nghiên cứu nọc bò cạp heterometrus sp với tác dụng kháng viêm giảm đau tạo nguồn nguyên liệu dược

Tính chất của nọc thu sau 6 tháng nuôi bò cạp trong phòng thí nghiệm cho thấy với điều kiện phân tích như trên thì trong 10 phân đoạn tách ra chỉ có 2 phân đoạn có độc tính, đó là các ph

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

BÁO CÁO NGHIỆM THU

(Đã chỉnh sửa theo góp ý của Hội đồng nghiệm thu)

(TÊN ĐỀ TÀI) NGHIÊN CỨU NỌC BÒ CẠP HETEROMETRUS SP VỚI TÁC DỤNG KHÁNG VIÊM, GIẢM ĐAU TẠO NGUỒN NGUYÊN

CƠ QUAN QUẢN LÝ CƠ QUAN CHỦ TRÌ

(Ký tên/đóng dấu xác nhận) (Ký tên/đóng dấu xác nhận)

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 01/ 2010

TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Bò cạp đen Heterometrus sp phân bố ở các vùng Tây Ninh và An Giang được xác định thuộc loài Heterometrus laoticus Couzijn 1981 Nọc bò cạp được thu bằng

xung điện ở tần số 2,63 kHz Nọc thu được lúc mới nuôi bò cạp trên cột sắc ký với Bio-Gel P10 đã tách ra làm 10 phân đoạn, trong đó có 6 phân đoạn có độc tính Kết quả điện di các phân đoạn có độc tính cho thấy chúng có khối lượng phân tử tương đương khối lượng phân tử của các neurotoxin và các enzyme, trong đó có phospholipase Các neurotoxin là thành phần được cho là có dược tính chính của nọc

bò cạp Bảo quản nọc này ở điều kiện -20 0C trong 6 tháng và phân tích nọc sau bảo quản bằng phương pháp sắc ký và điện di với điều kiện như trên thì trong 10 phân đoạn tách ra chỉ có 4 phân đoạn có độc tính So với nọc đã khảo sát 6 tháng trước thì hai phân đoạn không gây độc là các enzyme Các enzyme là các protein có khối lượng phân tử lớn hơn và dễ thay đổi tính chất trong khi đó các neurotoxin có khối lượng phân tử nhỏ nên bền hơn và tính chất không thay đổi sau thời gian bảo quản Kết quả này cho thấy nọc bảo quản trong điều kiện như vậy có thể sử dụng làm nguyên liệu dược Tính chất của nọc thu sau 6 tháng nuôi bò cạp trong phòng thí nghiệm cho thấy với điều kiện phân tích như trên thì trong 10 phân đoạn tách ra chỉ có 2 phân đoạn có độc tính, đó là các phân đoạn chứa các neurotoxin Như vậy tính chất neurotoxin không thay đổi và nọc thu sau 6 tháng nuôi bò cạp trong phòng thí nghiệm có thể sử dụng làm nguyên liệu dược

Nọc thu được có độc tính cấp trên theo đường tiêm tĩnh mạch là 12,4 mg/kg và đường tiêm dưới da là 190 mg/kg Khảo sát độc tính bán trường diễn của nọc bò cạp đường tiêm dưới da cho thấy nọc tiêm vào không làm thay đổi các chỉ số sinh hoá về chức năng gan, thận và sự tăng trưởng thể trọng bình thường của chuột thử nghiệm sau

30 ngày sử dụng Khảo sát tác dụng dược lý, nọc bò cạp cho thấy có tác dụng giảm đau trung ương nhưng không bằng morphin, tác dụng giảm đau ngoại biên tốt hơn aspirin liều 50 mg/kg và tác động kháng viêm tương đương tác động kháng viêm của ketoprofen liều 2,5 mg/kg Dựa trên những kết quả nghiên cứu, các tiêu chuẩn của nọc

bò cạp để dùng làm nguyên liệu dược đã được đề xuất

SUMMARY OF RESEARCH CONTENT

Scorpions Heterometrus sp found in Tay Ninh and An Giang provinces are determined as Heterometrus laoticus Couzijn 1981 Their venoms were collected by

electro-stimulation at frequency 2.63 kHz Venom was separated into ten fractions by column chromatography on Bio-Gel P10 Tests on mice showed six from these fractions were toxic The toxic fractions are neurotoxins and enzymes Neurotoxins were principal pharmacological actives in scorpion venom This scorpion venom was preserved under -200C in six months and then it was analysed by column chromatography with the above conditions This venom was separated into tent fractions, and four from these were toxic In comparing with the result getting six months ago we knew two enzyme fractions became no toxic This result showed the proterties of neurotoxins remain unchanged in preserving time The analysis of venom collected from scorpions breeding for six months in labotatory, showed from ten separated fractions only two are toxic and they are neurotoxic fractions The properties

of neurotoxins from breeding scorpions do not change so this venom can be using in pharmacology

The LD50 of scorpion venoms was 12,4 mg/kg B.W mouse (i.i) and 190 mg/kg B.W mouse (s.c.) There is no signs of subchronic toxicity after one month duration of subcutaneous administration Scorpion venomhas not only central and peripheral

analgesic effect in acetic acid induced writhing test and tail immersion test, but also anti-inflammatory effect in carrageenin incluced inflammation test at the dosages 9,5

or 19 mg/kg, s.c

On getting result proposed the standard of scorpion venom

BÁO CÁO NGHIỆM THU

1.Tên đề tài: Nghiên cứu nọc bò cạp Heterometrus sp với tác dụng kháng viêm,

giảm đau tạo nguồn nguyên liệu dược

Chủ nhiệm đề tài: TSKH Hoàng Ngọc Anh

Cơ quan chủ trì: Viện Khoa học Vật liệu ứng dụng, Viện KH&CNVN

Thời gian thực hiện đề tài: 2 năm (10/2007-10/2009)

Kinh phí được duyệt: 305 triệu đồng

2 Mục tiêu (theo đề cương đã duyệt):

Nghiên cứu thu nọc từ bò cạp đen Heterometrus sp của Việt Nam và khảo sát độc tính,

tác dụng kháng viêm, giảm đau của nọc bò cạp ứng dụng trong y dược

3 Nội dung (theo đề cương đã duyệt)

• Khảo sát các vùng có thể thu mua bò cạp; định danh tên bò cạp thu mua để lấy nọc

• Xây dựng quy trình và tiến hành thu gom nọc bò cạp bằng phương pháp xung điện

• Khảo sát tính chất và thành phần của nọc ở thời điểm thu mua bò cạp từ tự nhiên

• Khảo sát độ ổn định của nọc trong điều kiện bảo quản ở -200C

• Khảo sát độc tính cấp, bán trường diễn của nọc bò cạp

• Khảo sát tác dụng dược lý thực nghiệm của nọc bò cạp toàn phần lên chuột nhắt

• Khảo sát tinh chất và thành phần nọc bò cạp sau thời gian nuôi

• Khảo sát độc tính của các phân đoạn sắc ký lên chuột nhắt

• Xây dựng tiêu chuẩn nọc bò cạp đen làm nguyên liệu dược

Các thành viên tham gia thực hiện đề tài:

1 TSKH Hoàng Ngọc Anh

2 TS Trần Thanh Lương

3 KS Phạm Nguyên Đông Yên

4 CN Nguyễn Thị Thanh Thuỷ

5 ThS Nguyễn Thị Mai Hương

6 TS Võ Phùng Nguyên

Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng, Đại học Y Dược Tp Hồ Chí Minh

DANH SÁCH CÁC BẢNG

6 Lượng nọc thu được và độ ẩm của nọc trong thời gian nuôi 18

7 Kết quả đo mật độ quang của mẫu và chuẩn 19

8 Kết quả đo pH nọc bò cạp 20

9 Kết quả thử độc tính của các phân đoạn lên chuột 21

10 Thử độc tính các phân đoạn sắc ký tách ra từ nọc bò cạp 24

12 Tỉ lệ tử vong của chuột sau 24 giờ tiêm tĩnh mạch nọc bò cạp 27

13 Bảng tính kết quả theo phương pháp Karber-Behrens sau 24 giờ

15 Bảng tính kết quả LD50 theo phương pháp Karber-Behrens sau

24 giờ tiêm dưới da nọc bò cạp An Giang

28

20 Nồng độ BUN và Creatinin huyết thanh của chuột lô chứng và lô

thử sau 30 ngày thử nghiệm

32

22 Thể trọng trung bình của chuột ở 2 lô trong 30 ngày thử nghiệm 35

23 Thời gian có phản ứng giật mạnh đuôi ở các lô vào các thời điểm 36

24 Số lần đau quặn trung bình của chuột ở các lô vào các thời điểm 37

26 Kết quả đo mật độ quang của mẫu và chuẩn 39

27 Kết quả đo pH nọc bò cạp 40

28 Khảo sát độc tính của các phân đoạn tách ra từ nọc bò cạp H

laoticus thu sau 6 tháng nuôi trong phòng thí nghiệm

42

29 Kết quả thử độc tính trên chuột của các phân đoạn nọc thu lúc

mới nuôi bò cạp

45

30 Kết quả thử độc tính trên chuột của các phân đoạn nọc thu lúc

mới nuôi bò cạp sau 6 tháng bảo quản ở -200C

46

31 Kết quả thử độc tính trên chuột của các phân đoạn nọc thu sau

khi nuôi bò cạp 6 tháng trong phòng thí nghiệm

47

5 Kết quả điện di các phân đoạn tách ra từ nọc bò cạp qua cột 23

6 Phân tách nọc bò cạp H laoticus trên cột với Bio-Gel P 10 24

7 Kết quả điện di các phân đoạn tách ra từ nọc bò cạp qua cột 25

11 Nồng độ SGOT, SGPT của lô chứng và lô thử 32

12 Nồng độ Bilirubin (toàn phần, trực tiếp, gián tiếp) lô chứng và lô

thử

32

13 Giá trị BUN và Creatinin huyết thanh chuột lô thử và lô chứng 33

14a Mô gan có cấu trúc bình thường 34

15 Sự thay đổi thể trọng chuột ở 2 lô theo thời gian thử nghiệm 35

16 Tiềm thời giật mạnh đuôi của các lô vào các thời điểm 36

17 Số lần đau quặn trung bình của các lô vào các thời điểm 37

18 Phần trăm độ sưng phù chân chuột sau 3 giờ tiêm carrageenin

(ngày 0) và 30 phút sau tiêm thuốc mỗi ngày (trong 6 ngày)

38

21 Kết quả điện di một số phân đoạn tách ra từ nọc bò cạp qua cột 43

MỤC LỤC

Trang

CHƯƠNG II: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 4

2.1.1 Khảo sát vùng và thời gian thu mua bò cạp, xác định tên 4

2.3 KHẢO SÁT TÍNH CHẤT HOÁ LÝ VÀ THÀNH PHẦN NỌC

BÒ CẠP 5 2.4 KHẢO SÁT ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA NỌC TRONG ĐIỀU KIỆN BẢO

2.5.4 Phương tiện nghiên cứu độc tính bán trường diễn 7

2.5.5 Phương pháp thực nghiệm xác định độc tính bán trường diễn 7

2.5.6 Phân tích thống kê xác định độc tính bán trường diễn 8

2.6 KHẢO SÁT TÁC DỤNG GIẢM ĐAU, KHÁNG VIÊM CỦA NỌC

2.6.1 Phương tiện nghiên cứu 8

2.6.2 Phương pháp thực nghiệm tác dụng giảm đau trung ương 8

2.7 KHẢO SÁT TÍNH CHẤT HOÁ LÝ VÀ THÀNH PHẦN NỌC

SAU THỜI GIAN NUÔI 9

2.8 KHẢO SÁT ĐỘC TÍNH CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN SẮC KÝ

LÊN CHUỘT NHẮT 10

2.9 TIÊU CHUẨN NỌC

3.1.2 Nuôi bò cạp 12

3.2 XÂY DỰNG QUY TRÌNH THU NỌC 14

3.3 KHẢO SÁT TÍNH CHẤT HOÁ LÝ VÀ THÀNH PHẦN

NỌC BÒ CẠP 18 3.3.1 Tính chất hoá lý của nọc bò cạp 18

3.3.3 Thành phần protein của nọc 20

3.4 KHẢO SÁT ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA NỌC TRONG ĐIỀU KIỆN

3.4.2 Thành phần protein của nọc 24

3.5.1.4 Liều LD50 đường tiêm dưới da 28

3.5.2 Độc tính bán trường diễn của nọc bò cạp đường tiêm dưới da 29

3.5.2.3 Giải phẫu bệnh gan thận 34

3.5.2.4 Sự thay đổi về thể trọng chuột 36

3.6 KHẢO SÁT TÁC DỤNG GIẢM ĐAU, KHÁNG VIÊM

CỦA NỌC BÒ CẠP 38 3.6.1 Tác dụng giảm đau trung ương 38

3.7 KHẢO SÁT TÍNH CHẤT HOÁ LÝ VÀ THÀNH PHẦN

NỌC THU SAU THỜI GIAN NUÔI BÒ CẠP TRONG

PHÒNG THÍ NGHIỆM 41

3.7.2 Thành phần protein của nọc 43

3.8 KHẢO SÁT ĐỘC TÍNH CÁC PHÂN ĐOẠN SẮC KÝ

LÊN CHUỘT NHẮT 46

3.9 TIÊU CHUẨN NỌC 48

3.9.1 Xác định độ giảm khối lượng (độ ẩm) của nọc bò cạp khô 48

3.9.2 Xác định hàm lượng protein và pH của nọc bò cạp 48

3.9.3 Phân tích thành phần protein của nọc bò cạp 49

3.9.4 Khảo sát độc tính của các phân đoạn tách ra 49

3.9.5 Phân tích các phân đoạn có độc tính 49

3.9.6 Kết luận về tiêu chuẩn nọc bò cạp 49

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

I TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU NGOÀI NƯỚC

Bò cạp là một trong những động vật cổ nhất trên trái đất với hơn 450 triệu năm tiến hoá, chúng gồm khoảng 1500 loài khác nhau [18] Chúng thuộc lớp Arachnida, bộ Scorpionida Bò cạp là động vật ăn thịt Thức ăn của chúng rất đa dạng từ các côn trùng như châu chấu, dế, kiến, rết, nhện, đến các động vật nhỏ như thằn lằn, rắn, chuột mới sinh, Những nghiên cứu đã công bố cho thấy châu chấu, dế là thức ăn đứng thứ hai sau thức ăn tổng hợp để nuôi bò cạp [34] Bò cạp hoạt động về đêm, ban ngày chúng ẩn nấp trong hang, dưới lá cây khô, nhiệt độ để phát triển bình thường của chúng là 25-280C, độ ẩm là khoảng 72-82% Từ khi mới sinh ra đến khi trưởng thành chúng trải qua 5 lần lột xác [19] Những bò cạp nguy hiểm đối với con người thuộc họ Buthidae, gồm khoảng 500 loài phân bố nhiều ở châu Phi, châu Mỹ và châu Á [1,8,9] Nọc bò cạp chứa nhiều chất có hoạt tính sinh học sử dụng vào việc săn mồi Trong số các thành phần của nọc bò cạp thì các polypeptide neurotoxin đóng vai trò đặc biệt quan trọng trong việc gây tê liệt cơ Các toxin này tác dụng trên các kênh ion của tế bào thần kinh bị kích thích và qua đó tác dụng lên hệ thần kinh trung ương, thần kinh thực vật, tim mạch và hô hấp [3,35] Phụ thuộc tác dụng của các toxin với các kênh ion, người ta chia chúng làm 4 loại, đó là các toxin tác dụng với các kênh ion : kênh

Na+, kênh K+, kênh Cl- và kênh Ca2+ Tất cả các toxin tác dụng với kênh Na+ được cấu tạo từ 60-76 gốc axit amin và cấu trúc của chúng được ổn định bởi bốn cầu disulfid [20,4] Trong khi đó các toxin tác dụng với các kênh K+ thường cấu tạo từ 31-39 gốc axit amin và cấu trúc của chúng được ổn định nhờ ba hoặc bốn cầu disulfid [26,27,36]

Có hai peptide khác nhau của nọc bò cạp tác dụng với kênh Ca2+, chúng thay đổi sự liên kết của ryanodine với kênh Ca2+ Một trong số peptide đó cấu tạo từ 33 gốc axit amine, toxin này tăng sự liên kết với ryanodine, còn toxin khác là heterodimer peptide cấu tạo từ 104 và 27 gốc axit amine, nó ức chế sự liên kết với ryanodine [37,38] Chlorotoxin tác dụng với kênh Cl- là peptide cấu tạo từ 36 gốc axit amine với bốn cầu disulfide [10,21]

Hơn 1000 năm nay, nọc bò cạp đã được sử dụng trong các bài thuốc gia truyền của người Trung Quốc để chữa một số bệnh thần kinh như động kinh, thần kinh tọa và có một số đã đăng ký phát minh sáng chế như thuốc điều trị thấp khớp từ nọc bò cạp, rượu

bò cạp chăm sóc sức khoẻ [5]

Các nghiên cứu gần đây cho thấy độc tố chlorotoxin tách từ nọc bò cạp vàng Leiurus

quinquestratus của Israel có khả năng gắn rất đặc hiệu với các tế bào ung thư não

[30,13,23] Điều này mở ra triển vọng sử dụng chúng như các chất đặc hiệu để đưa thuốc đặc trị đến các tế bào ung thư hoặc sử dụng chúng như các loại thuốc để tiêu diệt

tế bào ung thư

Nghiên cứu của nhóm Grez Kaczorovski tại công ty Merck đã xác định độc tố

margatoxin, tách chiết nọc bò cạp Centruroides margaritatus, có tác động rất đặc hiệu

lên kênh thần kinh ion Ca2+, tham gia vào quá trình hoạt hoá lymphocyte, làm ức chế hoạt hoá lymphocyte và quá trình tổng hợp ra interleukin-2 bởi T-lymphocyte người Công ty Merck đã đăng ký bản quyền sử dụng margatoxin như chất ức chế miễn dịch dùng để điều trị các bệnh tự miễn dịch hoặc dùng để ngăn cản sự đào thải trong quá trình cấy ghép cơ quan [14,24]

Chế phẩm “Escozul” – sản xuất từ nọc bò cạp Rhopalurus junceus được sử dụng ở

Cuba để điều trị các bệnh ung thư và Parkinson [31] Sự thay đổi cấu trúc bậc một của độc tố bò cạp có thể sử dụng để chế tạo ra những loại thuốc mới với những hoạt tính riêng Ví dụ nghiên cứu cấu trúc của charybdotoxin đã mở ra khả năng sản xuất ra những protein nhỏ nhưng ổn định có các hoạt tính mới có thể ứng dụng trong y-dược Ngoài ra nọc độc bò cạp còn có tính kháng khuẩn và kháng nấm, vì vậy cũng có thể dùng làm thuốc trị các bệnh do vi khuẩn và nấm gây nên Chính vì các dược tính quan trọng của nọc bò cạp hiện nay nhiều hãng dược phẩm lớn trên thế giới như Wyeth, Ayest, Genetech, rất quan tâm đến việc ứng dụng của chúng để sản xuất thuốc [2] Nọc bò cạp đã được chứng minh có tác dụng giảm đau [6] kháng viêm [28,39], chống

co giật, động kinh [29,7] Những năm gần đây đã có những nghiên cứu nọc bò cạp loài Heterometrus để ứng dụng trong y dược [22,33]

II NHỮNG NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC

Trong y học cổ truyền của Việt Nam, bò cạp được sử dụng là một trong các vị thuốc để điều trị bệnh động kinh [11] Ngoài ra trong dân gian, bò cạp được sử dụng rộng rãi làm nguồn dược liệu trong đó có tác dụng giảm đau hiệu quả, nhưng còn hạn chế trong việc nghiên cứu để sử dụng chúng làm nguồn dược liệu

Nghiên cứu nọc bò cạp nâu (Lychas mucronatus họ Buthudae) của chúng tôi đã cho

thấy trong nọc này có hai nhóm toxin với khối lượng phân tử 3500 – 5000 Da và 6000 – 8000 Da [15] Từ nọc bò cạp này chúng tôi đã tách ra và khảo sát tính chất bảy toxin ngắn (Mr = 3500 – 5000 Da), những toxin này có tác dụng ức chế dây thần kinh bị kích

thích Ngoài bò cạp nâu, ở Việt Nam còn có một số loài bò cạp đen Heterometrus như

H.spinifer, H.petersii, H.laoticus, H.cyaneus, H sp [19] Những bò cạp này thường

được gọi là bò cạp rừng vì chúng thường gặp trong rừng nhiệt đới Trong những năm gần đây việc phá rừng tràn lan nên bò cạp nâu rất ít, bò cạp đen còn rất nhiều và có thể nghiên cứu sử dụng chúng trong y dược Trước tình hình đó, chúng tôi đã thực hiện đề

tài: “Nghiên cứu nọc bò cạp Heterometrus sp với tác dụng kháng viêm, giảm đau tạo

nguồn nguyên liệu dược” Dưới đây chúng tôi xin báo cáo việc thưc hiện đề tài này

CHƯƠNG II: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nội dung 1: Thu mua bò cạp, nuôi và xác định loài

2.1.1 Khảo sát vùng và thời gian thu mua bò cạp, xác định tên

Việc khảo sát khả năng thu mua bò cạp đã được tiến hành tại các vùng Bình Phước, Tây Ninh và An Giang Việc thu mua bò cạp được tiến hành vào mùa mưa từ tháng 5 đến tháng 11 Bò cạp sống được đem ngâm cồn 96 và gửi sang Bảo tàng quốc gia về lịch sử tự nhiên ở Paris cho TSKH Lourenςo chuyên gia về phân loại bò cạp để xác định tên

2.1.2 Nghiên cứu nuôi bò cạp trong phòng thí nghiệm

Thử nghiệm nuôi bò cạp trong các chậu nhựa và thu được các điều kiện nuôi phù hợp như sau:

Bò cạp được nuôi trong các chậu nhựa đường kính 70 cm, cao 25 cm Mỗi chậu thường nuôi 60-70 con bò cạp Trong mỗi chậu có đặt một mẫu bọt xốp (kích thước 10cm x 20cm x 4cm) chứa nước để bò cạp uống, lượng nước tẩm vào bọt xốp khoảng 25ml Chậu được phủ cỏ và lá khô lên trên để tạo sinh thái Miệng chậu được bọc kín bằng 1 lớp lưới để ngăn chặn bò cạp và các con mồi làm thức ăn cho bò cạp di chuyển ra ngoài môi trường

Việc cho bò cạp ăn được tiến hành 1 tuần 1 lần Thức ăn cho bò cạp là châu chấu hoặc

dế Trước mỗi lần cho bò cạp ăn thì dọn dẹp vệ sinh thau nuôi Nhiệt độ nuôi bò cạp là nhiệt độ phòng khoảng 240C đến 320C, độ ẩm để nuôi bò cạp theo độ ẩm của môi trường là từ 78% đến 82%

2.2 Nội dung 2: Xây dựng quy trình thu nọc bò cạp

Sử dụng máy tạo xung điện hình kim có tần số nằm trong vùng từ 2,15 kHz đến 4 kHz

để khảo sát điều kiện tối ưu cho việc lấy nọc có nghĩa là thu được lượng nọc nhiều và

bò cạp không chết Bò cạp dùng để lấy nọc là bò cạp trưởng thành kích thước từ 12-14

cm Sau khi xác định được tần số tối ưu để thu nọc, điểm đạt tối ưu đó được đánh dấu trên máy lấy nọc, và tần số đó là tần số làm việc trong quá trình lấy nọc

Bò cạp được giữ chặt ở vị trí đầu và đuôi rồi kích thích xung điện với tần số đã chọn vào đốt cuối cùng hoặc cận cuối trên đuôi bò cạp (xem hình 1) Nọc tiết ra từ đuôi bò

cạp được thu giữ trên các lam kính, đem làm khô trong bình hút ẩm có chứa CaCl2 khan Nọc khô gom lại trong 1 lọ thủy tinh nhỏ và bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ -

20 oC cho đến khi dùng

2.3 Nội dung 3: Khảo sát tính chất hoá lý và thành phần nọc bò cạp

Máy so màu quang điện hiệu Thermo (Anh) được sử dụng để xác định hàm lượng protein trong nọc bằng phương pháp so màu Biure

Máy đo pH hiệu Meter (Thuỵ Sỹ) Hoá chất dùng cho phân tích là của hãng Merk

Máy sắc ký FPLC của hãng Bio-Rad (Mỹ) được dùng để tách các phân đoạn bằng phương pháp lọc qua gel trên cột với Bio-Gel P 10 (1,5 x 100 cm) ở nhiệt độ phòng Cột đã được cân bằng trong đệm ammonium axetat 20 mM (pH 4,7), lượng nọc thô mỗi lần dùng chạy cột 80-200 mg, tốc độ rửa cột 0,16 ml/phút, thể tích mỗi ống thu 4

ml Sự có mặt của protein trong các phân đoạn sắc ký được xác định theo mật độ quang tại bước sóng 280 nm Độc tính của các phân đoạn tách ra được thử lên chuột trắng ddY ở cả hai giới (18-20 g) bằng cách tiêm tĩnh mạch đuôi Tác dụng của các phân đoạn lên chuột được quan sát trong 24 giờ Lượng protein mỗi lần tiêm cho mỗi chuột

là 0,2 mg

Điện di được tiến hành trên gel polyacrylamit 14% theo Laemmli trên máy Colparmer

2.4 Nội dung 4: Khảo sát độ ổn định của nọc trong điều kiện bảo quản ở -20 0 C

Bảo quản nọc ở -20 0C trong thời gian 6 tháng sau đó chạy sắc ký, điện di và so sánh với kết quả chạy sắc ký lúc mới thu nọc Điều kiện thử nghiệm như đã trình bày ở phần 2.3

2.5 Nội dung 5 Xác định độc tính cấp, bán trường diễn của nọc bò cạp

2.5.1 Phương tiện nghiên cứu độc tính cấp

- Nọc bò cạp thu được từ bò cạp đen thu mua ở An Giang bằng phương pháp kích thích điện Nọc bò cạp được hòa trong nước cất pha tiêm thành dung dịch để thử độc tính cấp theo đường tiêm dưới da

- Chuột nhắt trắng (Mus musculus albinos) khỏe mạnh, giống ddY, cả hai phái đực và

cái, được cung cấp bởi Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh Chuột mua về được nuôi

ổn định ít nhất trong 2 ngày trong phòng thí nghiệm trước khi tiến hành nghiên cứu

Các chuột có thể trọng 20±2gam được đưa vào thử nghiệm Các thử nghiệm được bắt đầu từ 8 giờ sáng mỗi ngày

2.5.2 Phương pháp thực nghiệm xác định độc tính cấp

a) Nghiên cứu sơ khởi: Khởi đầu từ liều cao nhất có thể qua được kim cho uống Xác định liều LD0 là liều tối đa không gây chết chuột nào và liều LD100 là liều thấp nhất gây chết 100% chuột

b) Nghiên cứu xác định: Chuột nhắt trắng đạt tiêu chuẩn nghiên cứu được chia làm 06

lô, mỗi lô ít nhất 6 con, cho sử dụng thuốc ở các liều trong khoảng LD0 và LD100, chia theo cấp số Ở những liều gần LD50 tăng số lượng chuột lên để sự đo lường được chính xác hơn Quan sát chuột trong 24 giờ sau khi dùng thuốc, ghi nhận các phản ứng xảy ra trên chuột và số lượng chuột sống, chết ở mỗi lô Theo dõi chuột còn sống sau 14 ngày

kể từ ngày dùng thuốc Giải phẫu đại thể chuột còn sống và chuột chết sau khi cho uống LD50 được tính theo phương pháp Miller – Tainter và Karber – Behrens

2.5.3 Phân tích thống kê xác định độc tính cấp

Phương pháp Miller – Tainter

Vẽ đường biểu diễn tỉ lệ % chuột chết theo liều trên giấy logarit Đọc kết quả LD50 = m trên trục hoành và sau đó xác định sai số chuẩn E Từ đồ thị, ta suy ra m; probit 6,0 (84% chết); probit 4,0 (16% chết) Liều LD50 được tính theo công thức sau:

LD50 = m ± E với

' 2

2

N

S

E=

2S: sự gia tăng liều cần thiết để gia tăng kết quả lên thêm 2 probit

N’: Tổng số thú vật dùng ở các liều tương ứng với các phân suất tử vong ở trong khoảng probit từ 4 đến 6

Phương pháp Karber-Behrens

Công thức của Karber-Behrens:

n

ab D

LD = f − ∑

50

Df: liều tối thiểu làm chết tất cả thú vật

a: chỉ số trung bình của số thú vật chết ở hai liều kế tiếp

b: hiệu số giữa hai liều kế tiếp

n: số thú vật dùng ở mỗi liều hoặc số trung bình của những trị số trên

2.5.4 Phương tiện nghiên cứu độc tính bán trường diễn

Chuột nhắt trắng giống ddY ở cả hai giới, trọng lượng từ 18 – 26 gam được cung cấp bởi viện Pasteur TP.HCM Chuột được nuôi ổn định 2 ngày trước khi tiến hành thử nghiệm

Trong suốt quá trình thử nghiệm, chuột được cung cấp đầy đủ thức ăn, nước uống Các thử nghiệm được thực hiện từ 8 – 15 giờ mỗi ngày

Nọc bò cạp: nọc đông khô có màu trắng đục, bảo quản ở -20 ºC, được đem ra ngoài và cho rã đông trong 30 phút ở nhiệt độ thường Nọc được pha thành dung dịch thử nghiệm trong dung dịch nước muối sinh lý

2.5.5 Phương pháp thực nghiệm xác định độc tính bán trường diễn

Thăm dò độc tính bán trường diễn bằng cách theo dõi các chỉ số huyết học, sinh hóa,

sự thay đổi vi-đại thể của một số phủ tạng của các chuột lô chứng và lô thử sau khi cho dùng một liều nhất định thuốc trong một thời gian dài (2 tháng)

Các chuột nhắt trắng đủ điều kiện thí nghiệm được chia ngẫu nhiên thành 2 lô:

- Lô chứng: 20 con

- Lô thử: 30 con

Các chuột được tiêm dưới da dung dịch sinh lý (lô chứng), và dung dịch nọc bò cạp 9,5 mg/kg (lô thử) với lượng 0,1 ml/ 10 g thể trọng/ ngày Liều chất thử là liều trong khoảng 1/20 – 1/10 liều LD50 đường tiêm dưới da của chuột và thể hiện có tác động trong các thử nghiệm dược lý

Chuột ở 2 lô được đánh giá và so sánh dựa vào các chỉ số: sự thay đổi thể trọng, chỉ số sinh hóa, chỉ số huyết học, các xét nghiệm đại thể và vi thể gan, thận

Chuột được gây mê bằng đá CO2 khô và mổ để lấy máu trực tiếp từ tim và xét nghiệm huyết học và sinh học vào ngày thứ 31 tại Phòng sinh hóa và huyết học bệnh viện Chợ Rẫy Các mẫu gan, thận được bảo quản trong dung dịch formol 10% pha trong đệm phosphat và gửi Bộ Môn Giải Phẫu Bệnh – Khoa Y – Đại học Y Dược TP.HCM xét nghiệm và đọc kết quả vi thể

2.5.6 Phân tích thống kê xác định độc tính bán trường diễn

Các số liệu được trình bày dưới dạng Số trung bình (MEAN) ± Sai số chuẩn của số trung bình (SEM) Sự khác biệt giữa các lô được xác định bằng phép kiểm Kruskal – Wallis, test Mann-Whitney U, Chi-squared test & Fisher's Exact Test với phần mềm thống kê Minitab 14.0

2.6 Nội dung 6 Khảo sát tác dụng giảm đau, kháng viêm của nọc bò cạp

2.6.1 Phương tiện nghiên cứu

- Nọc bò cạp thu được từ bò cạp đen thu mua ở An Giang bằng phương pháp kích thích điện Nọc bò cạp được hòa trong nước cất pha tiêm thành dung dịch để thử tác động dược lý

- Chuột nhắt trắng (Mus musculus albinos) khỏe mạnh, giống ddY, cả hai phái đực và

cái, được cung cấp bởi Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh Chuột mua về được nuôi

ổn định ít nhất trong 2 ngày trong phòng thí nghiệm trước khi tiến hành nghiên cứu Các chuột có thể trọng 20±2gam được đưa vào thử nghiệm Các thử nghiệm được thực hiện trong khoảng thời gian từ 8– 15 mỗi ngày

2.6.2 Phương pháp thực nghiệm tác dụng giảm đau trung ương

Mô hình giảm đau trung ương theo phương pháp nhúng đuôi chuột [16]

Chuột được cố định trong lồng với đuôi được đưa ra ngoài tự do Nhúng đuôi chuột ngập không quá 5 cm trong một bình nước ổn định ở nhiệt độ 50±0,5 0C Ghi nhận thời gian từ lúc nhúng đuôi chuột vào nước nóng đến lúc chuột giật mạnh đuôi ra khỏi nước Tiến hành tại các thời điểm 30, 60, 90, 120 phút sau khi chuột dùng thuốc Nếu chuột không giật mạnh đuôi sau 10 giây thì nhấc chuột ra để tránh gây bỏng cho đuôi chuột So sánh tiềm thời giật mạnh đuôi của chuột giữa các lô với nhau

2.6.3 Phương pháp thực nghiệm giảm đau ngoại biên

Mô hình giảm đau ngoại biên theo phương pháp gây đau quặn bằng acid acetic [12,17,32]

Sau khi cho chuột uống thuốc nghiên cứu 30 phút, tiêm phúc mô lần lượt từng chuột với 10 mL/Kg acid acetic 0,7% Số lần đau quặn của chuột được quan sát và ghi nhận trong 5 phút ở các thời điểm 5, 20 và 35 phút sau khi tiêm acid acetic Chuột được cho

là đau quặn khi đau quặn bụng và duỗi ít nhất một chân sau So sánh số lần đau quặn của chuột giữa các lô tại các thời điểm với nhau

độ phù chân chuột bằng Plethymometer model 7140, hãng Ugo Basile

Gây viêm bằng cách tiêm vào gan bàn chân chuột 0,025 mL dung dịch carrageenin 1% pha trong dung dịch sinh lý Đo thể tích chân chuột 3 giờ sau khi gây tiêm Các chuột

có thể tích chân sưng phù trên 50% so với bình thường được lựa chọn cho nghiên cứu

và chia ngẫu nhiên thành các lô và lần lượt tiêm dưới da các dung dịch: Lô chứng: dung dịch sinh lý 0,09%; Lô đối chứng: dung dịch ketoprofen (Profenid®), 5 mg/Kg/ benzyl alcohol 2,5 %; Lô trắng: dung dịch benzyl alcohol 2,5 %; Lô thử thuốc dung dịch nọc bò cạp ở hai liều khác nhau 19 mg/kg và 9,5 mg/kg được tiêm dưới da

Theo dõi thể tích sưng phù của chân chuột sau 3 giờ gây viêm và sau khi tiêm thuốc 30 phút mỗi ngày vào một giờ nhất định trong 6 ngày liên tiếp Độ tăng thể tích chân của từng chuột còn gọi là độ sưng phù, được tính theo công thức:

=

∆

V0: Thể tích chân chuột trước khi gây viêm (đo 1/100 mL)

Vt : Thể tích chân chuột sau khi gây viêm (đo 1/100 mL)

2.6.5 Phân tích thống kê

Dữ liệu được trình bày ở dạng Mean ± SEM Sự khác biệt giữa các nhóm được phân tích bằng phương pháp Kruskal– Wallis sau đó là Mann-Whitney-U test với phần mềm Minitab 14.0 P < 0,05 được cho là có ý nghĩa thống kê

2.7 Nội dung 7: Khảo sát tính chất hóa lý và thành phần nọc sau thời gian nuôi

Nọc được thu sau 6 tháng nuôi bò cạp trong phòng thí nghiệm Điều kiện nuôi và thu nọc đã thực hiện như trong phần 2.2 trên đây Phân tích nọc bằng phương sắc ký lọc

gel, điện di và so sánh kết quả thu được với kết quả phân tích nọc lúc mới nuôi bò cạp Điều kiện chạy sắc ký, điện di và thử độc tính giống như đã làm ở phần 2.3 trên đây

2.8 Nội dung 8: Khảo sát độc tính các phân đoạn sắc ký lên chuột nhắt

Các phân đoạn sắc ký đem đông khô sau đó được thử độc tính Để thử độc tính dùng 0,2 mg nọc khô mỗi phân đoạn đem hòa tan trong 0,2 ml nước cất và tiêm vào tĩnh mạch đuôi của chuột nhắt sau đó quan sát biểu hiện của chuột trong 24 giờ Mỗi phân đoạn tiêm lên 5 chuột

2.9 Nội dung 9: Tiêu chuẩn nọc

Để đề xuất tiêu chuẩn của nọc bò cạp thì độ ẩm của nọc được xác định bằng phương pháp ghi trong phụ lục 5.16 của Dược điển Việt nam Hàm lượng protein trong nọc được xác định bằng phương pháp so màu Biure (như trình bày trong mục 2.3) pH của nọc được xác định trên máy đo pH hiệu Meter (như trong phần 2.3) Nọc được phân tích bằng phương pháp sắc ký trên cột Bio-Gel P10 (như trình bày trong phần 2.3) Thành phần protein của các phân đoạn độc được xác định bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide như trong phần 2.3)

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Nội dung 1: Thu mua bò cạp, nuôi và xác định loài

3.1.1 Thu mua bò cạp và xác định loài

Qua khảo sát khả năng thu mua bò cạp tại các vùng: Bình Phươc, Tây Ninh và An Giang chúng tôi nhận thấy:

1) Tại vùng Bình Phước có chủ yếu là loại bò cạp nâu (Lychas mucronatus)

Những năm 2004 trở về trước thì loại bò cạp nâu rất nhiều ở vùng này, có mùa chúng tôi đã thu bắt được gần 5.000 con để nghiên cứu Những năm gần đây do sự phá rừng nên loài bò cạp nâu còn rất ít Việc thu mua bò cạp nâu làm nguyên liệu nghiên cứu không thể thực hiện được Vì vậy, chúng tôi tìm kiếm nguồn nguyên

liệu bò cạp khác đó là bò cạp đen Heterometrus sp

2) Qua khảo sát lượng bò cạp đen Heterometrus sp tại hai vùng Tây Ninh và An

Giang cho thấy lượng bò cạp phong phú, có thể thu mua dễ dàng, một tuần có thể mua được 400-500 con 6000 bò cạp đã được tiến hành thu mua 2 đợt vào năm

2007 và 2008, mỗi đợt 3000 con trong khoảng thời gian từ tháng 5 đến tháng 11 3) Định danh bò cạp: mẫu bò cạp đen thu tại Tây Ninh và An Giang đã được ngâm trong cồn etylic 96% và gửi cho TSKH Lourenςo, chuyên gia về bò cạp công tác tại Viện Bảo tàng Quốc gia của Lịch sử Tự nhiên tại Pari - Pháp để xác định tên khoa học Theo tài liệu và mẫu chúng tôi gửi, ông Lourenςo đã xác định hai loại bò cạp đen thu mua tại Tây Ninh và An Giang đều thuộc loài

Heterometrus laoticus Couzijn 1981 theo những nguyên nhân sau:

- Ở Miền Nam Việt Nam có ba loài bò cạp Heterometrus đã được xác định là: H

spinifer, H laoticus và H petersii Loài bò cạp H spinier rất hiếm ở Việt Nam

nên có thể loại trong danh sách xem xét Hai loài bò cạp H laoticus, H petersii

phổ biến nhiều ở Miền Nam Việt Nam và chúng có thể phân biệt nhanh, sơ bộ

bằng đặc điểm là bò cạp H laoticus có lớp giáp nhẵn còn lớp giáp của H petersii

không nhẵn, có những hạt nổi bên trên Ngoài ra, ông.Lourenςo đã xác định cả hai

loại bò cạp đen ở Tây Ninh và An Giang đều là loại H laoticus Tuy bò cạp ở hai

vùng cùng một loài nhưng chúng tôi thu mua, nuôi và lấy nọc riêng từng vùng (Phụ lục 1)

Bò cạp An Giang đựơc mua về và nuôi trong chậu nhựa có phủ cỏ hoặc lá khô, khoảng 60-70 con bò cạp được nuôi trong một chậu nhựa, cho thức ăn 2 lần/ tuần, thường xuyên tưới nước làm ẩm và để bò cạp uống, vệ sinh chậu 2 lần/ tuần Quan sát lượng thức ăn không bị dư, bò cạp không ăn thịt lẫn nhau là lượng thức ăn đủ Khảo sát việc nuôi 3000 con bò cạp trong sáu tháng chúng tôi ghi nhận được các

số liệu trình bày trong bảng sau:

Bảng 1 Kết quả nuôi bò cạp trong 6 tháng

Thời gian nuôi Số lượng bò cạp còn sống (con)

chiếm (%)

Trọng lượng trung bình của mỗi con bò cạp (g)

Qua kết quả trên , chúng tôi nhận thấy:

- Khi mới mua về bò cạp tử vong rất nhiều, có đợt tỉ lệ tử vong của bò cạp lên đến 50% do vận chuyển từ An Giang về phòng thí nghiệm tại TP.HCM và do thay đổi môi trường sống từ tự nhiên sang điều kiện phòng thí nghiệm Chúng tôi đã thay đổi nhiều cách khác nhau để làm giảm tỉ lệ tử vong của bò cạp trong quá trình thu mua và vận chuyển Phương pháp tốt để vận chuyển bò cạp, hạn chế tỉ lệ tử vong khoảng dưới 5% là chuyên chở bò cạp khoảng 100 bò cạp trong mỗi thùng giấy kích thước 20 x 40 x 60 cm, có thông hơi bằng cách xuyên các lỗ nhỏ 0,5 cm đường kính, bên trong có cho một ít lá cây và quan trọng nhất là có cho lưới mắc làm tăng diện tích bề mặt cho bò cạp bám, bò cạp không bị chèn ép, đè nhau gây

tử vong

Với điều kiện nuôi và chăm sóc như đã đề cập ở trên, chúng tôi nhận thấy:

- Trong 15 ngày nuôi đầu tiên, khoảng 28% bò cạp tử vong và trong một tháng nuôi bò cạp còn sống đạt tỉ lệ 62%

- Sau 2 tháng nuôi, mặc dù có đủ nước và thức ăn, bò cạp vẫn chết rải rác và bò cạp sống đạt tỉ lệ 58,57% (có thể do điều kiện phòng nuôi chưa phù hợp như không có đủ ánh sáng,…)

- Từ tháng thứ 3, bò cạp không còn tử vong, đã ổn định, và phát triển tốt Như vậy, sau 02 tháng nuôi, bò cạp đã thích nghi được với môi trường và chế độ nuôi của phòng thí nghiệm

- Trong khoảng thời gian nuôi từ tháng 4 đến tháng 7, bò cạp đẻ con, mỗi lần từ 17 đến 25 con, bò cạp con bám trên lưng mẹ, sau 2 tuần thì lột xác rồi rời khỏi lưng

mẹ Chúng tôi quan sát thấy bò cạp con phát triển tốt, lớn lên dần và trở thành mục tiêu tấn công làm thức ăn của những con trưởng thành khác

- Trung bình 1 con bò cạp ăn 2,3 g thức ăn /1 lần

- Trọng lượng trung bình ban đầu của bò cạp thu mua là 10,89 g ± 2

Sau 01 tháng nuôi, trọng lượng trung bình của bò cạp là 11,54 g ± 1,5, tăng trung bình 0,65 g/con/tháng

Sau 02 tháng nuôi, trọng lượng trung bình của bò cạp là 13,03 g ± 1,5 tăng trung bình 1,49 g/con/tháng

Sau 3 tháng, trọng lượng trung bình là 15,06 g ± 1, tăng trung bình 2,03 g/ 1 con/ 1 tháng

Bò cạp sau 03 tháng nuôi đã ở giai đoạn phát triển ổn định với các điều kiện của phòng thí nghiệm nên trọng lượng trung bình không tăng nhiều như những tháng đầu tiên sau khi nuôi bắt Sau 6 tháng, trọng lượng trung bình là 15,7 g ±1, tăng trung bình 0,64 g/ 1 con Như vậy, từ lúc thu mua và tiến hành nuôi 6 tháng trong phòng thí nghiệm, bò cạp đã tăng trọng lượng trung bình là 4,81 g/ 1 con

Việc quan sát này chỉ để xác định có thể nuôi bò cạp trong phòng thí nghiệm nhằm thu nọc phục vụ nghiên cứu Chúng tôi chỉ nuôi và theo dõi trong 6 tháng, sau đó loại bỏ vì bò cạp không còn cho nọc hiệu quả

Qua 6 tháng nuôi bò cạp ở phòng thí nghiệm, chúng tôi thấy đây chỉ là điều kiện nuôi bò cạp để lấy nọc phục vụ nghiên cứu, chứ chưa phải là điều kiện tốt nhất để

bò cạp phát triển Nếu nuôi để thuần hóa bò cạp, phải nghiên cứu kỹ hơn, cần nhiều thời gian hơn nữa

3.2 Nội dung 2: Xây dựng quy trình thu nọc

Qua tham khảo tài liệu và kinh nghiệm lấy nọc các loại côn trùng, chúng tôi đã thiết kế máy lấy nọc bò cạp theo phương pháp xung điện, có tần số nằm trong vùng từ 2,15 đến 4 kHz

Để xác định tần số tối ưu cho việc thu nọc, chúng tôi đã tiến hành một loạt thí nghiệm, mỗi lần thí nghiệm sử dụng 30 con bò cạp trưởng thành Để khảo sát sử dụng các xung điện có tần số tăng dần trong khoảng từ 2,15 kHz đến 4 kHz Đó là các tần số sau 2,15 kHz; 2,55 kHz; 2,95 kHz; 3,35 kHz; 3,75 kHz và 4 kHz

Khi chích xung điện vào bò cạp để lấy nọc, nếu tần số xung mạnh (4 kHz, xem bảng 2), thì bò cạp cho nọc nhưng không hồi phục (càng, chân duỗi thẳng, chết ngay hay có thể chết sau đó vài giờ) Nếu tần số xung vừa đủ thì bò cạp cho nọc và sau đó hồi phục (hoạt động bình thường sau 2 giờ) Nếu xung quá yếu thì bò cạp không cho nọc

Chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm để chọn được điểm làm việc tối ưu theo tiêu chí

là số con cho nọc và số con hồi phục sau hai giờ là cao nhất

Kết quả khảo sát được trình bày ở các bảng dưới đây Mỗi thí nghiệm tiến hành trên 30 con và sự phục hồi được quan sát sau 2 giờ

Bảng 2 Tác dụng tần số của xung điện vào việc thu nọc

TT Tần số xung

làm việc

Số con cho nọc

Số con phục hồi

Số con không phục hồi

Bảng 3 Tác dụng của tần số xung điện đến việc thu nọc

TT Tần số xung

làm việc

Số con cho nọc

Số con phục hồi

Số con không phục hồi

Bảng 4 Tác dụng của tần số xung điện đến việc thu nọc

TT Tần số xung

làm việc

Số con cho nọc

Số con phục hồi

Số con không phục hồi

Qua việc chọn điều kiện thu nọc bằng phương pháp xung điện, chúng tôi nhận thấy với bò cạp trưởng thành kích thước 12-14 cm thì xung điện tối ưu để lượng nọc thu được nhiều nhất và bò cạp không bị chết là 2,63 kHz Thời gian sử dụng xung điện để thu nọc là khoảng 10 giây

Sau khi xác định được điều kiện thu nọc bằng phương pháp xung điện chúng tôi

đã tiến hành thu nọc như sau: bò cạp mua về để ổn định 1 ngày thì lấy nọc (xem hình 1), lần lấy nọc sau cách lần trước 2 tuần Nọc thu được trên lam kính, nọc có màu trắng trong hoặc trắng đục, và được làm khô trong bình hút ẩm trên CaCl2 khan trong khoảng 4 giờ Điều kiện làm ẩm bao gồm bình hút ẩm có kích

thước đường kính 30 cm, lượng CaCl2 được cho vào bình là 200g Nọc khô được cạo ra và bảo quản trong lọ kín ở điều kiện -200C cho đến khi sử dụng

Hình 2 Thu nọc bò cạp Bảng 5 Kết quả thu nọc sau thời gian nuôi

Thời gian lấy nọc (tháng) Lần đầu 0,5 1 2 3 4 5 6

Tỉ lệ bò cạp cho nọc (%) 64,7 77 73 77 77,5 62,5 51,3 32,3 Lượng nọc khô trung bình

(mg/con)

1,77 1,4 1,37 1,36 1,30 1,00 0,96 0,56

Sau 6 tháng nuôi và lấy nọc bò cạp, chúng tôi có nhận xét sau:

- Lượng nọc các lần lấy sau giảm so với lần lấy đầu tiên

- Sau 3 tháng nuôi và lấy nọc (lấy nọc lần thứ 7) tại các đốt lấy nọc của bò cạp bị tạo sẹo nên không còn nhạy cảm tốt với que kích thích lấy nọc nữa nên lượng nọc thu được giảm và số con cho nọc cũng giảm một cách đáng kể

- Sau 6 tháng nuôi, bò cạp cho nọc kém, chỉ còn 0,56 mg/con (so với lúc đầu 1,77 mg/con) Với điều kiện lấy nọc như vậy thì từ một con bò cạp trung bình một lần chúng tôi thu được 1,22 mg nọc

Như vậy bò cạp cho nọc hiệu quả nhất trong 3 tháng nuôi trong phòng thí nghiệm, sau đó các điểm tiếp xúc để thu nọc trên đuôi bò cạp bị tạo sẹo nên việc cho nọc hạn chế Vì vậy, chúng tôi đề nghị một đợt nuôi bò cạp trong phòng thí nghiệm để thu nọc chỉ nên khoảng 3 tháng, sau đó thả chúng về môi trường thiên nhiên

3.3 Nội dung 3: Khảo sát tính chất hóa lý và thành phần nọc bò cạp

3.3.1 Tính chất hoá lý của nọc thu được:

Nọc mới thu là dung dịch trắng đục, có mùi tanh

Sau khi đông khô nọc có dạng tinh thể, màu trắng, dễ bị hút ẩm trở lại Nọc là hỗn hợp các protein nên chúng dễ bị thay đổi theo nhiệt độ, vì vậy nọc cần bảo quản trong ngăn đá của tủ lạnh ở nhiệt độ -20 OC Trước khi sử dụng cho các thử nghiệm, nọc được lấy ra khỏi tủ đông lạnh và để lọ đựng nọc ở nhiệt độ phòng trong khoảng 30 phút, sau đó mới mở nắp lọ để hạn chế nọc bị hút ẩm

Dưới đây chúng tôi xin đơn cử số liệu quan sát khi nuôi thí nghiệm bò cạp trong phòng thí nghiệm Độ ẩm của nọc tươi theo thời gian nuôi được xác định như bảng

số liệu dưới đây:

Bảng 6 Lương nọc thu được và độ ẩm của nọc trong thời gian nuôi

Thời gian lấy nọc (tháng) Lần đầu 0,5 1 2 3 4 5 6

Độ ẩm của nọc tươi (%) 82,7 85,2 87 86,7 86,6 87,4 87,3 89,2

Những nghiên cứu của chúng tôi cho thấy độ ẩm trung bình của nọc tươi là 85,6%, (nước chiếm 85,6% trọng lượng nọc thu được) Độ ẩm của nọc bò cạp trong thời gian nuôi cao hơn so với độ ẩm của nọc khi bò cạp sống trong tự nhiên (lúc mới mua về), có thể là do trong môi trường chăn nuôi với lượng thức ăn và nước uống đầy đủ như vậy đã làm thay đổi độ ẩm của nọc

3.3.2 Hàm lượng protein trong nọc và pH của nọc

1) Hàm lượng protein trong nọc:

Để xác định hàm lượng protein trong nọc bò cạp chúng tôi đã cân 15 mg nọc bò cạp và hòa vào 1,5 ml nước cất sau đó đem ly tâm với tốc độ 8000 vòng/phút trong 10 phút rồi dùng pipet hút phần tan trong nước Lấy 1 ml của dung dịch protein này và thêm 4 ml thuốc thử Biure lắc đều để 20 phút sau đó đem so màu ở bước sóng 540 nm Dùng albumin 1% và thuốc thử Biure đem so màu ở bước sóng 540 nm để xây dựng đường chuẩn Kết quả được trình bày trong bảng sau:

Bảng 7 Kết quả đo mật độ quang của mẫu và chuẩn

Hình 3 Đồ thị đường chuẩn nồng độ protein

Theo sự chuẩn bị mẫu như trên thì phần trăm protein tan trong nước trong nọc bò cạp (H) sẽ là H = (1,289 x 5 x 1,5 x 100): 15 = 64,45%

Như vậy, định lượng protein theo phương pháp Biure, chúng tôi đã xác định nọc

bò cạp H.laoticus thu lúc mới nuôi chứa 64,45% protein

2) pH của nọc

Để xác định pH của nọc chúng tôi cân 4mg nọc hoà tan trong 4 ml nước cất sau đó dùng điện cực để đo pH của dung dịch nọc Thí nghiệm được lặp lại 3 lần trên 3 mẫu nọc bò cạp Kết quả được trình bày dưới bảng 8

3.3.3.1 Phân tích nọc bằng phương pháp sắc ký lọc gel

Để nghiên cứu thành phần protein trong nọc bò cạp H.laoticus chúng tôi đã tiến

hành phân tích nọc bằng phương pháp sắc ký qua cột với Bio-gel P 10 (1,5 x 100 cm) và khảo sát tính chất của các phân đoạn tách ra

Tiến hành chạy sắc ký lọc gel phân tách nọc bò cạp trên cột gel Bio-Gel P10, với lượng nọc thô dùng để pha mẫu ở mỗi lần là 135 mg 135 mg nọc bò cạp thô pha trong 1,5x2 ml đệm Sau khi ly tâm loại bỏ phần không tan chiếm 5.8% (7,8 mg) lượng nọc thô, như vậy trong 3 ml dung dịch mẫu có 127,2 mg nọc tan trong nước Khi đưa mẫu lên cột chỉ sử dụng 2 ml mẫu, như vậy lượng nọc tan trong nước đưa lên cột là: 84,8 mg (tương ứng với 90 mg nọc thô)

Chúng tôi có được sắc ký đồ như sau:

Sau khi chạy sắc ký lọc gel phần nọc bò cạp tan trong nước trên cột gel Bio-Gel

P10 chúng tôi thu được 10 phân đoạn Chúng tôi thu các phân đoạn sau phân tách

bằng lọc gel và đem đông khô để tiếp tục khảo sát độc tính và khối lượng phân tử

của các phân đoạn

3.3.3.2 Khảo sát độc tính của các phân đoạn sắc ký

Để khảo sát độc tính của các phân đoạn, chúng tôi tiến hành tiêm tĩnh mạch trên

chuột nhắt trắng ddY, 18 – 25 g các phân đọan nọc bò cạp Kết quả được trình bày

trong bảng sau:

Bảng 9 Kết quả thử độc tính của các phân đoạn lên chuột

Phân đoạn Các phản ứng xảy ra trên chuột sau khi tiêm

3 Thở gấp, liệt một chân sau, chết sau 23 phút Độc gây chết

4 Thở gấp, liệt hai chân sau, có hiện tượng máu

Kết quả thử độc tính của các phân đoạn lên chuột cho thấy các phân đoạn 2, 3, 4,

5, 6 và 7 là những phân đoạn độc gây chết Sau khi tiêm vào chuột, chuột đã có

một số biểu hiện bị độc và chết sau một thời gian Các phân đoạn còn lại 1, 8, 9 và

10 không có độc tính, sau khi tiêm chúng chuột chỉ bị sốc do tiêm rồi sau đó đã

hoạt động bình thường trở lại giống như khi tiêm nước cất

Như vậy trong 10 phân đoạn tách ra thì có 6 phân đoạn có độc tính gây chết, để khảo sát tính chất các phân đoạn này, chúng tôi đã tiến hành chạy điện di để xác định khối lượng phân tử của chúng

3.3.3.3 Kết quả chạy điện di trên gel SDS-polyacrylamide

Quá trình chạy điện di các phân đoạn tách ra trên gel SDS-polyacrylamide (hình 3a và 3b) cho thấy:

• Phân đoạn 1: chứa chủ yếu các protein có khối lượng phân tử lớn như các enzyme và các protein cấu trúc chủ yếu nằm ở trong vùng lớn hơn 35 kDa, ngoài

ra còn có các protein nằm trong khoảng 12 kDa

• Phân đoạn 2: chứa các protein giống như ở phân đoạn 1, ngoài ra nó còn chứa thêm các protein nằm ở vùng 13-14 kDa Đó là điểm khác nhau về thành phần protein của phân đoạn 1 và 2, phân đoạn 2 có độc tính còn phân đoạn 1 không độc Độc tính của phân đoạn 2 có thể là do các protein trong đó phospholipase có khối lượng phân tử nằm trong vùng 13-14 kDa gây ra

• Phân đoạn 3, 4, 5: chứa chủ yếu các protein nằm trong vùng 10-14 kDa, độc tính của phân đoạn này có lẽ do các protein trong đó có phospholipase gây ra

• Phân đoạn 6 và 7: chứa các protein nằm trong vùng nhỏ hơn 10 kDa, tương đương với các neurotoxin nọc bò cạp, chúng gồm hai nhóm toxin với khối lượng phân tử nằm trong vùng 3,5-5 kDa và 6-8 kDa

• Các phân đoạn 8, 9 và 10: chứa chủ yếu các peptid với khối lượng phân tử nhỏ hơn 2,5 kDa trên bản điện di chúng hiện rất mờ

Tài liệu về neurotoxin của nọc bò cạp cho biết khối lượng phân tử của neurotoxin

có thể đóng vai trò quan trọng trong chỉ thị hoạt tính của chúng [25] Các neurotoxin tách từ nọc bò cạp có khối lượng phân tử nằm trong vùng 3-4 kDa thì thường ức chế hoạt động của kênh K+ (Kali) của tế bào thần kinh, trong khi đó các neurotoxin ức chế hoạt động của kênh Na+ (Natri) có khối lượng phân tử nằm

trong vùng 6-8 kDa [2] Như vậy các neureotoxin trong nọc bò cạp Heterometrus

sp có thể có tác dụng ức chế sự hoạt động của các kênh K + và kênh Na+

a b

Hình 5 Kết quả điện di các phân đoạn tách ra từ nọc bò cạp qua cột

a) Điện di của các phân đoạn 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10 trong đó:

1-phân đoạn No 1; 2-phân đoạn No 2; 3-phân đoạn No 3; 4-phân đoạn No 5; marker; 6-phân đoạn No 7; 7-phân đoạn No8; 8-phân đoạn No 9; 10- phân đoạn

5-No 6 b) Điện di của phân đoạn 4 trong đó: 1-marker; 2-phân đoạn 5-No 4

3.4 Nội dung 4: Khảo sát độ ổn định của nọc trong điều kiện bảo quản ở

-20 0 C

3.4.1 Hàm lượng protein trong nọc và pH của nó

Nọc thu được, đông khô và bảo quản ở -200C sau 6 tháng khảo sát tính chất hoá

lý, kết quả cho thấy hàm lượng protein và pH của nọc không thay đổi so với nọc ban đầu với các số liệu sau:

- Hàm lượng protein trong nọc 64,45 %

- pH của nọc 6,45

3.4.2 Thành phần protein của nọc

3.4.2.1 Phân tích nọc bằng phương pháp sắc ký lọc gel

Kết quả phân tích sắc ký cho thấy nọc thô tách ra làm 10 phân đoạn giống như nọc thô đã khảo sát 6 tháng trước Tiếp theo chúng tôi tiến hành đông khô các phân đoạn đã tách ra và khảo sát độc tính của các phân đoạn tách ra bằng cách tiêm tĩnh mạch vào chuột nhắt trắng như đã làm trước đây Kết quả phân tách nọc bò cạp bằng sắc ký lọc gel được trình bày trong hình 4

Hình 6 Phân tách nọc bò cạp H laoticus trên cột với Bio-Gel P 10

3.4.2.2 Khảo sát độc tính của các phân đoạn sắc ký

Kết quả thử độc tính của các phân đoạn được trình bày trong bảng sau:

3 Xù lông, gãi thân, ngủ sau đó bình thường Không độc

4 Xù lông , gãi thân, ngủ sau đó bình thường Không độc

phút

Độc mạnh gây chết

9 Thở gấp, sau đó hoạt động bình thường Không độc

3.4.2.3 Kết quả điện di các phân đoạn tách ra trên gel SDS-polyacrylamide

1 2 3 4 5 6 7

120 86,2

47

34

26

20 kDa

Hình 7 Kết quả điện di các phân đoạn tách ra từ nọc bò cạp qua cột

Trong đó: 1-phân đoạn No 2; 2-phân đoạn No 3; 3-phân đoạn No 4; 4-phân đoạn

No 5; 5-phân đoạn No 6; 6-phân đoạn No 7; 7-marker (các protein chuẩn)

Tiến hành điện di các phân đoạn tách ra cho thấy sau thời gian bảo quản nọc trong phòng thí nghiệm có một số thay đổi Các phân đoạn 3-4 là các phân đoạn chứa các protein có khối lượng phân tử lớn 15 kDa đến 90 kDa là các enzyme Các enzyme thường hay thay đổi trong bảo quản Tính chất của các protein này đã thay đổi khi bảo quản ở -20 0C trong thời gian dài 6 tháng, cụ thể độc tính của các phân đoạn này khi thử lên chuột có thay đổi Các phân đoạn 3 và 4 không còn độc tính (so sánh kết quả thử độc tính của các phân đoạn trình ghi trong bảng 7 và 8) Phân đoạn 2 của nọc có lẽ là các enzyme tương đối bền vững nên độc tính của chúng không thay đổi sau quá trình bảo quản 6 tháng ở -200C trong 6 tháng Các phân đoạn 5, 6, 7 là các phân đoạn chứa các protein có khối lượng phân tử nhỏ hơn đó là các phospholipase và các neurotoxin, các protein này là các peptit ngắn nên chúng bền vững hơn, tính chất ít thay đổi khi bảo quản 6 tháng ở điều kiện -

20oC Các phân đoạn này vẫn duy trì tính chất độc, gây tử vong cho chuột nhắt