2.2.3.1. Bằng phương phỏp hỡnh thỏi
Cỏc chủng Microcystis sau khi đó phõn lập thuần khiết đƣợc quan sỏt dƣới
kớnh hiển vi quang học Olympus cú độ phúng đại 400-1000 lần để quan sỏt cỏc đặc điểm hỡnh thỏi và kớch thƣớc tế bào của chỳng. Để định loại, chỳng tụi sử dụng cỏc tài liệu chớnh sau:
- Phõn loại thực vật học bậc thấp .
- Phõn loại Vi khuẩn lam ở Việt Nam [07].
- The on-line database of Cyanobacterial genera [27].
2.2.3.2 . Phương phỏp tỏch ADN
ADN đƣợc chiết xuất và tỏch từ sinh khối ƣớt theo phƣơng phỏp [44]. Lấy 3 vũng que cấy sinh khối tế bào sau 14 giờ nuụi, ly tõm lạnh ở 4oC với tốc độ 8000 vũng trong15 phỳt và rửa 2 lần bằng 300àl dung dịch muối EDTA pH 8,0 (0,5M Na2EDTA, 0,15M NaCl). Sau đú tạo dịch huyền phự trở lại trong 200àl đệm 10 x TE (10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8,0, tỷ lệ mẫu:đệm, 1: 2). Bổ sung 10àl của
lyzozym (Sigma, 1mg/ml Lysozym), giữ ở 37oC trong nồi cỏch thuỷ trong 15 phỳt. Bổ sung dung dịch Tris-SDS (0,1M Tris-HCl pH 9,0 và 1% SDS) với thể tớch bằng thể tớch mẫu. Dịch mẫu đƣợc giữ ở 60oC trong nồi cỏch thuỷ khoảng 10-30 phỳt. Sự tan tế bào đƣợc xỏc định bằng sự trong suốt của dung dịch cựng với sự tăng độ nhớt tƣơng ứng. Dịch tan tế bào đƣợc làm lạnh trong đỏ trong 10 phỳt, bổ sung 150àl cloroform-isoamyl alcohol, 24:1, v/v (giữ ở 4oC) với thể tớch bằng 1/3thể tớch mẫu. Ly tõm lạnh ở 4oC với tốc độ 10.000 vũng trong 20 phỳt để phõn lớp. Sau đú chuyển phần nhớt ở phần đầu sang Eppendorf (Cỡ. 1,5ml) mới và ADN đƣợc tỏch ra bằng bổ sung etanol lạnh (etanol 95,5% giữ ở-22oC) với thể tớch gấp đụi thể tớch mẫu và 2àl của 3M Na acetate (pH=4,5).
Ngõm ADN trong 100àl ethanol 70% trong 30 phỳt và sau đú ngõm liờn tiếp trong ethnol 80, 90, 95% cho mỗi nồng độ trong 5 phỳt. Sợi ADN làm khụ bằng nhiệt độ phũng trong 10 phỳt và đƣợc làm tan trở lại trong 20àl đệm 0,1 x TE (10 x TE) ở 4oC qua đờm.
Dịch đem phõn tớch bằng mỏy quang phổ kế ở cỏc bƣớc súng 230, 260 và 280nm. ADN hấp thụ rất nhanh ở bƣớc súng 260nm. ở bƣớc súng 280 chứng tỏ sự cú mặt của protờin. Bƣớc súng 230nm biểu hiện sự cú mặt của chất đệm, cỏc muối nhƣ EDTA và của ARN. Cỏc tỷ lệ chuẩn về hấp thụ của ADN ở cỏc bƣớc súng 230 : 260 : 280 là 1,0 : 0,45 : 0,515. Hàm lƣợng ADN đƣợc tớnh nhƣ sau: 1 đơn vị OD (mật độ quang, Optical Durity) ở 260nm tƣơng đƣơng với 50àg/ml ADN.
Cỏch tớnh: Đơn vị mẫu x độ loóng x chỉ số/1000 = ADN àg/àl.
Nếu ADN chƣa sạch cần khử protein và ARN bằng enzym proteaza K và RNazaA
2.2.3.3. Húa phõn loại phõn tớch thành phần acid bộo
Lấy 50mg mẫu cho vào ống thủy tinh nỳt vặn (cỡ 13mm x 100mm) [32]. Alkal húa bằng 1.0ml chất phản ứng I (reagent I, gồm 15g sodium hydroxide (NaOH), 50ml methanol và 50ml Milli- Q). Tế bào đƣợc thủy phõn ở 1000C tại nồi nhiệt khụ trong 5 phỳt. Sau đú làm huyền phự bằng mỏy Vortex trong 5 giõy rồi tiếp tục cho thủy phõn trong 25 phỳt. Dịch thủy phõn đƣợc làm lạnh ở nhiệt độ phũng.
Methyl húa dung dịch Alkal với 0.2ml chất phản ứng 2 (65ml 6N hydrochloric acid và 55ml methanol). Sau khi metyl húa, giữ ở 800C trong nồi cỏch thủy khoảng 10 phỳt. Dung dịch methyl húa đƣợc bổ sung 1.25ml của chất thử 3 (gồm 50ml n- hexane-methyl tert butyl ether, 1:1, v/v) và đƣợc trộn đều bằng mỏy lắc 2000rpm trong 10 phỳt. Dịch nhớt phớa trờn đƣợc loại bỏ. Dung dịch đƣợc bổ sung 3ml thuốc thử 4 (1.2g sodium hydroxide trong 100ml Milli-Q) và đƣợc trộn đều bằng tay trong 5 phỳt. Ly tõm ở 2500rpm trong 10 phỳt. Dịch trờn cựng đƣợc chuyển sang ống thủy tinh mới cú nỳt vặn và cho bay hơi bằng khớ nitrogen thụng thƣờng tới khi khụ. Cuối cựng, toàn bộ dịch mẫu đƣợc làm tan với 50àl của diethyl ether 300 (hoặc acetone – 300, n-hexane). Toàn bộ mẫu đƣợc chấm vào sắc ký bản mỏng (TCL) rồi đƣợc đặt trong bồn thủy tinh chứa 100ml n-hexane-diethyl ether (4:1,v/v) trong 30 – 45 phỳt. Thành phần acid bộo đƣợc hiờn vệt bằng iot trong 30 – 45 phỳt. Acid bộo cú cực và khụng cực xuất hiện nhƣ những vệt xanh. Những vệt đƣợc cạo và rửa giải hai lần bằng diethyl ether 300. Trộn đều dung dịch silicagel trờn mỏy lắc 2000rpm trong 10 phỳt và ly tõm 2500rpm trong 5 hoặc 10 phỳt. Dung dịch đƣợc bay hơi bằng khớ nitrogen thụng thƣờng tới khi khụ mẫu. Mẫu đƣợc hũa tan trở lại với 50àl chất phản ứng 3. Dựng pipet nhỏ vào lọ nhỏ GC cú nỳt đậy. Sau đú, đem phõn tớch trờn mỏy sắc ký khớ (gas chromatography).
2.2.4. Xỏc định mật độ tế bào
Số lƣợng tế bào vi khuẩn lam trong một thể tớch nƣớc đƣợc xỏc định bằng cỏch đếm số tế bào trờn 400 ụ nhỏ thuộc 25 ụ lớn của buồng đếm Goriaev.
Một ụ lớn của buồng Goriaev cú diện tớch 1/25 mm2 và chiều cao 1/10 mm. Nhƣ vậy thể tớch của 1 ụ là 1/25 ì 1/10 (mm3), thể tớch của 25 ụ lớn là: 1/25 ì 1/10 x 25 (mm3)
Nếu a là số lƣợng tế bào vi khuẩn lam đếm đƣợc trờn buồng đếm thỡ số lƣợng tế bào tảo trong 1 ml là:
2.2.5. Phƣơng phỏp tỏch chiết độc tố microcystin từ tế bào của Microc ystis
Trong thớ nghiệm của chỳng tụi, microcystin của Microcystis đƣợc tỏch chiết theo phƣơng phỏp đụng tan [44]. Thu sinh khối bằng cỏch ly tõm với tốc độ 7000 vũng/20 phỳt sau đú lọc dịch nổi bằng thiết bị lọc GF/C (Whatman). Dịch nổi đƣợc lọc qua màng lọc kớch thƣớc 0,2 μm (Milipore). Sinh khối thu đƣợc đụng khụ ở nhiệt độ – 83oC, chiết rỳt độc tố bằng Methanol : nƣớc cất (80:20) và bằng Methanol : n.Hexan (85:15). Lọc qua cột C18 để loại bỏ sắc tố chiết từ tế bào
Microcystis. Dịch chiết lỏng đƣợc giữ trong catrid Sep-Pak (Water) và rửa bằng
dung dịch methanol 20%. Dịch chiết đƣợc chạy qua sắc ký bản mỏng (TLC) để làm sạch độc tố, cạo phần độc tố trờn bản TLC. Microcystin sau đú đƣợc tỏch ra nhờ xử lý với 3 ml methanol 90%, đem sấy khụ qua dũng khớ nitrogen và hoà tan trong một lƣợng nhỏ hỗn hợp nƣớc- ethanol 20%. Thành phần và nồng độ của dịch chiết đƣợc xỏc định bằng mỏy HPLC (Hewlett Packard model 1100 LC) qua cột ODS II (4,6 mm; 150 mm) với methanol chứa 0,05 M phosphatase, pH 3 (tỷ lệ 6:4 theo thể tớch), tỏch trong pha động.
2.2.6. Phƣơng phỏp xỏc định hàm lƣợng trờn mỏy quang phổ
Độc tố microcystin đƣợc phõn tớch trờn mỏy quang phổ theo phƣơng phỏp [28 ]. Hàm lƣợng microcystin đƣợc tớnh toỏn theo phƣơng trỡnh đƣờng chuẩn thu đƣợc của microcystin chuẩn. Dựa vào đồ thị chuẩn của microcystin theo mật độ quang, xỏc định hàm lƣợng microcystin cú trong dịch chiết.
Phương phỏp xõy dựng đường chuẩn hàm lượng microcystin theo mật độ quang: Dịch chiết MC - LR chuẩn cú nồng độ 10ng/ml đƣợc pha loóng gấp 1000,
3000, 5000, 7000, 9000, 11000 lần với hỗn hợp dung mụi methanon : nƣớc theo tỷ lệ 80 : 20. Tiến hành đo ở bƣớc súng 242 nm trờn mỏy quang phổ ERMA 11 TOKYO. Căn cứ vào cỏc giỏ trị mật độ quang đo ta lập đƣợc đồ thị biểu thị mối quan hệ với nồng độ dịch chiết microcystin.
2.2.7. Cỏc phƣơng phỏp sắc ký
Là phƣơng phỏp hiệu quả cho việc định tớnh, định lƣợng và tinh sạch cỏc hợp chất hữu cơ. Nguyờn tắc chung của phƣơng phỏp sắc ký là dựa trờn sự phõn bố cỏc
chất giữa hai pha là pha động và pha tĩnh. Pha động cú thể là chất khớ hoặc lỏng để đẩy mẫu qua vựng chứa pha tĩnh. Pha tĩnh chứa chất rắn hoặc lỏng gọi là cỏc hợp chất phụ cú khả năng chứa cỏc chất hũa tan. Mẫu phõn tớch chứa một hay nhiều cấu tử, khi tiếp xỳc với pha tĩnh và pha động cỏc cấu tử khỏc nhau tỏch nhau ra do chỳng cú ỏp lực khỏc nhau với cả hai pha.
2.2.7.1. Phương phỏp sắc ký bản mỏng (TLC)
Việc tỏch cỏc chất trong sắc ký bản mỏng [49] dựa trờn sự phõn tỏch cỏc chất giữa hai pha:
- Pha cố định là chất hấp phụ đƣợc trải rộng trờn một phiến kớnh tạo thành lớp mỏng.
- Pha động là dung mụi thớch hợp đựng trong bỡnh cú nắp đậy kớn.
Trong quỏ trỡnh sắc ký dung mụi di chuyển làm dịch chuyển cỏc thành phần trong mẫu (đó đƣợc chấm thành từng vết trờn phiến kớnh trải chất hấp phụ)
Tiến hành thớ nghiệm:
- Pha mẫu sau cụ quay thành 1ml bằng hỗn hợp dung mụi methanol: nƣớc (80:20), chấm toàn bộ mẫu lờn trờn bản silicagel. Đặt bản mỏng trong bồn thủy tinh chứa 50ml hỗn hợp dung mụi ethyl acetat: isopropanol: nƣớc = 8:5:3 (v/v), trong 45-60 phỳt. Sau khi làm khụ tới nhiệt độ phũng, nhuộm TLC bằng nihydrin 2% trong butanol bóo hũa. Sấy khụ, quan sỏt cỏc vết xuất hiện trờn nền TLC. Sau đú đỏnh dấu, cạo cỏc vết lờn cựng với microcystin chuẩn. Tỏi chiết rỳt độc tố này bằng hỗn hợp dung mụi methanol : nƣớc (80:20). Đem dịch này ly tõm ở tốc độ 8000 vũng/ phỳt, trong 15 phỳt. Sau đú, lọc dịch qua cột C18.
2.2.7.2. Phương phỏp sắc ký lỏng cao ỏp (HPLC)
Sắc ký lỏng cao ỏp [27 ] là phƣơng phỏp chia hỗn hợp cỏc chất trong cột sắc ký trong đú pha động ở trang thỏi lỏng nhờ một ỏp lực lớn đƣợc đẩy qua pha tĩnh Trong HPLC, mẫu phõn tớch đƣợc bơm vào cột sắc ký qua một van bơm sỏu chiều, sau đú nhờ bơm cao ỏp mà pha động đƣợc đẩy qua cột với tốc độ dũng khụng đổi trong suốt thời gian chạy sắc ký. Ở đõy pha động vừa đúng vai trũ là chất mang,
mang mẫu phõn tớch vào cột tỏch, vừa là chất rửa giải trong suốt quỏ trỡnh chạy sắc ký. Pha động cú thể là một dung mụi hữu cơ hoặc hỗn hợp nhiều dung mụi hữu cơ khỏc nhau. Thiết kế hệ thống HPLC gồm:
Tiến hành thớ nghiệm
Mỏy HPLC trờn cột ODS II 4.6mm x 150mm, đƣờng kớnh hạt 5 μm. Bộ lọc dung mụi và bộ lọc mẫu đƣờng kớnh lỗ màng 100Ao. Detector UV-VIS, λ = 242 nm, mỏy vi tớnh ghi tớn hiệu nối với mỏy in.
Pha tĩnh: Supelcosil LC –18
Pha động : Methanol chứa 0,5M phosphate = 6:4 (v/v)
Cỏc mẫu đƣợc hũa tan trong hệ dung mụi của pha động, tiến hành chạy MC chuẩn và mẫu nghiờn cứu. Tốc độ dũng là 1ml/ phỳt, pH = 3.
2.2.8. Phƣơng phỏp nuụi cấy chủng vi khuẩn Sphingomonas
Chủng vi khuẩn Sphingomonas [22] đƣợc phõn lập từ mẫu nƣớc hồ. Lấy 1 ml nƣớc hồ pha loóng ở cỏc nồng độ pha loóng thớch hợp. Nhỏ 1ml dịch pha loóng trờn mụi trƣờng dịch thể NA và M7. Sau 24 giờ nhỏ 100àl dịch cấy trang đều trờn mặt thạch quan sỏt thấy cỏc khuẩn lạc, tỏch và cấy ria nhúm khuẩn lạc cho tỏch nhau riờng rẽ. Tỏch và cấy một khuẩn lạc trờn mụi trƣờng tƣơng ứng. Quỏ trỡnh lặp lại nhiều lần cho đến khi thu đƣợc cỏc chủng thuần khiết.
Nuụi giữ chủng vi khuẩn này trờn mụi trƣờng thạch nghiờng, bảo quản ở nhiệt độ 4°C dựng cho cỏc nghiờn cứu tiếp theo.
2.2.9. Phƣơng phỏp xỏc định khả năng phõn giải microcystin
Sự phõn giải đƣợc bắt đầu bằng cỏch bổ sung dịch chiết microcystin thụ vào cỏc mẫu nƣớc vụ trựng để thu đƣợc cỏc nồng độ microcystin khỏc nhau. Cỏc chủng vi khuẩn phõn giải vi khuẩn lam đƣợc đƣa vào với mật độ 2.5 ì 106
tế bào/ml. Sau 20 phỳt kiểm tra mẫu một lần bằng cỏch lấy 50ml dịch đem lọc qua màng lọc kớch thƣớc 0,22àm, sau đú đem đo ở bƣớc súng 242nm để xỏc định nồng độ độc tố cũn lại. Mẫu đối chứng (khụng cú vi khuẩn) đƣợc tiến hành song song. Cỏc thớ nghiệm
đƣợc lặp lại 3 lần. Hiệu quả phõn giải microcystin đƣợc xỏc đinh nhờ phƣơng phỏp bỏn thời gian nhƣ mụ tả của Kenefick [28]:
Ct = Co.e(-kt)
Trong đú: Ct – nồng độ microcystin tại thời điểm đo (àg/ml) Co – nồng độ microcystin trƣớc phõn hủy (àg/ml)
k – hằng số phõn hủy bậc đầu tiờn (ngày -1)
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. PHÂN TÍCH CÁC CHỈ TIấU THỦY Lí, THỦY HểA NƢỚC HỒ HOÀN KIẾM KIẾM
Đặc điểm của cỏc mựa cú ảnh hƣởng tới cỏc quần thể vi tảo và vi khuẩn lam. nhƣ vi tảo silic kết hợp với việc phỏt triển nhanh roi trong mựa đụng và mựa xuõn, tiếp theo là tảo lục vào cuối mựa xuõn và đầu hố. Tại nơi phỳ dƣỡng và thuỷ vực lớn, vi khuẩn lam thƣờng chiếm ƣu thế trong cỏc loài thực vật nổi vào cuối xuõn đầu hố. Sự thay đổi về mựa là cỏc nhõn tố mụi trƣờng thƣờng khụng đủ để gõy ra sự thay thế vi khuẩn lam bằng cỏc loài thực vật nổi. Vi khuẩn lam là hiện hữu chiếm ƣu thế hầu hết trong năm. Do vậy, để đỏnh giỏ chất lƣợng nƣớc hồ, chỳng tụi đó tiến hành phõn tớch tổng hợp cỏc thành phần và cỏc điều kiện ảnh hƣởng đến nƣớc. Trong nghiờn cứu này, chỳng tụi tiến hành hai đợt thu mẫu vào thỏng 03 và 05 năm 2007.
Kết quả phõn tớch chi tiết đƣợc trỡnh bày ở phụ lục 5.
3.1.1. Nhiệt độ
Nhiệt độ ở một đợt thu mẫu trong cựng một hồ lại khỏc nhau tựy thuộc vào thời gian và địa điểm thu mẫu. Tại cỏc cống dẫn nƣớc thải vào hồ, nhiệt độ nƣớc luụn cao hơn cỏc điểm xa bờ và giữa hồ từ 1- 2°C.
3.1.2. pH
Trong thời gian chỳng tụi thu mẫu, pH của hồ khỏ cao. Giỏ trị pH tại cỏc điểm lấy mẫu dao động từ 9,57- 9,84 vào đợt thu mẫu thỏng 06/03/2007 và từ 9,77- 10,37 vào đợt thu mẫu thỏng 08/05/2007.
3.1.3. Cỏc chất lơ lửng SS
Hàm lƣợng cỏc chất lơ lửng trong hồ tƣơng đối cao, dao động từ 230- 450mg/l trong hai đợt thu mẫu.
3.1.4. Hàm lƣợng oxy hũa tan trong nƣớc (DO- Dissolve oxygen)
Từ số liệu nghiờn cứu cho thấy hàm lƣơng oxy hũa tan trong nƣớc cao, dao động từ 9,42mg/l- 22,4mg/l.
Điều này phự hợp với thực tế là vào thời điểm chỳng tụi tiến hành thu mẫu, trong hồ cú sự nở hoa rất nhiều của vi khuẩn lam Microcystis, chớnh sự quang hợp của những vỏng nở hoa và cỏc loài vi tảo khỏc dẫn tới hàm lƣợng oxy hũa tan trong hồ tăng đỏng kể.
3.1.5. Nhu cầu oxy húa học (COD- Chemical oxygen demand)
Sự dao động giỏ trị COD trong hồ từ 80,85mg/l- 767,20mg/l. Giỏ trị COD cao nhất gấp 20 lần so với tiờu chuẩn Việt Nam loại B về chất lƣợng nƣớc mặt.
3.1.6. Nhu cầu oxy sinh húa (BOD- Biochemical oxygen demand)
Kết quả nghiờn cứu của chỳng tụi cho thấy hàm lƣợng BOD trong hồ dao động thấp nhất là 55 mg/l, cao nhất là 260 mg/l vào thỏng 3, ở thỏng 5 thấp nhất là 100 mg/l, cao nhất là 548 mg/l. Hàm lƣợng BOD5 cao gấp 20 lần so với tiờu chuẩn Việt Nam loại B về chất lƣợng nƣớc mặt.
Những nhận xột chung về nước ở hồ Hoàn Kiếm:
Từ cỏc số liệu phõn tớch đƣợc trong bảng kết quả, cú thể nhận xột hồ đang trong tỡnh trạng ụ nhiễm. Với giỏ trị hàm lƣợng NH4+ dao động 0,129mg/l – 0,699mg/l, NO2- ở khoảng 0.012mg/l – 0,05mg/l, NO3- từ 0,047mg/l – 0,129mg/l và PO43- là 0,08mg/l – 0.64mg/l chứng tỏ nƣớc hồ cú hàm lƣợng dinh dƣỡng khỏ cao. Sự phỏt triển của vi khuẩn lam là quanh năm nhƣng thỏng 5 phỏt triển nhiều hơn thỏng 3 bởi thời tiết thƣờng ấm ỏp hơn. Vi khuẩn lam phỏt triển dày đặc trờn mặt hồ và đặc biệt tập trung ở khu vực cuối hƣớng giú.
3.2. TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN LAM THUỘC CHI
Microcystis PHÂN LẬP ĐƢỢC 3.2.1. Đặc điểm nuụi cấy
Lấy 1 lƣợng mẫu từ cỏc lọ đựng mẫu trong mụi trƣờng nuụi cấy làm giàu, cho vào Eppendorf sạch, ly tõm ở tốc độ 10000 vũng/15 phỳt. Sau đú, tiến hành pha
loóng mẫu ở cỏc nồng độ thớch hợp (10-2; 10-3), nhỏ 100àl mẫu và trang đều trờn 6 loại mụi trƣờng thạch Bold 3N, B12, BG11, C, MA và J. Do M. aeruginosa cú khụng bào khớ (gas vacuoles) nờn chỳng khụng tạo thành khuẩn lạc trờn cỏc loại agar hoặc agarose thụng thƣờng. Tuy nhiờn, điều này cú thể đƣợc khắc phục nhờ kỹ thuật cải tiến của Watanabe [11, 49]. Dịch thể cú chứa M. aeruginosa với mụi
trƣờng sử dụng loại agarose cú nhiệt độ tạo gel cực thấp nồng độ 0,4% (type IX, Sigma) đƣợc sử dụng làm giỏ thể. Cỏc đĩa thạch sau khi cấy đƣợc quấn paraphin,