét hydroxyl tự do 60

5.2 Kết quả khảo sát hoạt tính chống oxy hóa 61

5.2.1 Khảo sát năng lực khử 61

5.2.2 Khảo sát khả năng quét gốc tự do 64

5.2.2.1 Khả năng quét gốc tự do DPPH 64

5.2.2.2 Khả năng quét hydroxyl tự do 75

Chương 6: KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG VIÊM CỦA TBL 79

6.1 Phương pháp khảo sát in vitro khả năng kháng viêm bằng tác dụng ức chế biến tính albumin 79

6.2 Kết quả khảo sát in vitro knăng kháng viêm bằng tác dụng ức chế biến tính albumin do nhiệt 80

Chương 7: PHÂN LẬP HỢP CHẤT HÓA HỌC TỪ TBL 88

7.1 Phương pháp phân lập hợp chất hóa học từ TBL 88

7.1.1 Sắc ký nhanh – cột khô 90

7.1.2 Sắc ký cột cổ điển 91

7.1.3 Sắc ký lớp mỏng điều chế 91

7.1.4 Phân tích hợp chất đã cô lập 92

7.2 Kết quả phân lập hợp chất từ TBL 92

7.2.1 Kết quả sắc ký nhanh – cột khô 93

7.2.2 Kết quả sắc ký cột cổ điển 96

7.2.3 Kết quả SKLM điều chế 99

7.2.4 Kết quả phổ chất 1 100

Chương 8: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 101

8.1 Kết luận 101

8.1.1 Thực vật học 101

8.1.3 Hoạt tính sinh học 101

8.2 Đề nghị 102 TÀI LIỆU THAM KHẢO 104 PHỤ LỤC

1 Tên đề tài/dự án:

“KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC

VÀ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN, CHỐNG OXY HÓA

VÀ KHÁNG VIÊM CỦA CÂY TỨ BẠCH LONG

(BLEPHARIS MADERASPATENSIS (L.) ROTH)”

Chủ nhiệm đề tài: ThS Văn Đức Thịnh

Cơ quan chủ trì: Trung tâm Phát triển Khoa học & Công nghệ Trẻ

Thời gian thực hiện đề tài: 12 tháng (01/2012 – 01/2013)

Kinh phí được duyệt: 80 triệu đồng

Kinh phí đã cấp: theo Thông báo số /TB-SKHCN

2 Mục tiêu:

- Khảo sát khả năng kháng khuẩn, kháng viêm và chống oxy hóa của Tứ Bạch Long

làm cơ sở khoa học cho việc sử dụng loại dược liệu này

- Khảo sát thành phần hóa học của Tứ Bạch Long

3 Nội dung: (đối chiếu với hợp đồng đã ký):

Công việc dự kiến Công việc đã thực hiện

Khảo sát đặc điểm vi học TBL - Khảo sát đặc điểm vi học gồm vi

phẫu và bột dược liệu TBL, bao gồm các bộ phận rễ, thân và lá

- Khảo sát sơ bộ thành phần hóa thực

vật của nguyên liệu tươi và các phân đoạn cao chiết

Khảo sát khả năng kháng khuẩn của - Định tính khả năng kháng khuẩn của

phân đoạn dịch chiết bằng phương pháp khuếch tán đĩa trên các chủng khuẩn và nấm thông dụng

- Định lượng MIC của 2 phân đoạn

đáp ứng kháng khuẩn tốt nhất (phân đoạn ethyl acetat và chloroform) Khảo sát khả năng chống oxy hóa của

TBL

- Đánh giá năng lực khử của các dạng

cao chiết

- Khảo sát khả năng quét gốc tự do

(DPPH và hydroxyl tự do) của các dạng cao chiết

Khảo sát khả năng kháng viêm của Tứ

Bạch Long

- Đánh giá in vitro khả năng kháng

viêm của các dạng cao chiết bằng phương pháp ức chế biến tính albumin do nhiệt

Công bố 01 bài báo khoa học về nộ

dung nghiên cứu của đề tài

- Đã công bố bài báo khoa học “Bước

đầu khảo sát tác dụng sinh học của dược liệu Tứ Bạch Long (Blepharis

maderaspatensis (L.) Roth)” đăng

trên “Tạp chí Y học Tp Hồ Chí Minh”, tập 16, phụ bản số 1, 2012

1.1 Giới thiệu chung về TBL

1.1.1 Danh pháp và phân loại

TBL, hay còn gọi là Tai Rìa, có tên khoa học là Blepharis maderaspatensis (L.) Heyne ex Roth Ngoài ra, còn có tên gọi khác là Blepharis boerhaaviaefolia Pers hay Acanthus maderaspatensis L [11], [12]

TBL nằm trong hệ thống phân loại như sau: [5]

Loài: Tứ Bạch Long (Blepharis maderaspatensis

(L.) Heyne ex Roth)

1.1.2 Hình thái học [11], [12]

TBL là cây cỏ mọc bò có rễ bất định, có khi trườn; thân mảnh

Lá chụm 4; phiến tròn dài thon, chót có gai mũi, có lông ở mặt dưới Gié ngắn ở nách lá, lá hoa có răng nhọn dài; tiền diệp nguyên; lá đài không bằng nhau, một dài 1,7cm; vành chỉ có một môi, trắng hay hường; tiểu nhị 4

Nang 4 hột có lông

1.1.3 Sinh thái học và phân bố

TBL phân bố tự nhiên ở những vùng có điều kiện khí hậu khô nóng, nhưng lại thường thấy xuất hiên ở những địa điểm có dòng nước chảy qua, đặc biệt thích hợp với những vùng đất có độ mặn cao [11], [12], [19]

Cây có nguồn gốc từ Phi Châu Trên thế giới, cây được tìm thấy ở những quốc gia có điều kiện khô nóng như các nước châu Phi là Cộng hòa Dân chủ Congo, Cộng hòa Kenya, Burundi, Rwanda, Mozambique, Madagascar, Sudan, Trung Phi…; các nước Tây Á và Nam Á là Cộng hòa Yemen, Iran, Pakistan, Ấn Độ…; đến các nước Đông và Đông Nam Á như Trung Quốc, Thái Lan, Campuchia, Myanmar, Việt Nam… [23], [37], [42], [43], [44], [48], [55], [68]

Tại Việt Nam thì phân bố ở các vùng khô nóng ven biển như Khánh Hòa, Ninh Thuận, Bình Thuận [11], [12]

dân tộc ở Tamil Nadu - Ấn Độ như: [32], [33], [38], [41], [47], [59], [60], [64]

- Làm ổn định tổ chức thần kinh ở vết thương gãy xương: lá TBL nghiền thành bột nhão trộn với đậu đen, nước ép củ hành và lòng

trắng trứng Hay lá TBL trộn với lá Pterospermum suberifolium và

vỏ cây Drypetes roxburghii (Sang Trắng Roxburgh) và lòng đỏ

trứng

- Làm lành vết thương hở, vết thương nhiễm trùng, vết cắt đứt cơ: lá TBL nghiền thành bột nhão trộn với nước ép quả Chanh Lá Cam (lime), thoa lên vết thương Hay lá TBL trộn với củ hành, nghiền thành bột nhão rồi thoa lên vết đứt Hay dịch chiết từ lá TBL được đun nóng với dầu vừng rồi thoa lên vết thương

- Chữa đau họng và các bệnh hen suyễn: dịch ép lá TBL

- Chữa rắn cắn, bệnh bạch bì và suy nhược cơ thể: sử dụng cả cây

Lá TBL cũng được dùng để chữa các vết thương nhiễm trùng ở những vùng khác của Ấn Độ như Dharmapuri, Ghats, Peninsular… [29], [39], [45], [48], [57], [61], [62]

TBL cũng được dùng trong lãnh vực thuốc thú y, là thành phần trong các bài thuốc dân gian của Nam Ấn chữa sưng mủ, gãy xương, tiêu chảy và còn có công dụng kích thích tạo sữa cho gia súc

Tại Bình Thuận - Việt Nam, lá TBL được giã nát, đắp lên vết mổ sau khi nạo hút ổ áp xe, với công dụng làm vết thương mau lành, không chảy mủ

và chống tái phát áp xe [19]

1.2 Tình hình nghiên cứu và sử dụng cây TBL

1.2.1 Thế giới

Ấn Độ là quốc gia có nhiều nghiên cứu sâu rộng về dược học, đặc biệt

là các loại thảo dược Tại Ấn Độ, cây TBL được bày bán rộng rãi trong các

Theo các nghiên cứu khảo sát cây thuốc dân gian của địa phương, TBL là loài dược thảo luôn có mặt trong các danh mục dược liệu cổ truyền của nhiều dân tộc ở Ấn Độ, các quốc gia Tây Phi, Đông Phi và Nam Phi với các công dụng như kháng viêm, chống nhiễm trùng vết thương, mau lành vết thương

hở, chữa ung nhọt, chữa gãy xương…[11], [12], [23], [29], [30], [32], [36], [40], [43], [46], [55], [59], [64]

Tuy được sử dụng rộng rãi từ lâu đời nhưng còn khá ít những nghiên cứu chuyên sâu về TBL Công trình nghiên cứu khoa học đầu tiên về loài thực vật này được công bố bởi Devi và Meera (2010) Công trình này thiên

về phân tích đặc điểm hình thái học thực vật và sơ bộ thành phần hóa thực vật của lá TBL được thu thập từ Ấn Độ Kết quả thu được chủ yếu là các thông số hình thái học bên ngoài của TBL, nghiên cứu hóa học thực vật chỉ ở mức khảo sát sơ bộ Theo kết quả nghiên cứu thành phần hóa thực vật được công bố, lá TBL có các thành phần chủ yếu như sau: đường chiếm tỉ lệ nhiều nhất (14,31%), sau đó là saponin (9,2%) và alkaloid (5,5%), ngoài ra còn có flavonoid, tannin và chlorophil chiếm tỉ lệ ít hơn [30]

Mohan và cộng sự (2010) cũng đã công bố về đặc điểm vi học và thành phần hóa thực vật của toàn cây TBL Theo kết quả nghiên cứu này cho thấy, thành phần hóa học của toàn cây TBL gồm: alkaloid, terpenoid, coumarin, tannin, saponin, flavonoid, quinon, anthraquinon, phenol và glycosid [54]

Nghiên cứu sâu hơn về các hoạt tính sinh học của TBL cũng ghi nhận được những kết quả sau:

- Hoạt tính kháng sinh: Jeyachandran và cộng sự (2010) khảo sát hoạt

tính kháng khuẩn các dạng cao chiết ether dầu hỏa, ethanol, methanol, aceton của thân và rễ TBL trên 10 chủng khuẩn:

Escherichia coli, Salmonella typhi, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Entrobacter aerogens, Bacillus subtilis và Staphyllococcus sp Kết quả cho thấy cả thân và rễ TBL đều có khả

nhiên, nghiên cứu không đề cập đến nồng độ mẫu thử trong khảo sát kháng khuẩn và khảo sát chỉ mang tính định tính khả năng kháng của TBL trên các chủng thử nghiệm [40]

- Hoạt tính hạ lipid máu: Nghiên cứu của Aiyalu, Vellaichamy và

Sabarimuthu (2013) cho thấy TBL có khả năng làm giảm cholesteron

và triglycerid máu trên mô hình chuột được gây tăng lipid máu bằng Triton WR-1339 Dịch chiết các phân đoạn của TBL thể hiện hoạt tính giảm cholesteron và triglycerid máu tăng dần như sau: chloroform < ethyl acetat < ethanol Trong đó, phân đoạn chloroform thể hiện hoạt tính rất yếu, gần như không có Ngược lại, phân đoạn ethanol ở liều dùng 100mg/ml thể hiện hoạt tính gần nhất với thuốc

hạ lipid máu thử nghiệm là simvastatin ở liều dùng 20mg/ml [25]

- Hoạt tính chống oxy hóa: Trong nhiều nghiên cứu in vitro, TBL có

khả năng quét các loại gốc tự do như DPPH, hydroxyl, superoxid,

NO [24], [26], [31]

- Hoạt tính gây độc tế bào: Khả năng gây độc tế bào của dịch chiết

phân đoạn ethyl acetate của TBL có ý nghĩa với dòng tế bào ung thư ruột kết người (COLO 320 DM) sau thời gian điều trị là 72 giờ (IC50=45µg/ml, trong khi IC50 đối với dòng tế bào thường VERO là 86µg/ml) Ngoài ra, cùng thời gian điều trị thì IC50 gây độc tế bào của phân đoạn ethyl acetate đối các dòng tế bào ung thư khác như dạ dày (AGS), vú (MCF-7) và phổi (A549) lần lượt là 72µg/ml, 80µg/ml và 153µg/ml Phân đoạn hexane của TBL hầu như không có khả năng gây độc đối với các dòng tế bào ung thư theo dõi nhưng ở nồng độ cao sẽ gây độc cho tế bào thường (IC50=182µg/ml sau 72 giờ điều trị và IC50=325µg/ml sau 24 giờ điều trị) Phân đoạn methanol của TBL có ngưỡng gây độc đối với các dòng tế bào ung thư rất cao trong khi đối với dòng tế bào thường thì ngưỡng này thấp hơn nhiều (gần gấp 3 lần) [26]

theo tăng thể tích nước tiểu trên mô hình thử nghiệm chuột nhắt trắng được cho uống nước muối Các dạng cao chiết TBL với nhiều loại dung môi khác nhau thể hiện hoạt tính tăng dần như sau: benzen

< nước < chloroform < cồn Trong đó, hoạt tính của 2 dạng cao chiết cồn và chloroform gần như không có sự khác biệt và ở liều dùng 250mg/kg thì thể hiện hoạt tính gần nhất với thuốc lợi tiểu furosemid

ở liều dùng 20mg/kg [31]

1.2.2 Trong nước

TBL được ghi nhận lần đầu tiên trong báo cáo kết quả đợt điều tra dược liệu tại tỉnh Bình Thuận của Trung tâm Sâm và Dược liệu Tp.HCM (2007) Báo cáo ghi nhận tọa độ, vị trí phân bố của TBL trên địa bàn khu vực này và cũng ghi nhận về công dụng dân gian của TBL là kháng khuẩn, làm vết thương mau lành [9]

Hội Đông Y tỉnh Bình Thuận cũng đã nhắc đến TBL trong chuyên luận tại Hội thảo Cây dược liệu quý hiếm của địa phương (2008) Chuyên luận cho biết cách sử dụng TBL trong điều trị áp xe ở địa phương và so sánh những trường hợp được điều trị áp xe bằng kháng sinh với điều trị bằng TBL Kết quả cho thấy vết thương áp xe sau khi mổ nạo hút mủ được đắp TBL giã nát thay cho kháng sinh thông thường sẽ làm vết thương mau lành, không làm mủ, không tái phát [19]

Các tài liệu về thực vật, cây thuốc Việt Nam của Phạm Hoàng Hộ, Võ Văn Chi cũng chỉ đề cập tới TBL như một loài cỏ mọc hoang dại phân bố từ nam Khánh Hòa vào bắc Bình Thuận [11], [12]

Chương 2: KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC

CỦA TBL

2.1 Phương pháp nghiên cứu thực vật học

2.1.1 Khảo sát đặc điểm hình thái

Khảo sát đặc điểm hình thái của cây TBL trồng tại Bộ môn Tài nguyên – dược liệu, Trung tâm Sâm và Dược liệu Tp Hồ Chí Minh

2.1.2 Khảo sát đặc điểm vi học

2.1.2.1 Vi phẫu [4]

Chọn mẫu tươi, không quá già cũng không quá non và đảm bảo đầy

đủ các đặc điểm thực vật như sau:

- Thân và rễ nhỏ: lấy một đoạn có đủ mặt cắt ngang

- Lá: lấy một đoạn gân giữa có dính mỗi bên một ít phiến lá

Cắt ngang mẫu thành lát mỏng và sao cho lát cắt nằm trong mặt phẳng vuông góc với trục mẫu cắt

Nhuộm 2 màu bằng màu kép (lục iod 0,1% và đỏ carmin 1%) Giữ mẫu đã nhuộm trong nước cất

Làm tiêu bản mẫu trong giọt nước cất dưới kính hiển vi điện tử ở các

độ phóng đại x40, x100, x400 Ghi nhận đặc điểm, chụp hình và chú thích đầy đủ các chi tiết

2.1.2.2 Bột dược liệu [2], [4]

Làm tiêu bản bột soi trong dung dịch KOH 5% và trong nước cất Quan sát dưới kính hiển vi ở các độ phóng đại x100 và x400 Ghi nhận, chụp hình và chú thích các phần tử quan sát được

2.2 Kết quả nghiên cứu thực vật học

2.2.1 Khảo sát về đặc điểm hình thái

TBL là cây cỏ thân mảnh, đường kính thân khoảng 1mm, mọc bò có

rễ bất định, chiều dài của lóng khoảng 85 – 92mm, mấu phình to

Lá mọc vòng, chụm 4; cuống lá vừa, dài khoảng 4 – 5mm; phiến lá tròn dài, phần đầu rộng và thuôn dần về phía cuống (dài 30 – 40mm, rộng 12 – 15mm), đầu lá nhọn, có lông ở mặt dưới

Gié hoa ngắn, ở nách lá 4 lá đài dài khoảng 7 – 8mm, mép có răng nhọn dài như lông mi, xếp 2 lá nằm ngoài và 2 lá nằm trong đối diện từng đôi một Tràng hoa có 1 cánh lớn dài 18 – 20mm, đầu xẻ 3 thùy, màu trắng sọc hồng tím, đối diện với 1 cánh dạng lưỡi dài 15 – 17mm, màu hồng tím 4 tiểu nhị hướng nội, dài 7 – 8mm Bầu nhụy trên, 4 buồng, mỗi buồng mang 1 tiểu noãn đính trung trục

2.2.2 Khảo sát đặc điểm vi học

2.2.2.1 Vi phẫu:

 Rễ:

Tiết diện rễ có dạng tròn Nội bì và trụ bì rõ phân biệt rễ thành 2 vùng

là vỏ và tủy, vùng vỏ có phần rộng hơn vùng tủy Ngoài cùng còn có thêm vùng lông hút

Vùng lông hút của rễ chỉ gồm 2 thành phần:

- Ngoài cùng là tầng lông hút với một lớp tế bào mô mềm, vách mỏng

không phân biệt rõ rệt và vết tích của lông hút đã đứt gãy, dập nát

- Sát dưới tầng lông hút là vùng tẩm suberin gồm 2 hay 3 hàng tế bào

hình khối, đường kính khoảng 27 – 38µm, vách dày

Vùng vỏ rễ gồm các thành phần:

- Hầu hết vùng này chỉ là các tế bào mô mềm với các tế bào màng

mỏng, hình lục giác gần tròn, đường kính khoảng 43 – 68µm

- Trong cùng của vùng vỏ rễ là 1 vòng tế bào nội bì rõ rệt, gồm các tế

bào hình chữ nhật nằm ngang, kích thước khoảng 20µm x 50µm Vùng tủy rễ gồm các thành phần:

- Trụ bì bắt đầu cho vùng tủy Trụ bì là 1 vòng tế bào hình chữ nhật

nằm ngang, kích thước khoảng 17µm x 45µm, nằm sát dưới nội bì

- Mô dẫn truyền chiếm phần lớn diện tích vùng tủy, nằm sát dưới trụ bì,

gồm libe II nằm ngoài và gỗ II nằm trong, xếp thành vòng liên tục Ống gỗ có đường kính khoảng 15 – 55µm Libe I và gỗ I thường tiêu biến Gỗ I đôi khi còn thấy vết tích tại vị trí tận cùng của gỗ II, nhưng không rõ

- Trong cùng của vùng tủy đôi khi còn thấy mô mềm tủy là các tế bào

màng mỏng, hình tròn, đường kính khoảng 28 – 33µm

Nhận xét: Cấu tạo vi phẫu của rễ TBL chủ yếu có cấu tạo cấp II, ít

khi thấy các thành phần cấp I và thường không rõ Ngoài ra, những đặc điểm

vi phẫu khác cũng khá thông thường đối với rễ cây lớp Ngọc Lan, không mang tính đặc trưng

 Thân:

Tiết diện thân TBL có dạng hình vuông với 4 góc bầu tròn Vùng vỏ

và vùng tủy phân biệt nhờ nội bì và trụ bì rõ, vùng tủy chiếm hầu hết và rộng gấp 4 lần vùng vỏ

1 Tầng lông hút 2 Vùng tẩm suberin 3 Mô mềm vỏ 4 Nội bì

5 Trụ bì 6 Libe II 7 Gỗ II 8 Gỗ I 9 Mô mềm tủy

Hình 2.2: Cấu tạo vi phẫu rễ TBL

III

I

II

Vùng vỏ thân gồm các thành phần:

- Ngoài cùng là biểu bì, gồm những tế bào hình chữ nhật nằm ngang,

kích thước 7 – 8µm x 17 – 18µm, vách ngoài dày hơn các vách trong

và có tẩm cutin dạng răng cưa

- Trên biểu bì có mang các lông che chở và lông tiết Lông che chở

dạng đa bào, vách dày, gồm 3 tế bào: tế bào dưới thường ngắn, tế bào giữa dài và và tế bào trên có đầu nhọn Lông tiết có vách mỏng, chân ngắn, nằm sát với biểu bì, đầu gồm 2 tế bào tiết to bằng nhau

- Sát dưới biểu bì là mô dày, gồm 2 hàng tế bào hình lục giác gần tròn,

đường kính khoảng 15 – 20µm, có vách dày cellulose ở góc

- Bên trong có mô mềm vỏ gồm các tế bào màng mỏng, hình lục giác

gần tròn, kích thước tương đối lớn, đường kính khoảng 17 – 30µm

- Trong cùng của vùng vỏ là nội bì gồm 1 hàng tế bào hình chữ nhật

nằm ngang, kích thước khoảng 12µm x 23µm, xếp khít nhau

Vùng tủy thân gồm các thành phần:

- Trụ bì nằm sát dưới nội bì, là 1 hàng tế bào hình chữ nhật nằm ngang,

kích thước tương đối nhỏ hơn nội bì, khoảng 9µm x 20µm

- Bó mạch gồm 4 thành phần theo thứ tự lần lượt từ ngoài vào trong là

libe I, libe II, gỗ II và gỗ I Libe II và gỗ II xếp tập trung thành vòng liên tục sát dưới trụ bì, gỗ Ii chèn ép libe II thành 1 dãi hẹp Libe I và

gỗ I chỉ tìm thấy ở 4 góc thân, libe I hóa sợi, gỗ I phân hóa li tâm Các ống gỗ có đường kính khoảng 12 – 23µm

- Trong cùng là mô mềm tủy, chiếm ½ đường kính thân, là các tế bào

màng mỏng, kích thước rất lớn, đường kính khoảng 50 – 90µm

Nhận xét: Thân TBL có cấu tạo vi phẫu khá phổ biến của thân cây

lớp Ngọc Lan với các thành phần cơ bản như biểu bì, mô dày, mô mềm, các thành phần mạch Ngoài ra, những đặc điểm đặc trưng của thân cây họ Ô Rô cũng được ghi nhận như là: thân có dạng gần vuông, có 4 bó mạch cấp I tập trung ở 4 góc thân, nội bì và trụ bì thấy rõ Những đặc điểm riêng của loài có thể dùng làm cơ sở kiểm nghiệm là đặc điểm của lông che chở đa bào và lông tiết; libe I hóa sợi

I Tiết diện thân TBL (x100) II Chi tiết thân TBL (x400)

1 Lông che chở đa bào 2 Biểu bì 3 Lông tiết 4 Mô dày 5 Mô mềm vỏ

6 Nội bì 7.Trụ bì 8 Libe I hóa sợi 9 Libe II

10 Gỗ II 11 Gỗ I 12 Mô mềm tủy

Hình 2.3: Cấu tạo vi phẫu thân TBL

 Lá:

Tiết diện lá chia thành 2 vùng rõ rệt: vùng gân lá là nơi tập trung bó mạch, phình to ra và u lồi về phía dưới; vùng thịt lá không mang bó mạch, có dạng phiến dẹt

Vùng gân lá gồm các thành phần:

- Trên cùng là biều bì là các tế bào hình đa giác, đường kính khoảng 23

– 30µm, xếp khít nhau, vách ngoài có tẩm cutin dạng răng cưa, không mang lông che chở

- Dưới biểu bì là mô dày gồm các tế bào hình lục giác, đường kính

khoảng 25µm, có góc tô dày cellulose, tập trung thành cụm

- Phần giữa gân lá có mô mềm là các tế bào màng mỏng, đường kính

khoảng 36 – 38µm

- Chính giữa gân lá là bó mạch hình lưỡi liềm, phần bầu tròn hướng

xuống dưới và phần cong nhọn hướng lên trên, gần như khép kín thành vòng; gồm libe bao ngoài, trong là gỗ II, vẫn còn vết tích của gỗ

I Ống gỗ có đường kính khoảng 20 – 25µm

- Mặt dưới gân lá cũng có biểu bì dưới tương tự như biểu bì trên và

cũng không mang lông che chở, nhưng chỉ có 1 hàng tế bào mô dày Vùng thịt lá gồm các thành phần:

- Biểu bì trên có dạng hình lục giác lớn, đường kính khoảng 50µm,

mang lông che chở đơn bào và không có lỗ khí Biểu bì dưới có dạng hình chữ nhật nằm ngang, kích thước 37µm x 50µm, mang lỗ khí và nhiều lông che chở đơn bào hơn biểu bì trên Cả biểu bì trên và dưới đều không tẩm cutin

- Dưới biểu bì trên là mô giậu, gồm các tế bào màng mỏng, chứa nhiều

lục lạp, hình chữ nhật, kích thước 23µm x 63µm, xếp dọc và khít nhau Mặt dưới lá không có mô mềm giậu

- Tiếp theo dưới mô mềm giậu là mô mềm khuyết gồm các tế bào màng

mỏng, đường kính khoảng 17 – 55µm, xếp với nhau tạo thành nhiều khoảng trống, các khoảng trống tập trung nhiều về phía mặt dưới lá

Nhận xét: lá TBL có cấu tạo vi phẫu mang những đặc điểm đặc trưng

của lá thực vật lớp Ngọc Lan với cấu tạo gồm 2 phần là gân lá và thịt lá rõ rệt, bó mạch nằm giữa vùng gân lá có dạng hình vòng cung Ngoài ra, cấu

Chú thích:

I Tiết diện lá TBL (x100) II Chi tiết phần thịt lá (x400)

III Chi tiết mặt trên gân lá (x400) IV Chi tiết bó mạch (x400)

V Chi tiết mặt dưới gân lá (x400)

1 Lông che chở đơn bào 2 Biểu bì dưới 3 Mô mềm khuyết 4 Mô mềm giậu

5 Biểu bì trên 6 Mô dày dưới 7 Mô mềm 8 Libe 9 Gỗ II

10 Gỗ I 11 Mô dày trên 12 Khuyết

Hình 2.4: Cấu tạo vi phẫu lá TBL

tạo vi phẫu lá TBL cũng mang những đặc điểm của thực vật vùng khô nóng như là: biểu bì tẩm cutin, lông che chở mặt dưới nhiều hơn mặt trên, lỗ khí chỉ tập trung ở mặt dưới lá Đồng thời, những đặc điểm chi tiết về các thành phần như lông che chở đơn bào và cách phân bố, sắp xếp của các loại mô dày, mô mềm giậu, biểu bì… có ý nghĩa trong công tác kiểm nghiệm, phân biệt với lá dược liệu khác

- Mảnh biểu bì lá với các tế bào biểu bì vách ngoằn ngoèo Biểu bì trên

không mang lỗ khí, biểu bì dưới có lỗ khí kiểu trực bào

- Mảnh lông che chở đơn bào vách sần sùi và mảnh lông che chở đa

bào vách dày

- Mảnh bần tế bào có dạng hình khối, kích thước khoảng 23µm x 30µm

- Mảnh mô mềm, tế bào hình lục giác, đường kính khoảng 65µm

- Mảnh mô mềm chứa lục lạp

- Mảnh mô cứng, tế bào hình lục giác, vách dày, đường kính khoảng

45µm

- Mảnh mạch vạch có đường kính khoảng 27µm; mạch mạng có đường

kính khoảng 50µm; mạch xoắn có đường kính khoảng 13µm và mạch điểm có đường kính khoảng 15 - 37µm

- Tinh thể calci oxalat hình chữ nhật, kích thước 25µm x 45µm

- Hạt tinh bột hình cầu, đường kính 7 - 20µm, tập trung thành từng đám

- Hạt phấn có đường kính khoảng 56 - 58µm

Chú thích:

1 Biểu bì thân 2 Biểu bì trên của lá 3 Biểu bì dưới của lá

4 Lông che chở đa bào 5 Lông che chở đơn bào 6 Mảnh bần

7 Mảnh mô cứng 8 Mảnh mô mềm 9 Mảnh mô mềm chứa lục lạp

10 Mạch vạch 11 Mạch mạng

12 Mạch điểm 13 Mạch xoắn 14 Hạt phấn

15 Tinh bột 16 Tinh thể calci oxalat

Hình 2.5: Kết quả soi bột dược liệu TBL

Nhận xét: kết quả soi bột dược liệu TBL cho thấy các thành phần

hoàn toàn phù hợp với kết quả vi phẫu, chứng tỏ bột dược liệu không bị lẫn tạp Các đặc điểm về bột dược liệu có thể dùng làm tư liệu và cơ sở cho công tác kiểm nghiệm và nghiên cứu TBL sau này

Chương 3: KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC TBL

3.1 Phương pháp nghiên cứu hóa học

3.1.1 Tiêu chuẩn hóa nguyên liệu [2], [4]

- Cân chính xác vào bì khoảng 2g mẫu

- Sấy mẫu ở áp suất thường, 105oC trong 4 giờ, lấy ra để trong bình hút ẩm và đem cân trọng lượng sau khi sấy Lặp lại nhiều lần, mỗi lần sấy 2 giờ, cho khi trọng lượng không thay đổi

- Độ ẩm của mẫu được tính theo công thức sau:

% 100 ) (

x a

c b a X

X: độ ẩm mẫu thử, % a: khối lượng ban đầu của mẫu thử, g b: khối lượng sau cùng của mẫu thử, g c: khối lượng bì, g

- Thí nghiệm được thực hiện 3 lần lặp lại

3.1.1.2 Xác định độ tro trong dược liệu

 Xác định độ tro toàn phần

- Dùng chén nung bằng sứ làm bì Nung chén sứ ở 500oC, để nguội trong bình hút ẩm và cân trọng lượng bì

- Cân chính xác vào bì khoảng 1g mẫu thử

- Đốt cháy mẫu trong bì trên bếp nhiệt đến khi hết khói trắng

- Đem nung mẫu trong lò nung ở 500oC trong 4 giờ, để nguội trong bình hút ẩm và cân trọng lượng mẫu tro sau nung Lặp lại nhiều lần, mỗi lần nung 2 giờ, đến khi trọng lượng mẫu tro không đổi

- Độ tro toàn phần của mẫu được tính theo công thức sau:

% 100

) (

x d X d

c e Y

Y: độ tro toàn phần của mẫu thử, % c: khối lượng bì, g

d: khối lượng ban đầu của mẫu thử, g e: khối lượng sau cùng của tro từ mẫu thử, g X: độ ẩm mẫu thử, %

- Thí nghiệm được thực hiện 3 lần lặp lại

 Xác định độ tro không tan trong HCl:

- Cho 25ml HCl 2M vào tro toàn phần , đun sôi 5 phút

- Lọc để tập trung những chất không tan vào một giấy lọc không tro

- Rửa nhiều lần bằng nước nóng

- Đem nung ở 500oC trong 4 giờ, để nguội trong bình hút ẩm, cân trọng lượng và lặp lại nhiều lần, mỗi lần nung 2 giờ, cho đến khi trọng lượng cân được là không đổi

- Độ tro không tan trong HCl được tính theo công thức:

% 100 d x X d

c f y

y: độ tro không tan trong acid của mẫu thử, % c: khối lượng bì, g

d: khối lượng ban đầu của mẫu thử, g f: khối lượng sau cùng của tro còn lại sau khi hòa tan trong HCl 2M, g

X: độ ẩm của mẫu thử, %

- Thí nghiệm được thực hiện 3 lần lặp lại

3.1.2 Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật [2]

3.1.2.1 Chuẩn bị dịch chiết:

 Dịch chiết ether:

Chiết 10g nguyên liệu tươi bằng ether ethylic Chiết cho tới khi dịch ether sau khi bốc hơi không còn để lại lớp cắn mờ trên mặt kính đồng hồ Gộp dịch chiết, lọc và cô lại đến khi còn khoảng 50ml dịch chiết ether

Dịch chiết ether dùng để xác định các nhóm hợp chất sau :

Tinh dầu Triterpenoid Anthraquinon Chất béo Alkaloid Flavonoid Carotenoid Coumarin

 Dịch chiết cồn:

Bã dược liệu được chiết tiếp bằng cồn cao độ trong bình tam giác với sinh hàn hồi lưu 20-30 phút trên bếp cách thủy, thực hiện 3 lần Gộp các dịch chiết, lọc và cô lại đến khi còn khoảng 50ml dịch chiết cồn

Dịch chiết cồn được dùng để xác định các nhóm hợp chất sau :

Flavonoid Acid hữu cơ Tannin

 Dịch chiết cồn thủy phân:

Lấy 15ml dịch chiết cồn cho vào bình tam giác, thêm 10ml acid HCl 10% và đun hồi lưu trên bếp cách thủy 30 phút Để nguội, cho hỗn hợp vào bình lắng gạn và chiết bằng ether ethylic, thực hiện 3 lần Dịch ether được dùng để định tính các aglycon

Dịch chiết cồn thủy phân dùng để xác định các nhóm hợp chất sau : Triterpenoid Anthraquinon

 Dịch chiết nước:

Bã dược liệu sau khi chiết bằng cồn được đem chiết nóng với nước trong bình tam giác trên bếp cách thủy, thực hiện 3 lần Gộp dịch chiết, để nguội, lọc và cô lại đến khi còn khoảng 50ml dịch chiết nước

Dịch chiết nước dùng để xác định các nhóm hợp chất sau :

Alkaloid Tannin Acid hữu cơ Flavonoid Saponin Polyuronid Các hợp chất khử

 Dịch chiết nước thủy phân:

Lấy 15ml dịch chiết nước cho vào bình tam giác, thêm 10ml acid HCl 10% và đun hồi lưu trên bếp cách thủy 30 phút Để nguội, cho hỗn hợp vào bình lắng gạn và chiết bằng ether ethylic, thực hiện 3 lần Dịch ether được dùng để định tính các aglycon

Dịch chiết nước thủy phân dùng để xác định các nhóm hợp chất sau : Triterpenoid Anthraquinon Flavonoid

3.1.2.2 Các phản ứng hóa học khảo sát:

 Xác định tinh dầu:

Lấy khoảng 5ml dịch chiết cho vào chén sứ, bốc hơi tới cạn Nếu cắn

có mùi thơm nhẹ, thêm vào cắn một ít cồn cao độ, rồi lại bốc hơi cho đến cắn Cắn có mùi thơm nhẹ đặc trưng: có tinh dầu

 Xác định chất béo:

Lấy vài giọt dịch chiết nhỏ lên cùng một chỗ trên một miếng giấy mỏng, hơ hoặc sấy nhẹ cho bay hết dung môi (và hết mùi thơm nếu dịch chiết còn tinh dầu) Nếu tại nơi nhỏ dịch chiết có vết trong mờ: có chất béo

 Định tính carotenoid:

Cách 1: lấy khoảng 5ml dịch chiết cho vào chén sứ, bốc hơi nhẹ tới cắn (và gần như không còn mùi thơm nếu dịch chiết có tinh dầu) Thêm vào cắn vài giọt dung dịch SbCl3 bão hòa trong chloroform (thuốc thử Carr-Price) Dung dịch có màu xanh sau đó chuyển thành màu đỏ: có carotenoid

Cách 2: lấy khoảng 5ml dịch chiết cho vào chén sứ, bốc hơi nhẹ tới cắn (và gần như không còn mùi thơm nếu dịch chiết có tinh dầu) Thêm vào cắn vài giọt H2SO4 đậm đặc Dung dịch có màu xanh dương đậm hay màu xanh lục ngả sang màu xanh dương: có carotenoid

 Định tính triterpenoid:

Lấy khoảng 5ml dịch chiết cho vào chén sứ, bốc hơi tới cắn Hòa tan cắn với 0,5ml anhydrid acetic rồi thêm vào dung dịch 0,5ml chloroform Chuyển dung dịch vào một ống nghiệm nhỏ, khô Thêm 1ml H2SO4 đậm đặc lên thành ống nghiệm để nghiêng cho acid chảy xuống đáy ống nghiệm Nơi tiếp xúc giữa 2 lớp dung dịch có màu đỏ nâu hay đỏ đến tím, lớp dung dịch phía trên dần dần chuyển sang màu xanh lục hay tím: có triterpenoid

 Định tính alkaloid:

Lấy khoảng 10ml dịch chiết cho vào chén sứ, bốc hơi tới cắn Hòa cắn trong 4ml dung dịch acid hydrocloric 1% Chia dung dịch acid vào 4 ống nghiệm nhỏ Định tính alkaloid bằng các thuốc thử:

Thuốc thử Mayer: cho tủa trắng – vàng nhạt

Thuốc thử Bouchardat: cho tủa đỏ nâu

Thuốc thử Dragendorff: cho tủa đỏ cam

So sánh kết quả với ống chứng không có thuốc thử Nếu dung dịch đục hơn so với ống chứng hoặc có tủa: có alkaloid

 Định tính coumarin:

Lấy khoảng 5ml dịch chiết cho vào chén sứ, bốc hơi tới cắn Hòa cắn trong 2ml cồn 70% Chia đều dịch chiết vào 2 ống nghiệm nhỏ Thêm vào ống thứ nhất 0,5ml KOH 10% và ống thứ hai một lượng nước cất tương đương Đun cách thủy cả 2 ống nghiệm trong 2 phút, để nguội và soi dưới đèn tử ngoại 365nm Dung dịch trong ống 1 có huỳnh quang mạnh hơn dung dịch trong ống thứ 2: có coumarin

 Định tính anthraquinon:

Lấy khoảng 5ml dịch chiết cho vào một ống nghiệm nhỏ Thêm vào 1ml dung dịch NaOH 10% và lắc kỹ Nếu lớp kiềm có màu từ hồng tới đỏ:

có anthraquinon

 Định tính flavonoid:

Lấy khoảng 10ml dịch chiết cho vào chén sứ, bốc hơi đến cắn khô Hòa cắn với 2ml cồn và gạn dịch cồn vào một ống nghiệm nhỏ Thêm vào một ít bột Mg kim loại và thêm từ từ 0,5ml HCl đậm đặc Nếu sau phản ứng, dung dịch có màu từ hồng tới đỏ: có flavonoid

 Định tính anthocyanoid:

Lấy 1ml dịch chiết cho vào một ống nghiệm nhỏ Thêm 2-3 giọt dung dịch acid hydrocloric 10% Nếu dung dịch có màu hồng tới đỏ và chuyển sang màu xanh khi kiềm hóa bằng dung dịch NaOH 10%: có anthocyanoid

 Định tính proanthocyanidin:

Lấy 5ml dịch chiết cho vào ống nghiệm Thêm 2ml dung dịch acid HCl 10% và đun trên bếp cách thủy 10 phút Nếu dung dịch có màu từ hồng tới đỏ: có proanthocyanidin

 Định tính tannin:

Lấy 2ml dịch chiết cho vào một chén sứ, bốc hơi tới cắn Hòa tan cắn với 4ml nước trên bếp cách thủy Lọc và chia dịch chiết vào 2 ống nghiệm:

- Ống nghiệm thứ nhất: pha loãng 0,5ml dịch chiết với 1ml nước cất

Thêm 2-3 giọt thuốc thử FeCl3 5% lắc đều Nếu dung dịch có màu xanh đen hay xanh rêu: có polyphenol

- Ống nghiệm thứ hai: thêm vào dịch lọc 5 giọt dung dịch gelatin muối,

lắc đều, so sánh với ống chứng chứa dịch chiết ban đầu Nếu có tủa bông trắng: có tannin

 Định tính saponin:

Lấy 5ml dịch chiết cồn cho vào một chén sứ, bốc hơi tới cắn Hòa cắn với 5ml dịch cồn 25% trên bếp cách thủy, lọc vào ống nghiệm Thêm 5ml nước và lắc mạnh theo chiều dọc ống Nếu có bọt bền: có saponin

 Định tính các chất khử:

Lấy 5ml dịch chiết cồn cho vào chén sứ, bốc hơi tới cắn Hòa cắn với 3ml nước cất trên bếp cách thủy, để nguội và lọc qua giấy lọc Thêm vào

dịch lọc 0,5ml dung dịch Fehling A và 0,5ml dung dịch Fehling B Đun cách thủy 5 phút Nếu có kết tủa đỏ gạch dưới đáy ống nghiệm: có các hợp chất khử ( chủ yếu là đường khử)

 Định tính các acid hữu cơ:

Lấy 2ml dịch chiết cho vào một ống nghiệm Pha loãng với 1ml nước

và thêm vào một ít tinh thể natri carbonat Nếu có các bọt khí nhỏ sủi lên từ các tinh thể Na2CO3: có acid hữu cơ

 Định tính hợp chất polyuronid:

Nhỏ từng giọt một 2ml dịch chiết vào một ống nghiệm có chứa 10ml cồn 96% Nếu có nhiều tủa bông được tao thành: có các polyuronid (gôm, pectin, chất nhầy…)

3.1.3 Chiết xuất dược liệu [2], [15], [22]

3.1.3.1 Chiết cao toàn phần từ cây TBL:

 Chiết cao nước tổng bằng phương pháp siêu âm:

Cân 50 g bột toàn cây TBL, cho nước cất vào ngập cách mặt dược liệu khoảng 5 – 6 cm, đem đánh siêu âm ở nhiệt độ 600 – 700C trong 10 phút, sau

đó đem lọc thu dịch chiết nước Làm như vậy cho đến khi dịch chiết gần như không màu Gộp tất cả dịch chiết lại đem đun cách thủy cho đến khi nước bốc hơi hết ta thu được cao nước tổng

 Chiết cao cồn tổng bằng phương pháp ngấm kiệt:

Cân 2 kg bột toàn cây TBL, làm ẩm bằng cồn 96% Cho mẫu vào bình ngấm đã lót bông ở đáy, sau đó phủ lên trên nguyên liệu một lớp giấy lọc

Mở khóa rồi cho từ từ cồn vào bình đến khi có vài giọt dung môi bắt đầu chảy ra rồi khóa bình, đổ ngập dung môi cách mặt dược liệu khoảng 5 – 6 cm, ngâm qua đêm Sau 24 giờ mở vòi rút dịch chiết ra Tiếp tục châm cồn vào

và ngâm 24 giờ tiếp theo, chiết cho đến khi dịch chiết gần như không màu Gộp tất cả dịch chiết lại đem cô giảm áp cho đến khi bay hết cồn ta thu được cao cồn tổng

3.1.3.2 Tách phân đoạn cao toàn phần:

Cao tổng cồn được thực hiện chiết thành các phân đoạn cao bằng phương pháp chiết lỏng – lỏng

Hòa tan hoàn toàn cao cồn tổng với nước, đem lắc phân đoạn lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần: ether dầu hỏa, chloroform, ethyl acetat, n- buthanol bão hòa nước

Lắc thu các phân đoạn cho đến khi không còn chất hòa tan vào dung môi thì đổi sang chiết với dung môi phân cực hơn Cô giảm áp cho đến khi dung môi bay hết ta thu được 4 phân đoạn cao Phần dịch nước còn lại sau cùng cũng đem đun cách thủy đến khi cạn nước, thu được cao nước còn lại

Tóm tắt quy trình như hình 3.1

Bột cây TBL (2kg)

Dịch cồn

Bã dược liệu

Cao cồn tổng

Dịch cao cồn

Dịch

ether

Dịch chloroform

Dịch ethyl acetat

Dịch lắc

n - butanol

Dịch nước còn lại

Cô giảm áp Cô giảm áp Cô giảm áp Cô giảm áp Cô giảm áp

Cao ether Cao

chloroform

Cao ethyl acetat

Cao

n - butanol

Cao nước còn lại

3.1.4 Phân tích định tính thành phần hóa học các phân đoạn dịch chiết: [2], [7], [8], [15]

Các phân đoạn dịch chiết ether, chloroform, ethyl acetat, n – buthanol cùng với phần dịch nước còn lại sau khi lắc phân đoạn được đem phân tích định tính sự hiện diện của các nhóm chất chính đã cho kết quả dương tính trong phần khảo sát sơ bộ hóa thực vật bằng các phản ứng hóa học Các phản

ứng hóa học này được tóm tắt như bảng 3.1

Bảng 3.1: Tóm tắt phản ứng định tính hóa học cao phân đoạn

Nhóm chất Thuốc thử/ Phản ứng Hiện tượng dương tính

Flavonoid H2SO4 đđ Màu vàng, cam, đỏ, xanh dương

Cyanidin Lớp trên màu cam, đỏ, tím FeCl3 5% Màu xanh lục – rêu

Coumarin KOH 10% + UV365nm Phát huỳnh quang

Terpenoid Liebermann- Buchard Màu xanh dương, lục, cam, đỏ

Rosenthaler Màu lục, tím

Saponin Lắc mạnh với nước Bọt bền

Saponin

triterpen/

steroid

Fontan- Kaudel Bọt như nhau: saponin triterpen

Bọt kiềm cao hơn: saponin steroid