Microcystis PHÂN LẬP ĐƢỢC 3.2.1. Đặc điểm nuụi cấy
Lấy 1 lƣợng mẫu từ cỏc lọ đựng mẫu trong mụi trƣờng nuụi cấy làm giàu, cho vào Eppendorf sạch, ly tõm ở tốc độ 10000 vũng/15 phỳt. Sau đú, tiến hành pha
loóng mẫu ở cỏc nồng độ thớch hợp (10-2; 10-3), nhỏ 100àl mẫu và trang đều trờn 6 loại mụi trƣờng thạch Bold 3N, B12, BG11, C, MA và J. Do M. aeruginosa cú khụng bào khớ (gas vacuoles) nờn chỳng khụng tạo thành khuẩn lạc trờn cỏc loại agar hoặc agarose thụng thƣờng. Tuy nhiờn, điều này cú thể đƣợc khắc phục nhờ kỹ thuật cải tiến của Watanabe [11, 49]. Dịch thể cú chứa M. aeruginosa với mụi
trƣờng sử dụng loại agarose cú nhiệt độ tạo gel cực thấp nồng độ 0,4% (type IX, Sigma) đƣợc sử dụng làm giỏ thể. Cỏc đĩa thạch sau khi cấy đƣợc quấn paraphin, đặt dƣới cƣờng độ ỏnh sỏng 1500 Lux.
Sau 10 ngày quan sỏt khuẩn lạc.
Kết quả đƣợc trỡnh bày ở hỡnh 3.1 ; 3.2 ; 3.3 ; 3.4
Hỡnh 3.1. Hỡnh thỏi khuẩn lạc của Microcystis trờn mụi trƣờng C
Hỡnh 3.2. Hỡnh thỏi khuẩn lạc của Microcystis trờn mụi trƣờng Bold 3N
Hỡnh 3.3. Hỡnh thỏi khuẩn lạc của Microcystis trờn mụi trƣờng B12
Hỡnh 3.4. Hỡnh thỏi khuẩn lạc của Microcystis trờn mụi trƣờng J
Kết quả thử nghiệm cho thấy trờn 3 mụi trƣờng Bold 3N, B12 và J khuẩn lạc của Microcystis cú khả năng mọc tốt hơn so với cỏc mụi trƣờng BG11, C, MA. Ở 3 mụi trƣờng sau, khuẩn lạc Microcystis sau 2 - 4 tuần nuụi mới thấy xuất hiện khuẩn lạc. Điều này cho thấy trờn cỏc mụi trƣờng cơ chất khỏc nhau, dẫn đến khả năng sinh trƣởng của chỳng cũng khỏc nhau.
3.2.2. Phõn lập cỏc khuẩn lạc của Microc ystis
Phõn lập cỏc khuẩn lạc Microcystis trờn cỏc mụi trƣờng nuụi cấy, bƣớc đầu
chỳng tụi thu đƣợc 10 chủng. Cỏc chủng này cú những đặc điểm hỡnh thỏi tế bào đƣợc nghiờn cứu dƣới kớnh hiển vi quang học và đƣợc phỏt triển nuụi cấy trờn cỏc loại mụi trƣờng khỏc nhau. Kết quả đƣợc trỡnh bày ở hỡnh 3.5; 3.6; 3.7; 3.8; 3.9;
3.10; 3.11; 3.12; 3.13; 3.14
Hỡnh 3.5. Hỡnh dạng tế bào chủng Microcystis sp., LT1
Tập đoàn với tế bào hỡnh cầu, tế bào cú màu xanh lam với nhiều khụng bào khớ, đƣờng kớnh tế bào 3-7 μm. Bao nhầy khụng màu, mờ bao quanh tế bào.
Hỡnh 3.6. Hỡnh dạng tế bào chủng Microcystis sp., LT2
Tập đoàn với tế bào hỡnh cầu,tế bào cú màu xanh nhạt, đƣờng kớnh tế bào 2-5 μm, tập đoàn hỡnh dỏng khụng ổn định, cỏc khối nhỏ hỡnh cầu hoặc thấu kớnh hơi dẹt.
Hỡnh 3.7. Hỡnh dạng tế bào chủng Microcystis sp., LT3
Tập đoàn với tế bào hỡnh cầu,tế bào cú màu xanh nhạt, đƣờng kớnh tế bào 2-5 μm, tập hợp thành từng tập đoàn nhỏ.
Hỡnh 3.8. Hỡnh dạng tế bào chủng Microcystis sp., LT4
Tập đoàn với tế bào hỡnh cầu,tế bào cú màu xanh lam với nhiều khụng bào khớ, đƣờng kớnh tế bào 5-7 μm, bao nhầy khụng màu.
Hỡnh 3.9. Hỡnh dạng tế bào chủng Microcystis sp., LT5
Tập đoàn với tế bào hỡnh cầu,tế bào cú màu xanh lam với nhiều khụng bào khớ, đƣờng kớnh tế bào 3-7 μm, bao nhầy khụng màu.
Hỡnh 3.10. Hỡnh dạng tế bào chủng Microcystis sp., LT6
Tập đoàn với tế bào hỡnh cầu,tế bào cú màu xanh nhạt, đƣờng kớnh tế bào 4-7 μm, tập hợp thành từng tập đoàn nhỏ.
Hỡnh 3.11. Hỡnh dạng tế bào chủng Microcystis sp., LT7
Tế bào hỡnh cầu,tế bào cú màu xanh nhạt, đƣờng kớnh tế bào 3-6 μm, tập hợp thành từng tập đoàn nhỏ.
Hỡnh 3.12. Hỡnh dạng tế bào chủng Microcystis sp., LT8
Tập đoàn với tế bào hỡnh cầu,tế bào cú màu xanh lam với nhiều khụng bào khớ, đƣờng kớnh tế bào 5-7 μm, thƣờng sắp xếp dày đặc. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hỡnh 3.13. Hỡnh dạng tế bào chủng Microcystis sp., LT9
Tập đoàn với tế bào hỡnh cầu,tế bào cú màu xanh nhạt, cỏc khối nhỏ hỡnh cầu đƣờng kớnh tế bào 2-4 μm.
Hỡnh 3.14. Hỡnh dạng tế bào chủng Microcystis sp., LT10
Tập đoàn với tế bào hỡnh cầu,tế bào cú màu xanh lam, cú đƣờng kớnh tế bào 2-4 μm, chứa khụng bào khớ
Kết quả ở hỡnh 3.5; 3.6; 3.7; 3.8; 3.9; 3.10; 3.11; 3.12; 3.13; 3.14 cho thấy đặc điểm hỡnh thỏi của 10 chủng trờn cú nhiều điểm tƣơng đồng, ở chủng LT2
và LT8 đều thấy tập đoàn với tế bào hỡnh cầu, tế bào cú màu xanh lam với nhiều khụng bào khớ bờn trong, đƣờng kớnh tế bào 5-7 àm. Điều này cú thể là do tớnh thớch ứng của từng chủng trong điều kiện mụi trƣờng nuụi cấy. Miờu tả trờn phự hợp với những miờu tả của Watanabe [9, 49].
Tiếp theo chỳng tụi lựa chọn đƣợc những chủng Microcystis mọc nhanh, tốt
trờn cỏc mụi trƣờng dịch thể và tỡm đƣợc thời gian nuụi cấy thớch hợp cho cỏc chủng nhằm thu đƣợc lƣợng sinh khối đủ cho cỏc thớ nghiệm tiếp theo.
3.2.3. Khả năng sinh trƣởng của 10 chủng Microcystis LT1, LT2, LT3, LT4, LT5, LT6, LT7, LT8, LT9 và LT10 trờn cỏc mụi trƣờng khỏc nhau LT5, LT6, LT7, LT8, LT9 và LT10 trờn cỏc mụi trƣờng khỏc nhau
Cỏc khuẩn lạc xuất hiện trờn cỏc đĩa thạch, đƣợc tỏch và kiểm tra độ thuần khiết dƣới kớnh hiển vi. Quỏ trỡnh đƣợc lặp đi lặp lại cho đến khi thu đƣợc chủng thuần khiết.
Cỏc chủng vi khuẩn lam đƣợc tiến hành nuụi trờn 3 mụi trƣờng dịch thể đƣợc chọn lọc đú là Bold3N, J và B12. Tỷ lệ giống ban đầu đƣa vào là 4 ì 105 tb/ml. Cứ 4 ngày lấy mẫu, kiểm tra khả năng sinh trƣởng cho tới khi kết thỳc thời gian sau 23 ngày nuụi cấy.
Bảng 3.1. Khả năng sinh trƣởng của 10 chủng Microcystis trờn mụi trƣờng Bold3N
Thời gian (ngày)
Ký hiệu chủng giống (Số lƣợng tế bào ì106
/ml) LT1 LT2 LT3 LT4 LT5 LT6 LT7 LT8 LT9 LT10 3 1,47 3,09 2,63 3,78 2,32 3,86 1,14 4,46 2,12 3,20 7 4,63 7,66 6,24 8,38 4,98 8,95 3,9 9,16 4,98 6,38 11 15,6 18,9 19,59 21,69 14,06 26,75 16,08 29,84 15,18 20,76 15 36.46 39,8 42,4 41,68 40,82 42,67 32,94 45,62 33,34 48,96 19 32,9 68,6 56,06 60,48 36,7 62,24 26,78 66,46 30,54 45,54 23 28,78 54,8 52,42 53,59 31,86 57,42 22,82 58,74 27,86 40,24
Hỡnh 3.15. Sinh trƣởng của cỏc chủng Microcystis trong mụi trƣờng dịch thể
Bold 3N
Hỡnh 3.16. Cỏc chủng Microcystis phỏt
triển tốt trong mụi trƣờng dịch thể Bold 3N
Bảng 3.2. Khả năng sinh trƣởng của 10 chủng Microcystis trờn mụi trƣờng J
Thời gian (ngày)
Ký hiệu chủng giống (Số lƣợng tế bào ì106
/ml) LT1 LT2 LT3 LT4 LT5 LT6 LT7 LT8 LT9 LT10 3 2,27 4,08 3,56 3,98 2,32 3,92 1,84 4,58 2,32 4,28 7 5,36 8,42 7,42 8,26 5,18 9,25 4,92 9,46 5,76 8,88 11 16,68 21,39 19,98 20,16 15,36 24,56 15,28 25,24 17,20 23,62 15 43,64 43,86 41,48 40,68 39,82 45,79 40,42 46,48 43,56 50,69 19 40,29 76,46 66,36 68,48 48,7 72,69 36,28 74,76 38,78 69,79 23 36,87 64,54 62,75 63,69 43,62 67,84 32,86 68,36 34,56 64,44
Hỡnh 3.17. Sinh trƣởng của cỏc chủng Microcystis trong mụi trƣờng dịch thể J
Hỡnh 3.18. Cỏc chủng Microcystis phỏt
triển tốt trong mụi trƣờng dịch thể J
Bảng 3.3. Khả năng sinh trƣởng của cỏc chủng Microcystis trờn mụi trƣờng B12
Thời gian (ngày)
Ký hiệu chủng giống (Số lƣợng tế bào ì106
/ml) LT1 LT2 LT3 LT4 LT5 LT6 LT7 LT8 LT9 LT1 3 5,26 6,88 5,69 4,98 4,82 5,46 3,89 6,63 3,82 4,36 7 19,64 22,48 21,12 25,26 15,96 19,72 14,32 18,46 15,57 12,44 11 38,82 42,69 39,88 52,44 35,36 44,12 35,98 35,56 37,28 33,49 15 35,56 49,66 46,48 48,32 33,26 50,29 30,52 54,78 33,54 43,48 19 33,22 36,45 42,46 43,46 28,72 41,36 26,28 44,96 28,26 37,89 23 21,4 28,6 27,0 32,8 22,0 34,2 18,6 33,4 18,2 22,4 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hỡnh 3.19. Sinh trƣởng của cỏc chủng Microcystis trong mụi trƣờng dịch thể
B12
Hỡnh 3.20. Cỏc chủng Microcystis phỏt
triển tốt trong mụi trƣờng dịch thể B12
Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy cỏc chủng Microcystis sinh trƣởng trờn mụi
trƣờng Bold 3N, mật độ tế bào của cỏc chủng đạt từ 32,94 – 68,6 ì 106 sau 15 đến 19 ngày nuụi cấy. Đặc biệt chủng LT2 mật độ tế bào đạt cao nhất 68,6 ì 106 /ml sau ngày thứ 19.
Ở bảng 3.2 cho thấy cỏc chủng Microcystis sinh trƣởng trờn mụi trƣờng J,
mật độ tế bào của cỏc chủng đạt từ 40,42 – 76,46 ì 106 /ml sau 15 đến 19 ngày nuụi cấy. Trong đú chủng LT2 vẫn phỏt triển với mật độ tế bào đạt cao nhất 76,46 ì 106 /ml sau ngày thứ 19.
Ở bảng 3.3 cho thấy cỏc chủng Microcystis sinh trƣởng trờn mụi trƣờng
B12, mật độ tế bào của cỏc chủng đạt từ 35,36 – 54,78 ì 106/ml sau 12 đến 15 ngày nuụi cấy. ở mụi trƣờng này chủng LT8 phỏt triển với mật độ tế bào đạt cao nhất 54,78 ì 106/ml sau ngày thứ 15.
Từ những kết quả trờn, chỳng tụi nhận thấy khả năng sinh trƣởng của cỏc chủng khỏc nhau là khỏc nhau. Hai chủng LT2 và LT8 đều phỏt triển tốt nhất trờn cỏc mụi trƣờng dịch thể và thời gian sinh trƣởng của chỳng chỉ trong 15 ngày, do đú, chỳng tụi lựa chọn 2 chủng này để tiếp tục nuụi thu sinh khối cho những nghiờn cứu tiếp theo.
3.2.4. Thành phần acid bộo trong tế bào của 2 chủng LT2 và LT8
Bản chất húa học của cỏc chất dự trữ và thành tế bào của vi tảo đúng vai trũ quan trọng trong việc phõn biệt cỏc nhúm vi tảo khỏc nhau. Trong nghiờn cứu này
chỳng tụi tiến hành phõn tớch thành phần acid bộo của 2 chủng LT2 và LT8 trờn mỏy sắc ký khớ.
Kết quả đƣợc trỡnh bày ở bảng 3.4
Bảng 3.4. Thành phần acid bộo cú trong tế bào của 2 chủng LT2 và LT8
STT Thành phần cỏc acid bộo Lƣợng acid bộo cú trong tế bào (àg/mg mẫu)
LT2 LT8
1 Myristic acid ( C14H28O2) 0,01572 0,01566
2 Palmitoleic acid (C16H30O2) 0,0133 0,272
3 Palmitic acid (C16H32O2) 1,302 0,9683
4 6,9,12- Octadecatrienoic acid (γ - Linolenic, GLA) (C18H30O2)
0,0906 0,1458
5 9,12- Octadecadienoic acid (Linoleic) (C18H32O2)
0,1926 0,1787
6 12- Octadecenoic acid (Oleic) (C18H34O2)
0, 0822 0,0718
7 Octadecanoic acid (Stearic) (C18H36O2)
0,1574 0,0577
Bảng 3.4 cho thấy kết quả phõn tớch thành phần acid bộo của 2 chủng Microcystis LT2 và LT8 cú 7 loại acid bộo no và khụng no từ C14 đến C18, trong (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
đú thành phần acid palmitic (C16H32O2) chiếm lƣợng lớn nhất với 1,302 àg/mg trọng lƣợng khụ ở chủng LT2 (74% tổng số acid bộo) và 0,9683 μg/mg ở chủng LT8 (56%). Cỏc acid bộo khụng no chỉ chiếm tỉ lệ thấp. Đõy cú thể là đặc điểm của chi Microcystis. Nhỡn chung hai chủng LT2 và LT8 cú hàm lƣợng acid bộo tƣơng đối giống nhau, chỉ khỏc nhau cơ bản ở hàm lƣợng acid palmitoleic và acid stearic.
3.2.5. Xỏc định và phõn tớch trỡnh tự rADN 16S
Ở đõy ngoài việc phõn loại 2 chủng LT2 và LT8 bằng phƣơng phỏp truyền thống dựa trờn cỏc đặc điểm hỡnh thỏi, nuụi cấy, đặc điểm sinh lý, cả hai chủng LT2 và LT8 này đều thuộc chi Microcystis. Để xỏc định rừ 2 chủng thuộc loài nào của chi Microcystis chỳng tụi tiến hành phõn loại theo phƣơng phỏp sinh học phõn tử dựa trờn phõn tớch giải trỡnh tự rADN 16S. Đõy khụng phải là một cụng việc đơn giản và mỏy tớnh sẽ giỳp ta hoàn toàn cỏc tớnh toỏn cần thiết để tối thiểu hoỏ số khoảng trống và cỏc lỗi bắt cặp sai của cỏc trật tự đƣợc so sỏnh. Sự phõn loại dựa vào quỏ trỡnh phõn tớch mối quan hệ dựa trờn ADN trong tiến hoỏ của phõn loại
chủng loại phỏt sinh hoặc dựa vào những đặc điểm tƣơng tự nhau trong phõn loại hỡnh thỏi đều đƣợc thể hiện ở những sơ đồ dạng cõy gọi là cõy phả hệ. Cõy phả hệ cho phộp nhận biết mối quan hệ di truyền giữa cỏc loài và giữa cỏc chủng cựng loài. Sử dụng Cluxtal 18.1 và chƣơng trỡnh điện toỏn MEGA 2.1 cựng cỏc thụng số tiến hoỏ cần thiết cho thấy mối quan hệ đó đƣợc thiết lập trờn cơ sở phõn tớch phõn đoạn, so sỏnh giữa cỏc vựng bảo toàn của những đoạn gen rADN 16S.
Hỡnh 3.21. Cõy phả hệ dựa trờn phõn tớch giải trỡnh tự rADN 16S của 2 chủng LT2,
LT8 và cỏc loài cú quan hệ họ hàng gần
Cõy phả hệ (hỡnh 3.21) cho thấy mối quan hệ gần giữa chủng LT2 (đoạn gen 456bp) và LT8 (đoạn gen 457bp) với 13 trật tự nucleotit của cỏc chủng thuộc Cyanobacteria trong ngõn hàng dữ liệu gen. Chỳng nằm trờn cựng một nhỏnh và cựng nhúm với loài Microcystis aeruginosa EU078503 với độ tƣơng đồng là 100% (chủng LT2) và 99% (chủng LT8).
Cõy phả hệ vẽ theo phƣơng phỏp neighbour joining thƣớc đo = 0,05 Knor trong trỡnh tự nucleotid. Cỏc giỏ trị hiển thị tại cỏc nhỏnh cõy là kết quả phõn tớch boostrap với độ lập lại 1000 (với những giỏ trị >50% mới đƣợc thể hiển trờn cõy).
Sự khỏc biệt giữa 2 chủng là khụng đỏng kể và nằm trong phạm vi khỏc biệt cựng loài (conspecific variation). Dựa vào cỏc kết quả phõn tớch đặc điểm sinh lý,
Lyngbya majusculaAF510964
Lyngbya majusculaAF510965
Anabaena circinalisEU780160
Anabaena circinalis EU780161
Anabaena circinalisEU078518
88
100 100
Microcystis aeruginosaAB023261
96
Microcystis ichthyoblabeAB012338
Microcystis viridisAY121357
Microcystis viridisAY065976
100
Microcystis wesenbergiiAB038538
100
LT8 LT2
Microcystis aeruginosaEU078503
100
Microcystis aeruginosa EU078504
100
100 87 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
73
0.005
hoỏ và cõy phả hệ cho thấy chỳng cú nhiều đặc điểm chung vỡ vậy 2 chủng LT2 và LT8 đều thuộc loài Microcystis aeruginosa.
3.3. TÁCH CHIẾT ĐỘC TỐ MICROCYSTIN
Chỳng tụi tiến hành tỏch chiết độc tố microcystin theo phƣơng phỏp nhƣ đó miờu tả ở phần phƣơng phỏp (mục 2.2.5).
3.3.1. Sắc ký bản mỏng (TLC)
Hỡnh 3.22. Kết quả chạy TLC
trƣớc khi nhuộm nihyđrin
Hỡnh 3.23. Kết quả chạy TLC sau khi nhuộm
nihyđrin
Từ kết quả ở hỡnh 3.22 và 3.23 ta thấy trờn bản silicagel chạy mẫu tỏch chiết microcystin xuất hiện cỏc băng tƣơng đồng với băng MC chuẩn. Điều đú chứng tỏ sự cú mặt của độc tố trong mẫu chiết. Dựa vào kết quả này, chỳng tụi tiến hành phõn tớch và xỏc định hàm lƣợng microcystin trong dịch chiết trờn mỏy quang phổ và sắc ký lỏng cao ỏo HPLC.
3.3.2. Xỏc định hàm lƣợng microcystin trờn mỏy quang phổ
Cỏc băng chứa microcystin của dịch chiết chạy trờn sắc ký bản mỏng đƣợc cạo và tỏi chiết rỳt bằng methanol 80%. Sau đú lọc qua cột C18, lấy 1ml dịch lọc, pha loóng 7000, 8000, 9000 lần. Đem cỏc dung dịch đú đo trờn mỏy quang phổ ở bƣớc súng 242 nm.
Kết quả đƣợc trỡnh bày ở hỡnh 3.24
Microcystin chuẩn
y = 117.17x R ² = 0.967 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 0 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 Nồng độ m ic roc ystin G iỏ t r ị O D ( 2 4 2 n m ) Hỡnh 3.24. Đồ thị đƣờng chuẩn microcystin
Dựa vào phƣơng trỡnh đƣờng chuẩn microcystins y = 117,17x và giỏ trị mật độ quang đo đƣợc của dịch pha loóng trờn mỏy quang phổ, xỏc định đƣợc hàm lƣợng microcystin trong dịch chiết chủng LT2 là 102,4ng/ml và chủng LT8 là 108,8ng/ml.
3.3.3. Hàm lƣợng microcystin trờn sắc ký lỏng cao ỏp (HPLC)
Dung dịch sau khi lọc qua cột C18, tiếp tục đƣợc lọc qua màng lọc. Sau đú, cho bay hơi bằng dũng khớ nitrogen tới 50àl. Mẫu đƣợc phõn tớch trờn mỏy sắc ký lỏng cao ỏp tại bƣớc súng 242 nm. Dựng microcystin của hóng Sigma, làm chất chuẩn.
Hỡnh 3.25a. Sắc ký đồ microcystin RR chuẩn
Hỡnh 3.25c . Sắc ký đồ microcystin LR chuẩn
Hỡnh 3.25e. Sắc ký đồ microcystin của chủng LT8
Nhỡn vào kết quả sắc ký đồ của dịch chiết trờn HPLC, trờn sắc ký đồ thấy xuất hiện cỏc cột biểu hiện đặc trƣng của độc tố microcystin. Trong biểu đồ, cú sự xuất hiện của cỏc cột với thời gian lƣu là 4,776 phỳt, 7,409 phỳt, 10,422 phỳt gần tƣơng ứng với thời gian lƣu của MC - RR, YR, LR chuẩn, chứng tỏ trong dịch chiết cú chứa cả ba loại độc tố. Ngoài cỏc cột đặc trƣng này cũn xuất hiện cỏc đƣờng cột khỏc là cỏc cột của dung mụi. Dựa vào diện tớch cột xỏc định đƣợc hàm lƣợng của cỏc thành phần độc tố nhƣ sau
Bảng 3.5. Hàm lƣợng microcystin của 2 chủng LT2 và LT8 Ký hiệu chủng Lƣợng MC- RR Lƣợng MC – YR Lƣợng MC - LR Thời gian Vựng xuất
hiện cột Thời gian Vựng xuất hiện cột Thời gian Vựng xuất hiện cột
LT2 4‟715 29,705 7‟378 26,570 10‟27 30,460 Lƣợng MC (ng/mg trọng lƣợng khụ) 474,3 132,6 114,1 LT8 4‟76 31,450 7‟488 27,140 10‟422 30,450 Lƣợng MC (ng/mg trọng lƣợng khụ)