Là phƣơng phỏp hiệu quả cho việc định tớnh, định lƣợng và tinh sạch cỏc hợp chất hữu cơ. Nguyờn tắc chung của phƣơng phỏp sắc ký là dựa trờn sự phõn bố cỏc
chất giữa hai pha là pha động và pha tĩnh. Pha động cú thể là chất khớ hoặc lỏng để đẩy mẫu qua vựng chứa pha tĩnh. Pha tĩnh chứa chất rắn hoặc lỏng gọi là cỏc hợp chất phụ cú khả năng chứa cỏc chất hũa tan. Mẫu phõn tớch chứa một hay nhiều cấu tử, khi tiếp xỳc với pha tĩnh và pha động cỏc cấu tử khỏc nhau tỏch nhau ra do chỳng cú ỏp lực khỏc nhau với cả hai pha.
2.2.7.1. Phương phỏp sắc ký bản mỏng (TLC)
Việc tỏch cỏc chất trong sắc ký bản mỏng [49] dựa trờn sự phõn tỏch cỏc chất giữa hai pha:
- Pha cố định là chất hấp phụ đƣợc trải rộng trờn một phiến kớnh tạo thành lớp mỏng.
- Pha động là dung mụi thớch hợp đựng trong bỡnh cú nắp đậy kớn.
Trong quỏ trỡnh sắc ký dung mụi di chuyển làm dịch chuyển cỏc thành phần trong mẫu (đó đƣợc chấm thành từng vết trờn phiến kớnh trải chất hấp phụ)
Tiến hành thớ nghiệm:
- Pha mẫu sau cụ quay thành 1ml bằng hỗn hợp dung mụi methanol: nƣớc (80:20), chấm toàn bộ mẫu lờn trờn bản silicagel. Đặt bản mỏng trong bồn thủy tinh chứa 50ml hỗn hợp dung mụi ethyl acetat: isopropanol: nƣớc = 8:5:3 (v/v), trong 45-60 phỳt. Sau khi làm khụ tới nhiệt độ phũng, nhuộm TLC bằng nihydrin 2% trong butanol bóo hũa. Sấy khụ, quan sỏt cỏc vết xuất hiện trờn nền TLC. Sau đú đỏnh dấu, cạo cỏc vết lờn cựng với microcystin chuẩn. Tỏi chiết rỳt độc tố này bằng hỗn hợp dung mụi methanol : nƣớc (80:20). Đem dịch này ly tõm ở tốc độ 8000 vũng/ phỳt, trong 15 phỳt. Sau đú, lọc dịch qua cột C18.
2.2.7.2. Phương phỏp sắc ký lỏng cao ỏp (HPLC)
Sắc ký lỏng cao ỏp [27 ] là phƣơng phỏp chia hỗn hợp cỏc chất trong cột sắc ký trong đú pha động ở trang thỏi lỏng nhờ một ỏp lực lớn đƣợc đẩy qua pha tĩnh Trong HPLC, mẫu phõn tớch đƣợc bơm vào cột sắc ký qua một van bơm sỏu chiều, sau đú nhờ bơm cao ỏp mà pha động đƣợc đẩy qua cột với tốc độ dũng khụng đổi trong suốt thời gian chạy sắc ký. Ở đõy pha động vừa đúng vai trũ là chất mang,
mang mẫu phõn tớch vào cột tỏch, vừa là chất rửa giải trong suốt quỏ trỡnh chạy sắc ký. Pha động cú thể là một dung mụi hữu cơ hoặc hỗn hợp nhiều dung mụi hữu cơ khỏc nhau. Thiết kế hệ thống HPLC gồm:
Tiến hành thớ nghiệm
Mỏy HPLC trờn cột ODS II 4.6mm x 150mm, đƣờng kớnh hạt 5 μm. Bộ lọc dung mụi và bộ lọc mẫu đƣờng kớnh lỗ màng 100Ao. Detector UV-VIS, λ = 242 nm, mỏy vi tớnh ghi tớn hiệu nối với mỏy in.
Pha tĩnh: Supelcosil LC –18
Pha động : Methanol chứa 0,5M phosphate = 6:4 (v/v)
Cỏc mẫu đƣợc hũa tan trong hệ dung mụi của pha động, tiến hành chạy MC chuẩn và mẫu nghiờn cứu. Tốc độ dũng là 1ml/ phỳt, pH = 3.
2.2.8. Phƣơng phỏp nuụi cấy chủng vi khuẩn Sphingomonas
Chủng vi khuẩn Sphingomonas [22] đƣợc phõn lập từ mẫu nƣớc hồ. Lấy 1 ml nƣớc hồ pha loóng ở cỏc nồng độ pha loóng thớch hợp. Nhỏ 1ml dịch pha loóng trờn mụi trƣờng dịch thể NA và M7. Sau 24 giờ nhỏ 100àl dịch cấy trang đều trờn mặt thạch quan sỏt thấy cỏc khuẩn lạc, tỏch và cấy ria nhúm khuẩn lạc cho tỏch nhau riờng rẽ. Tỏch và cấy một khuẩn lạc trờn mụi trƣờng tƣơng ứng. Quỏ trỡnh lặp lại nhiều lần cho đến khi thu đƣợc cỏc chủng thuần khiết.
Nuụi giữ chủng vi khuẩn này trờn mụi trƣờng thạch nghiờng, bảo quản ở nhiệt độ 4°C dựng cho cỏc nghiờn cứu tiếp theo.
2.2.9. Phƣơng phỏp xỏc định khả năng phõn giải microcystin
Sự phõn giải đƣợc bắt đầu bằng cỏch bổ sung dịch chiết microcystin thụ vào cỏc mẫu nƣớc vụ trựng để thu đƣợc cỏc nồng độ microcystin khỏc nhau. Cỏc chủng vi khuẩn phõn giải vi khuẩn lam đƣợc đƣa vào với mật độ 2.5 ì 106
tế bào/ml. Sau 20 phỳt kiểm tra mẫu một lần bằng cỏch lấy 50ml dịch đem lọc qua màng lọc kớch thƣớc 0,22àm, sau đú đem đo ở bƣớc súng 242nm để xỏc định nồng độ độc tố cũn lại. Mẫu đối chứng (khụng cú vi khuẩn) đƣợc tiến hành song song. Cỏc thớ nghiệm
đƣợc lặp lại 3 lần. Hiệu quả phõn giải microcystin đƣợc xỏc đinh nhờ phƣơng phỏp bỏn thời gian nhƣ mụ tả của Kenefick [28]:
Ct = Co.e(-kt)
Trong đú: Ct – nồng độ microcystin tại thời điểm đo (àg/ml) Co – nồng độ microcystin trƣớc phõn hủy (àg/ml)
k – hằng số phõn hủy bậc đầu tiờn (ngày -1)
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. PHÂN TÍCH CÁC CHỈ TIấU THỦY Lí, THỦY HểA NƢỚC HỒ HOÀN KIẾM KIẾM
Đặc điểm của cỏc mựa cú ảnh hƣởng tới cỏc quần thể vi tảo và vi khuẩn lam. nhƣ vi tảo silic kết hợp với việc phỏt triển nhanh roi trong mựa đụng và mựa xuõn, tiếp theo là tảo lục vào cuối mựa xuõn và đầu hố. Tại nơi phỳ dƣỡng và thuỷ vực lớn, vi khuẩn lam thƣờng chiếm ƣu thế trong cỏc loài thực vật nổi vào cuối xuõn đầu hố. Sự thay đổi về mựa là cỏc nhõn tố mụi trƣờng thƣờng khụng đủ để gõy ra sự thay thế vi khuẩn lam bằng cỏc loài thực vật nổi. Vi khuẩn lam là hiện hữu chiếm ƣu thế hầu hết trong năm. Do vậy, để đỏnh giỏ chất lƣợng nƣớc hồ, chỳng tụi đó tiến hành phõn tớch tổng hợp cỏc thành phần và cỏc điều kiện ảnh hƣởng đến nƣớc. Trong nghiờn cứu này, chỳng tụi tiến hành hai đợt thu mẫu vào thỏng 03 và 05 năm 2007.
Kết quả phõn tớch chi tiết đƣợc trỡnh bày ở phụ lục 5.
3.1.1. Nhiệt độ
Nhiệt độ ở một đợt thu mẫu trong cựng một hồ lại khỏc nhau tựy thuộc vào thời gian và địa điểm thu mẫu. Tại cỏc cống dẫn nƣớc thải vào hồ, nhiệt độ nƣớc luụn cao hơn cỏc điểm xa bờ và giữa hồ từ 1- 2°C.
3.1.2. pH
Trong thời gian chỳng tụi thu mẫu, pH của hồ khỏ cao. Giỏ trị pH tại cỏc điểm lấy mẫu dao động từ 9,57- 9,84 vào đợt thu mẫu thỏng 06/03/2007 và từ 9,77- 10,37 vào đợt thu mẫu thỏng 08/05/2007.
3.1.3. Cỏc chất lơ lửng SS
Hàm lƣợng cỏc chất lơ lửng trong hồ tƣơng đối cao, dao động từ 230- 450mg/l trong hai đợt thu mẫu.
3.1.4. Hàm lƣợng oxy hũa tan trong nƣớc (DO- Dissolve oxygen)
Từ số liệu nghiờn cứu cho thấy hàm lƣơng oxy hũa tan trong nƣớc cao, dao động từ 9,42mg/l- 22,4mg/l.
Điều này phự hợp với thực tế là vào thời điểm chỳng tụi tiến hành thu mẫu, trong hồ cú sự nở hoa rất nhiều của vi khuẩn lam Microcystis, chớnh sự quang hợp của những vỏng nở hoa và cỏc loài vi tảo khỏc dẫn tới hàm lƣợng oxy hũa tan trong hồ tăng đỏng kể.
3.1.5. Nhu cầu oxy húa học (COD- Chemical oxygen demand)
Sự dao động giỏ trị COD trong hồ từ 80,85mg/l- 767,20mg/l. Giỏ trị COD cao nhất gấp 20 lần so với tiờu chuẩn Việt Nam loại B về chất lƣợng nƣớc mặt.
3.1.6. Nhu cầu oxy sinh húa (BOD- Biochemical oxygen demand)
Kết quả nghiờn cứu của chỳng tụi cho thấy hàm lƣợng BOD trong hồ dao động thấp nhất là 55 mg/l, cao nhất là 260 mg/l vào thỏng 3, ở thỏng 5 thấp nhất là 100 mg/l, cao nhất là 548 mg/l. Hàm lƣợng BOD5 cao gấp 20 lần so với tiờu chuẩn Việt Nam loại B về chất lƣợng nƣớc mặt.
Những nhận xột chung về nước ở hồ Hoàn Kiếm:
Từ cỏc số liệu phõn tớch đƣợc trong bảng kết quả, cú thể nhận xột hồ đang trong tỡnh trạng ụ nhiễm. Với giỏ trị hàm lƣợng NH4+ dao động 0,129mg/l – 0,699mg/l, NO2- ở khoảng 0.012mg/l – 0,05mg/l, NO3- từ 0,047mg/l – 0,129mg/l và PO43- là 0,08mg/l – 0.64mg/l chứng tỏ nƣớc hồ cú hàm lƣợng dinh dƣỡng khỏ cao. Sự phỏt triển của vi khuẩn lam là quanh năm nhƣng thỏng 5 phỏt triển nhiều hơn thỏng 3 bởi thời tiết thƣờng ấm ỏp hơn. Vi khuẩn lam phỏt triển dày đặc trờn mặt hồ và đặc biệt tập trung ở khu vực cuối hƣớng giú.
3.2. TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN LAM THUỘC CHI
Microcystis PHÂN LẬP ĐƢỢC 3.2.1. Đặc điểm nuụi cấy
Lấy 1 lƣợng mẫu từ cỏc lọ đựng mẫu trong mụi trƣờng nuụi cấy làm giàu, cho vào Eppendorf sạch, ly tõm ở tốc độ 10000 vũng/15 phỳt. Sau đú, tiến hành pha
loóng mẫu ở cỏc nồng độ thớch hợp (10-2; 10-3), nhỏ 100àl mẫu và trang đều trờn 6 loại mụi trƣờng thạch Bold 3N, B12, BG11, C, MA và J. Do M. aeruginosa cú khụng bào khớ (gas vacuoles) nờn chỳng khụng tạo thành khuẩn lạc trờn cỏc loại agar hoặc agarose thụng thƣờng. Tuy nhiờn, điều này cú thể đƣợc khắc phục nhờ kỹ thuật cải tiến của Watanabe [11, 49]. Dịch thể cú chứa M. aeruginosa với mụi
trƣờng sử dụng loại agarose cú nhiệt độ tạo gel cực thấp nồng độ 0,4% (type IX, Sigma) đƣợc sử dụng làm giỏ thể. Cỏc đĩa thạch sau khi cấy đƣợc quấn paraphin, đặt dƣới cƣờng độ ỏnh sỏng 1500 Lux.
Sau 10 ngày quan sỏt khuẩn lạc.
Kết quả đƣợc trỡnh bày ở hỡnh 3.1 ; 3.2 ; 3.3 ; 3.4
Hỡnh 3.1. Hỡnh thỏi khuẩn lạc của Microcystis trờn mụi trƣờng C
Hỡnh 3.2. Hỡnh thỏi khuẩn lạc của Microcystis trờn mụi trƣờng Bold 3N
Hỡnh 3.3. Hỡnh thỏi khuẩn lạc của Microcystis trờn mụi trƣờng B12
Hỡnh 3.4. Hỡnh thỏi khuẩn lạc của Microcystis trờn mụi trƣờng J
Kết quả thử nghiệm cho thấy trờn 3 mụi trƣờng Bold 3N, B12 và J khuẩn lạc của Microcystis cú khả năng mọc tốt hơn so với cỏc mụi trƣờng BG11, C, MA. Ở 3 mụi trƣờng sau, khuẩn lạc Microcystis sau 2 - 4 tuần nuụi mới thấy xuất hiện khuẩn lạc. Điều này cho thấy trờn cỏc mụi trƣờng cơ chất khỏc nhau, dẫn đến khả năng sinh trƣởng của chỳng cũng khỏc nhau.
3.2.2. Phõn lập cỏc khuẩn lạc của Microc ystis
Phõn lập cỏc khuẩn lạc Microcystis trờn cỏc mụi trƣờng nuụi cấy, bƣớc đầu
chỳng tụi thu đƣợc 10 chủng. Cỏc chủng này cú những đặc điểm hỡnh thỏi tế bào đƣợc nghiờn cứu dƣới kớnh hiển vi quang học và đƣợc phỏt triển nuụi cấy trờn cỏc loại mụi trƣờng khỏc nhau. Kết quả đƣợc trỡnh bày ở hỡnh 3.5; 3.6; 3.7; 3.8; 3.9;
3.10; 3.11; 3.12; 3.13; 3.14
Hỡnh 3.5. Hỡnh dạng tế bào chủng Microcystis sp., LT1
Tập đoàn với tế bào hỡnh cầu, tế bào cú màu xanh lam với nhiều khụng bào khớ, đƣờng kớnh tế bào 3-7 μm. Bao nhầy khụng màu, mờ bao quanh tế bào.
Hỡnh 3.6. Hỡnh dạng tế bào chủng Microcystis sp., LT2
Tập đoàn với tế bào hỡnh cầu,tế bào cú màu xanh nhạt, đƣờng kớnh tế bào 2-5 μm, tập đoàn hỡnh dỏng khụng ổn định, cỏc khối nhỏ hỡnh cầu hoặc thấu kớnh hơi dẹt.
Hỡnh 3.7. Hỡnh dạng tế bào chủng Microcystis sp., LT3
Tập đoàn với tế bào hỡnh cầu,tế bào cú màu xanh nhạt, đƣờng kớnh tế bào 2-5 μm, tập hợp thành từng tập đoàn nhỏ.
Hỡnh 3.8. Hỡnh dạng tế bào chủng Microcystis sp., LT4
Tập đoàn với tế bào hỡnh cầu,tế bào cú màu xanh lam với nhiều khụng bào khớ, đƣờng kớnh tế bào 5-7 μm, bao nhầy khụng màu.
Hỡnh 3.9. Hỡnh dạng tế bào chủng Microcystis sp., LT5
Tập đoàn với tế bào hỡnh cầu,tế bào cú màu xanh lam với nhiều khụng bào khớ, đƣờng kớnh tế bào 3-7 μm, bao nhầy khụng màu.
Hỡnh 3.10. Hỡnh dạng tế bào chủng Microcystis sp., LT6
Tập đoàn với tế bào hỡnh cầu,tế bào cú màu xanh nhạt, đƣờng kớnh tế bào 4-7 μm, tập hợp thành từng tập đoàn nhỏ.
Hỡnh 3.11. Hỡnh dạng tế bào chủng Microcystis sp., LT7
Tế bào hỡnh cầu,tế bào cú màu xanh nhạt, đƣờng kớnh tế bào 3-6 μm, tập hợp thành từng tập đoàn nhỏ.
Hỡnh 3.12. Hỡnh dạng tế bào chủng Microcystis sp., LT8
Tập đoàn với tế bào hỡnh cầu,tế bào cú màu xanh lam với nhiều khụng bào khớ, đƣờng kớnh tế bào 5-7 μm, thƣờng sắp xếp dày đặc.
Hỡnh 3.13. Hỡnh dạng tế bào chủng Microcystis sp., LT9
Tập đoàn với tế bào hỡnh cầu,tế bào cú màu xanh nhạt, cỏc khối nhỏ hỡnh cầu đƣờng kớnh tế bào 2-4 μm.
Hỡnh 3.14. Hỡnh dạng tế bào chủng Microcystis sp., LT10
Tập đoàn với tế bào hỡnh cầu,tế bào cú màu xanh lam, cú đƣờng kớnh tế bào 2-4 μm, chứa khụng bào khớ
Kết quả ở hỡnh 3.5; 3.6; 3.7; 3.8; 3.9; 3.10; 3.11; 3.12; 3.13; 3.14 cho thấy đặc điểm hỡnh thỏi của 10 chủng trờn cú nhiều điểm tƣơng đồng, ở chủng LT2
và LT8 đều thấy tập đoàn với tế bào hỡnh cầu, tế bào cú màu xanh lam với nhiều khụng bào khớ bờn trong, đƣờng kớnh tế bào 5-7 àm. Điều này cú thể là do tớnh thớch ứng của từng chủng trong điều kiện mụi trƣờng nuụi cấy. Miờu tả trờn phự hợp với những miờu tả của Watanabe [9, 49].
Tiếp theo chỳng tụi lựa chọn đƣợc những chủng Microcystis mọc nhanh, tốt
trờn cỏc mụi trƣờng dịch thể và tỡm đƣợc thời gian nuụi cấy thớch hợp cho cỏc chủng nhằm thu đƣợc lƣợng sinh khối đủ cho cỏc thớ nghiệm tiếp theo.
3.2.3. Khả năng sinh trƣởng của 10 chủng Microcystis LT1, LT2, LT3, LT4, LT5, LT6, LT7, LT8, LT9 và LT10 trờn cỏc mụi trƣờng khỏc nhau LT5, LT6, LT7, LT8, LT9 và LT10 trờn cỏc mụi trƣờng khỏc nhau
Cỏc khuẩn lạc xuất hiện trờn cỏc đĩa thạch, đƣợc tỏch và kiểm tra độ thuần khiết dƣới kớnh hiển vi. Quỏ trỡnh đƣợc lặp đi lặp lại cho đến khi thu đƣợc chủng thuần khiết.
Cỏc chủng vi khuẩn lam đƣợc tiến hành nuụi trờn 3 mụi trƣờng dịch thể đƣợc chọn lọc đú là Bold3N, J và B12. Tỷ lệ giống ban đầu đƣa vào là 4 ì 105 tb/ml. Cứ 4 ngày lấy mẫu, kiểm tra khả năng sinh trƣởng cho tới khi kết thỳc thời gian sau 23 ngày nuụi cấy.
Bảng 3.1. Khả năng sinh trƣởng của 10 chủng Microcystis trờn mụi trƣờng Bold3N
Thời gian (ngày)
Ký hiệu chủng giống (Số lƣợng tế bào ì106
/ml) LT1 LT2 LT3 LT4 LT5 LT6 LT7 LT8 LT9 LT10 3 1,47 3,09 2,63 3,78 2,32 3,86 1,14 4,46 2,12 3,20 7 4,63 7,66 6,24 8,38 4,98 8,95 3,9 9,16 4,98 6,38 11 15,6 18,9 19,59 21,69 14,06 26,75 16,08 29,84 15,18 20,76 15 36.46 39,8 42,4 41,68 40,82 42,67 32,94 45,62 33,34 48,96 19 32,9 68,6 56,06 60,48 36,7 62,24 26,78 66,46 30,54 45,54 23 28,78 54,8 52,42 53,59 31,86 57,42 22,82 58,74 27,86 40,24
Hỡnh 3.15. Sinh trƣởng của cỏc chủng Microcystis trong mụi trƣờng dịch thể
Bold 3N
Hỡnh 3.16. Cỏc chủng Microcystis phỏt
triển tốt trong mụi trƣờng dịch thể Bold 3N
Bảng 3.2. Khả năng sinh trƣởng của 10 chủng Microcystis trờn mụi trƣờng J
Thời gian (ngày)
Ký hiệu chủng giống (Số lƣợng tế bào ì106
/ml) LT1 LT2 LT3 LT4 LT5 LT6 LT7 LT8 LT9 LT10 3 2,27 4,08 3,56 3,98 2,32 3,92 1,84 4,58 2,32 4,28 7 5,36 8,42 7,42 8,26 5,18 9,25 4,92 9,46 5,76 8,88 11 16,68 21,39 19,98 20,16 15,36 24,56 15,28 25,24 17,20 23,62 15 43,64 43,86 41,48 40,68 39,82 45,79 40,42 46,48 43,56 50,69 19 40,29 76,46 66,36 68,48 48,7 72,69 36,28 74,76 38,78 69,79 23 36,87 64,54 62,75 63,69 43,62 67,84 32,86 68,36 34,56 64,44
Hỡnh 3.17. Sinh trƣởng của cỏc chủng Microcystis trong mụi trƣờng dịch thể J
Hỡnh 3.18. Cỏc chủng Microcystis phỏt
triển tốt trong mụi trƣờng dịch thể J
Bảng 3.3. Khả năng sinh trƣởng của cỏc chủng Microcystis trờn mụi trƣờng B12
Thời gian (ngày)
Ký hiệu chủng giống (Số lƣợng tế bào ì106
/ml) LT1 LT2 LT3 LT4 LT5 LT6 LT7 LT8 LT9 LT1 3 5,26 6,88 5,69 4,98 4,82 5,46 3,89 6,63 3,82 4,36 7 19,64 22,48 21,12 25,26 15,96 19,72 14,32 18,46 15,57 12,44 11 38,82 42,69 39,88 52,44 35,36 44,12 35,98 35,56 37,28 33,49 15 35,56 49,66 46,48 48,32 33,26 50,29 30,52 54,78 33,54 43,48 19 33,22 36,45 42,46 43,46 28,72 41,36 26,28 44,96 28,26 37,89 23 21,4 28,6 27,0 32,8 22,0 34,2 18,6 33,4 18,2 22,4
Hỡnh 3.19. Sinh trƣởng của cỏc chủng Microcystis trong mụi trƣờng dịch thể
B12
Hỡnh 3.20. Cỏc chủng Microcystis phỏt
triển tốt trong mụi trƣờng dịch thể B12
Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy cỏc chủng Microcystis sinh trƣởng trờn mụi
trƣờng Bold 3N, mật độ tế bào của cỏc chủng đạt từ 32,94 – 68,6 ì 106 sau 15 đến 19 ngày nuụi cấy. Đặc biệt chủng LT2 mật độ tế bào đạt cao nhất 68,6 ì 106 /ml sau ngày thứ 19.