2.1.1. Đối tƣợng nghiờn cứu
Đối tƣợng nghiờn cứu bao gồm:
- Vi khuẩn lam Microcystis đƣợc phõn lập từ hồ Hoàn Kiếm - Vi khuẩn Sphingomonas đƣợc phõn lập từ hồ Hoàn Kiếm
2.1.2. Địa điểm và thời gian nghiờn cứu
Địa điểm thu mẫu: Hồ Hoàn Kiếm
Thời gian tiến hành nghiờn cứu: Từ thỏng 1/2007 đến thỏng 12/2008 tại phũng Cụng nghệ Tảo và Sinh học Mụi trƣờng, Viện Vi sinh vật và Cụng nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội.
Thời điểm thu mẫu: Thu mẫu vào hai đợt. Đợt 1: 6/3/2007, Đợt 2: 8/5/2007 Vị trớ cỏc điểm thu mẫu: thu mẫu tại 6 điểm nhƣ trong hỡnh sau.
Hỡnh 2.1. Sơ đồ vị trớ thu mẫu
D1: Cửa cống hàng Khay D2: Đối diện ngõn hàng Incombank – Lờ Thỏi Tổ D3: Ngõn hàng ANZ D4: Nhà hàng thủy tạ
D5: Cửa cống đối diện tổng cụng ty điện lực Việt Nam
2.1.3. Mỏy múc, dụng cụ
Sử dụng mỏy múc và dụng cụ cú tại phũng Cụng nghệ Tảo và Sinh học mụi trƣờng, cỏc phũng thớ nghiệm thuộc Viện Vi sinh vật và Cụng nghệ Sinh học- Đại học Quốc Gia.
Trung tõm Cụng nghệ Mụi trƣờng và Phỏt triển bền vững- Đại học Khoa học Tự nhiờn.
Kớnh hiển vi quang học (Olympus, Nhật Bản)
Kớnh lỳp quan sỏt khuẩn lạc (Olympus, Nhật Bản)
Mỏy đo pH (Osi, Phỏp)
Mỏy sắc ký lỏng cao ỏp (High Performance Liquid Chromatography, HPLC 1100, Đức)
2.1.4. Húa chất
Húa chất dựng cho phõn tớch và thử nghiệm khi tiến hành đề tài gồm:
Húa chất Xuất xứ Húa chất Xuất xứ
CH3COONa Merk, Đức Nihyđrin Merk, Đức
Methanol Merk, Đức n- butanol Merk, Đức
Isopropanol Merk, Đức Ethyl axetat Merk, Đức
Hoỏ chất dựng trong phản ứng PCR:
Trỡnh tự cỏc đoạn mồi dựng trong nghiờn cứu :
27f 5‟ - TTGATCCTGGCAG - 3‟
780f 5‟ - GATTAGATACCCTGGTAG - 3‟ 920r 5‟ - GTCAATTCCTTTGAGTTT - 3‟ 1525r 5‟ - AAAGGAGGTGATCCAGCC - 3‟
10 Taq buffer dNTP mix 2.5mM
2.1.5. Mụi trƣờng nuụi cấy vi khuẩn lam và vi khuẩn
Nuụi vi khuẩn lam Microcystis trờn 6 loại mụi trƣờng là Bold 3N, B12, J, BG11, C, MA (Phụ lục 1)
Nuụi cấy vi khuẩn Sphingomonas trờn 2 mụi trƣờng NA và M7 (Phụ lục 2). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
2.2.1. Phƣơng phỏp điều tra thu mẫu vi khuẩn lam ở hồ Hoàn Kiếm và đỏnh giỏ chất lƣợng nƣớc giỏ chất lƣợng nƣớc
- Điều tra thu mẫu theo quy phạm của Bộ Tài nguyờn và Mụi trƣờng.
- Cỏc chỉ tiờu đƣợc phõn tớch dựa theo „Standard methods for the examination of water and waste water‟ của tổ chức Y tế Mỹ (Phụ lục 3).
2.2.2. Phƣơng phỏp phõn lập và nuụi cấy vi khuẩn lam Microcystis 2.2.2.1. Làm giàu mẫu 2.2.2.1. Làm giàu mẫu
Phƣơng phỏp phõn lập Microcystis bƣớc 1 làm giàu mẫu [31].
Quan sỏt nƣớc nở hoa ở hồ Hoàn Kiếm ở thời điểm thu mẫu cho thấy loài chủ yếu trong quần xó là Microcystis aeruginosa chiếm trờn 80%. Hỳt 1000 àl mẫu nƣớc hồ cú cỏc loài vi khuẩn lam khỏc nhau, cho vào ống Eppendorf, ly tõm 7000vũng/phỳt trong 10 phỳt và rửa 2 lần với dung dịch muối sinh lý 0,05% nhằm mục đớch loại bỏ bớt cỏc loài tảo khỏc.
Lớp dịch nổi bờn trờn là vi khuẩn lam, sau đú hỳt 100 àl dịch nổi bờn trờn cho vào nuụi cấy trong cỏc bỡnh tam giỏc dung tớch 500 ml chứa 200 ml mụi trƣờng B12. Nuụi giữ trong điều kiện nhiệt độ 30oC dƣới ỏnh sỏng đốn neon với cƣờng độ ỏnh sỏng là 1500lux theo quang chu kỳ là 12 giờ chiếu sỏng và 12 giờ tối. Sau thời gian 3 tuần nuụi cấy, quan sỏt khả năng sinh trƣởng của mẫu vi khuẩn lam đó đƣợc làm giàu bằng kớnh hiển vi quang học ở độ phúng đại 400 – 1000 lần.
2.2.2.2. Phương phỏp tỏch và thuần khiết trờn thạch đĩa
Quy trỡnh phõn lập đƣợc tiến hành theo phƣơng phỏp của Shirai cú cải tiến [31]. Cỏc tập đoàn vi khuẩn lam sau khi làm giàu đƣợc xỏc định dƣới kớnh hiển vi là
cỏc chủng thuộc chi Microcystis trong mẫu nƣớc đƣợc ly tõm 10.000 vũng/phỳt
trong 15 phỳt nhằm tiếp tục loại bỏ cỏc loài tảo khỏc. Tập đoàn vi khuẩn lam nổi phớa trờn đƣợc hỳt ra, đặt vào đĩa petri và tỏch riờng rẽ từng tập đoàn ra dƣới kớnh lỳp Olympus. Cỏc tập đoàn đú đƣợc hỳt riờng vào từng ống Eppendorf, sau đú tiếp tục sử dụng mỏy vortex mẫu nhằm mục đớch phõn tỏch tập đoàn thành cỏc tế bào riờng rẽ. Pha loóng mẫu theo phƣơng phỏp của Bold và cấy trang trờn cỏc mụi trƣờng dinh dƣỡng agaroza cú nhiệt độ tạo gel cực thấp (type IX, Sigma) với nồng độ 0,4%, cỏc hộp đĩa thạch đƣợc quấn kớn bằng paraphin và đặt dƣới đốn neon với cƣờng độ ỏnh sỏng 1000 – 1500 lux ở nhiệt độ 30oC. Sau thời gian từ 07 – 30 ngày, quan sỏt khuẩn lạc bằng kớnh lỳp Olympus. Những khuẩn lạc sạch sau khi mọc trờn mụi trƣờng thạch agaroza đƣợc tỏch sang cỏc lọ Penicillin chứa 5ml mụi trƣờng dịch thể. Theo dừi sự phỏt triển của tế bào vi khuẩn lam, quy trỡnh đƣợc tiến hành lặp đi lặp lại cho đến khi thu đƣợc cỏc chủng thuần khiết.
2.2.3. Phõn loại vi khuẩn lam Microcystis 2.2.3.1. Bằng phương phỏp hỡnh thỏi 2.2.3.1. Bằng phương phỏp hỡnh thỏi
Cỏc chủng Microcystis sau khi đó phõn lập thuần khiết đƣợc quan sỏt dƣới
kớnh hiển vi quang học Olympus cú độ phúng đại 400-1000 lần để quan sỏt cỏc đặc điểm hỡnh thỏi và kớch thƣớc tế bào của chỳng. Để định loại, chỳng tụi sử dụng cỏc tài liệu chớnh sau:
- Phõn loại thực vật học bậc thấp .
- Phõn loại Vi khuẩn lam ở Việt Nam [07].
- The on-line database of Cyanobacterial genera [27].
2.2.3.2 . Phương phỏp tỏch ADN
ADN đƣợc chiết xuất và tỏch từ sinh khối ƣớt theo phƣơng phỏp [44]. Lấy 3 vũng que cấy sinh khối tế bào sau 14 giờ nuụi, ly tõm lạnh ở 4oC với tốc độ 8000 vũng trong15 phỳt và rửa 2 lần bằng 300àl dung dịch muối EDTA pH 8,0 (0,5M Na2EDTA, 0,15M NaCl). Sau đú tạo dịch huyền phự trở lại trong 200àl đệm 10 x TE (10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8,0, tỷ lệ mẫu:đệm, 1: 2). Bổ sung 10àl của
lyzozym (Sigma, 1mg/ml Lysozym), giữ ở 37oC trong nồi cỏch thuỷ trong 15 phỳt. Bổ sung dung dịch Tris-SDS (0,1M Tris-HCl pH 9,0 và 1% SDS) với thể tớch bằng thể tớch mẫu. Dịch mẫu đƣợc giữ ở 60oC trong nồi cỏch thuỷ khoảng 10-30 phỳt. Sự tan tế bào đƣợc xỏc định bằng sự trong suốt của dung dịch cựng với sự tăng độ nhớt tƣơng ứng. Dịch tan tế bào đƣợc làm lạnh trong đỏ trong 10 phỳt, bổ sung 150àl cloroform-isoamyl alcohol, 24:1, v/v (giữ ở 4oC) với thể tớch bằng 1/3thể tớch mẫu. Ly tõm lạnh ở 4oC với tốc độ 10.000 vũng trong 20 phỳt để phõn lớp. Sau đú chuyển phần nhớt ở phần đầu sang Eppendorf (Cỡ. 1,5ml) mới và ADN đƣợc tỏch ra bằng bổ sung etanol lạnh (etanol 95,5% giữ ở-22oC) với thể tớch gấp đụi thể tớch mẫu và 2àl của 3M Na acetate (pH=4,5).
Ngõm ADN trong 100àl ethanol 70% trong 30 phỳt và sau đú ngõm liờn tiếp trong ethnol 80, 90, 95% cho mỗi nồng độ trong 5 phỳt. Sợi ADN làm khụ bằng nhiệt độ phũng trong 10 phỳt và đƣợc làm tan trở lại trong 20àl đệm 0,1 x TE (10 x TE) ở 4oC qua đờm.
Dịch đem phõn tớch bằng mỏy quang phổ kế ở cỏc bƣớc súng 230, 260 và 280nm. ADN hấp thụ rất nhanh ở bƣớc súng 260nm. ở bƣớc súng 280 chứng tỏ sự cú mặt của protờin. Bƣớc súng 230nm biểu hiện sự cú mặt của chất đệm, cỏc muối nhƣ EDTA và của ARN. Cỏc tỷ lệ chuẩn về hấp thụ của ADN ở cỏc bƣớc súng 230 : 260 : 280 là 1,0 : 0,45 : 0,515. Hàm lƣợng ADN đƣợc tớnh nhƣ sau: 1 đơn vị OD (mật độ quang, Optical Durity) ở 260nm tƣơng đƣơng với 50àg/ml ADN.
Cỏch tớnh: Đơn vị mẫu x độ loóng x chỉ số/1000 = ADN àg/àl.
Nếu ADN chƣa sạch cần khử protein và ARN bằng enzym proteaza K và RNazaA
2.2.3.3. Húa phõn loại phõn tớch thành phần acid bộo
Lấy 50mg mẫu cho vào ống thủy tinh nỳt vặn (cỡ 13mm x 100mm) [32]. Alkal húa bằng 1.0ml chất phản ứng I (reagent I, gồm 15g sodium hydroxide (NaOH), 50ml methanol và 50ml Milli- Q). Tế bào đƣợc thủy phõn ở 1000C tại nồi nhiệt khụ trong 5 phỳt. Sau đú làm huyền phự bằng mỏy Vortex trong 5 giõy rồi tiếp tục cho thủy phõn trong 25 phỳt. Dịch thủy phõn đƣợc làm lạnh ở nhiệt độ phũng.
Methyl húa dung dịch Alkal với 0.2ml chất phản ứng 2 (65ml 6N hydrochloric acid và 55ml methanol). Sau khi metyl húa, giữ ở 800C trong nồi cỏch thủy khoảng 10 phỳt. Dung dịch methyl húa đƣợc bổ sung 1.25ml của chất thử 3 (gồm 50ml n- hexane-methyl tert butyl ether, 1:1, v/v) và đƣợc trộn đều bằng mỏy lắc 2000rpm trong 10 phỳt. Dịch nhớt phớa trờn đƣợc loại bỏ. Dung dịch đƣợc bổ sung 3ml thuốc thử 4 (1.2g sodium hydroxide trong 100ml Milli-Q) và đƣợc trộn đều bằng tay trong 5 phỳt. Ly tõm ở 2500rpm trong 10 phỳt. Dịch trờn cựng đƣợc chuyển sang ống thủy tinh mới cú nỳt vặn và cho bay hơi bằng khớ nitrogen thụng thƣờng tới khi khụ. Cuối cựng, toàn bộ dịch mẫu đƣợc làm tan với 50àl của diethyl ether 300 (hoặc acetone – 300, n-hexane). Toàn bộ mẫu đƣợc chấm vào sắc ký bản mỏng (TCL) rồi đƣợc đặt trong bồn thủy tinh chứa 100ml n-hexane-diethyl ether (4:1,v/v) trong 30 – 45 phỳt. Thành phần acid bộo đƣợc hiờn vệt bằng iot trong 30 – 45 phỳt. Acid bộo cú cực và khụng cực xuất hiện nhƣ những vệt xanh. Những vệt đƣợc cạo và rửa giải hai lần bằng diethyl ether 300. Trộn đều dung dịch silicagel trờn mỏy lắc 2000rpm trong 10 phỳt và ly tõm 2500rpm trong 5 hoặc 10 phỳt. Dung dịch đƣợc bay hơi bằng khớ nitrogen thụng thƣờng tới khi khụ mẫu. Mẫu đƣợc hũa tan trở lại với 50àl chất phản ứng 3. Dựng pipet nhỏ vào lọ nhỏ GC cú nỳt đậy. Sau đú, đem phõn tớch trờn mỏy sắc ký khớ (gas chromatography).
2.2.4. Xỏc định mật độ tế bào
Số lƣợng tế bào vi khuẩn lam trong một thể tớch nƣớc đƣợc xỏc định bằng cỏch đếm số tế bào trờn 400 ụ nhỏ thuộc 25 ụ lớn của buồng đếm Goriaev. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Một ụ lớn của buồng Goriaev cú diện tớch 1/25 mm2 và chiều cao 1/10 mm. Nhƣ vậy thể tớch của 1 ụ là 1/25 ì 1/10 (mm3), thể tớch của 25 ụ lớn là: 1/25 ì 1/10 x 25 (mm3)
Nếu a là số lƣợng tế bào vi khuẩn lam đếm đƣợc trờn buồng đếm thỡ số lƣợng tế bào tảo trong 1 ml là:
2.2.5. Phƣơng phỏp tỏch chiết độc tố microcystin từ tế bào của Microc ystis
Trong thớ nghiệm của chỳng tụi, microcystin của Microcystis đƣợc tỏch chiết theo phƣơng phỏp đụng tan [44]. Thu sinh khối bằng cỏch ly tõm với tốc độ 7000 vũng/20 phỳt sau đú lọc dịch nổi bằng thiết bị lọc GF/C (Whatman). Dịch nổi đƣợc lọc qua màng lọc kớch thƣớc 0,2 μm (Milipore). Sinh khối thu đƣợc đụng khụ ở nhiệt độ – 83oC, chiết rỳt độc tố bằng Methanol : nƣớc cất (80:20) và bằng Methanol : n.Hexan (85:15). Lọc qua cột C18 để loại bỏ sắc tố chiết từ tế bào
Microcystis. Dịch chiết lỏng đƣợc giữ trong catrid Sep-Pak (Water) và rửa bằng
dung dịch methanol 20%. Dịch chiết đƣợc chạy qua sắc ký bản mỏng (TLC) để làm sạch độc tố, cạo phần độc tố trờn bản TLC. Microcystin sau đú đƣợc tỏch ra nhờ xử lý với 3 ml methanol 90%, đem sấy khụ qua dũng khớ nitrogen và hoà tan trong một lƣợng nhỏ hỗn hợp nƣớc- ethanol 20%. Thành phần và nồng độ của dịch chiết đƣợc xỏc định bằng mỏy HPLC (Hewlett Packard model 1100 LC) qua cột ODS II (4,6 mm; 150 mm) với methanol chứa 0,05 M phosphatase, pH 3 (tỷ lệ 6:4 theo thể tớch), tỏch trong pha động.
2.2.6. Phƣơng phỏp xỏc định hàm lƣợng trờn mỏy quang phổ
Độc tố microcystin đƣợc phõn tớch trờn mỏy quang phổ theo phƣơng phỏp [28 ]. Hàm lƣợng microcystin đƣợc tớnh toỏn theo phƣơng trỡnh đƣờng chuẩn thu đƣợc của microcystin chuẩn. Dựa vào đồ thị chuẩn của microcystin theo mật độ quang, xỏc định hàm lƣợng microcystin cú trong dịch chiết.
Phương phỏp xõy dựng đường chuẩn hàm lượng microcystin theo mật độ quang: Dịch chiết MC - LR chuẩn cú nồng độ 10ng/ml đƣợc pha loóng gấp 1000,
3000, 5000, 7000, 9000, 11000 lần với hỗn hợp dung mụi methanon : nƣớc theo tỷ lệ 80 : 20. Tiến hành đo ở bƣớc súng 242 nm trờn mỏy quang phổ ERMA 11 TOKYO. Căn cứ vào cỏc giỏ trị mật độ quang đo ta lập đƣợc đồ thị biểu thị mối quan hệ với nồng độ dịch chiết microcystin.
2.2.7. Cỏc phƣơng phỏp sắc ký
Là phƣơng phỏp hiệu quả cho việc định tớnh, định lƣợng và tinh sạch cỏc hợp chất hữu cơ. Nguyờn tắc chung của phƣơng phỏp sắc ký là dựa trờn sự phõn bố cỏc
chất giữa hai pha là pha động và pha tĩnh. Pha động cú thể là chất khớ hoặc lỏng để đẩy mẫu qua vựng chứa pha tĩnh. Pha tĩnh chứa chất rắn hoặc lỏng gọi là cỏc hợp chất phụ cú khả năng chứa cỏc chất hũa tan. Mẫu phõn tớch chứa một hay nhiều cấu tử, khi tiếp xỳc với pha tĩnh và pha động cỏc cấu tử khỏc nhau tỏch nhau ra do chỳng cú ỏp lực khỏc nhau với cả hai pha.
2.2.7.1. Phương phỏp sắc ký bản mỏng (TLC)
Việc tỏch cỏc chất trong sắc ký bản mỏng [49] dựa trờn sự phõn tỏch cỏc chất giữa hai pha:
- Pha cố định là chất hấp phụ đƣợc trải rộng trờn một phiến kớnh tạo thành lớp mỏng.
- Pha động là dung mụi thớch hợp đựng trong bỡnh cú nắp đậy kớn.
Trong quỏ trỡnh sắc ký dung mụi di chuyển làm dịch chuyển cỏc thành phần trong mẫu (đó đƣợc chấm thành từng vết trờn phiến kớnh trải chất hấp phụ)
Tiến hành thớ nghiệm:
- Pha mẫu sau cụ quay thành 1ml bằng hỗn hợp dung mụi methanol: nƣớc (80:20), chấm toàn bộ mẫu lờn trờn bản silicagel. Đặt bản mỏng trong bồn thủy tinh chứa 50ml hỗn hợp dung mụi ethyl acetat: isopropanol: nƣớc = 8:5:3 (v/v), trong 45-60 phỳt. Sau khi làm khụ tới nhiệt độ phũng, nhuộm TLC bằng nihydrin 2% trong butanol bóo hũa. Sấy khụ, quan sỏt cỏc vết xuất hiện trờn nền TLC. Sau đú đỏnh dấu, cạo cỏc vết lờn cựng với microcystin chuẩn. Tỏi chiết rỳt độc tố này bằng hỗn hợp dung mụi methanol : nƣớc (80:20). Đem dịch này ly tõm ở tốc độ 8000 vũng/ phỳt, trong 15 phỳt. Sau đú, lọc dịch qua cột C18.
2.2.7.2. Phương phỏp sắc ký lỏng cao ỏp (HPLC)
Sắc ký lỏng cao ỏp [27 ] là phƣơng phỏp chia hỗn hợp cỏc chất trong cột sắc ký trong đú pha động ở trang thỏi lỏng nhờ một ỏp lực lớn đƣợc đẩy qua pha tĩnh Trong HPLC, mẫu phõn tớch đƣợc bơm vào cột sắc ký qua một van bơm sỏu chiều, sau đú nhờ bơm cao ỏp mà pha động đƣợc đẩy qua cột với tốc độ dũng khụng đổi trong suốt thời gian chạy sắc ký. Ở đõy pha động vừa đúng vai trũ là chất mang,
mang mẫu phõn tớch vào cột tỏch, vừa là chất rửa giải trong suốt quỏ trỡnh chạy sắc ký. Pha động cú thể là một dung mụi hữu cơ hoặc hỗn hợp nhiều dung mụi hữu cơ khỏc nhau. Thiết kế hệ thống HPLC gồm:
Tiến hành thớ nghiệm
Mỏy HPLC trờn cột ODS II 4.6mm x 150mm, đƣờng kớnh hạt 5 μm. Bộ lọc dung mụi và bộ lọc mẫu đƣờng kớnh lỗ màng 100Ao. Detector UV-VIS, λ = 242 nm, mỏy vi tớnh ghi tớn hiệu nối với mỏy in.
Pha tĩnh: Supelcosil LC –18
Pha động : Methanol chứa 0,5M phosphate = 6:4 (v/v)
Cỏc mẫu đƣợc hũa tan trong hệ dung mụi của pha động, tiến hành chạy MC chuẩn và mẫu nghiờn cứu. Tốc độ dũng là 1ml/ phỳt, pH = 3.
2.2.8. Phƣơng phỏp nuụi cấy chủng vi khuẩn Sphingomonas
Chủng vi khuẩn Sphingomonas [22] đƣợc phõn lập từ mẫu nƣớc hồ. Lấy 1 ml nƣớc hồ pha loóng ở cỏc nồng độ pha loóng thớch hợp. Nhỏ 1ml dịch pha loóng trờn mụi trƣờng dịch thể NA và M7. Sau 24 giờ nhỏ 100àl dịch cấy trang đều trờn mặt thạch quan sỏt thấy cỏc khuẩn lạc, tỏch và cấy ria nhúm khuẩn lạc cho tỏch nhau riờng rẽ. Tỏch và cấy một khuẩn lạc trờn mụi trƣờng tƣơng ứng. Quỏ trỡnh lặp lại nhiều lần cho đến khi thu đƣợc cỏc chủng thuần khiết. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nuụi giữ chủng vi khuẩn này trờn mụi trƣờng thạch nghiờng, bảo quản ở nhiệt độ 4°C dựng cho cỏc nghiờn cứu tiếp theo.
2.2.9. Phƣơng phỏp xỏc định khả năng phõn giải microcystin
Sự phõn giải đƣợc bắt đầu bằng cỏch bổ sung dịch chiết microcystin thụ vào cỏc mẫu nƣớc vụ trựng để thu đƣợc cỏc nồng độ microcystin khỏc nhau. Cỏc chủng