3.1.3.1 Chiết cao toàn phần từ cây TBL:
Chiết cao nước tổng bằng phương pháp siêu âm:
Cân 50 g bột toàn cây TBL, cho nước cất vào ngập cách mặt dược liệu khoảng 5 – 6 cm, đem đánh siêu âm ở nhiệt độ 600 – 700C trong 10 phút, sau đó đem lọc thu dịch chiết nước. Làm như vậy cho đến khi dịch chiết gần như không màu. Gộp tất cả dịch chiết lại đem đun cách thủy cho đến khi nước bốc hơi hết ta thu được cao nước tổng.
Chiết cao cồn tổng bằng phương pháp ngấm kiệt:
Cân 2 kg bột toàn cây TBL, làm ẩm bằng cồn 96%. Cho mẫu vào bình ngấm đã lót bông ở đáy, sau đó phủ lên trên nguyên liệu một lớp giấy lọc. Mở khóa rồi cho từ từ cồn vào bình đến khi có vài giọt dung môi bắt đầu chảy ra rồi khóa bình, đổ ngập dung môi cách mặt dược liệu khoảng 5 – 6 cm, ngâm qua đêm. Sau 24 giờ mở vòi rút dịch chiết ra. Tiếp tục châm cồn vào và ngâm 24 giờ tiếp theo, chiết cho đến khi dịch chiết gần như không màu. Gộp tất cả dịch chiết lại đem cô giảm áp cho đến khi bay hết cồn ta thu được cao cồn tổng.
28
3.1.3.2 Tách phân đoạn cao toàn phần:
Cao tổng cồn được thực hiện chiết thành các phân đoạn cao bằng phương pháp chiết lỏng – lỏng.
Hòa tan hoàn toàn cao cồn tổng với nước, đem lắc phân đoạn lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần: ether dầu hỏa, chloroform, ethyl acetat, n- buthanol bão hòa nước.
Lắc thu các phân đoạn cho đến khi không còn chất hòa tan vào dung môi thì đổi sang chiết với dung môi phân cực hơn. Cô giảm áp cho đến khi dung môi bay hết ta thu được 4 phân đoạn cao. Phần dịch nước còn lại sau cùng cũng đem đun cách thủy đến khi cạn nước, thu được cao nước còn lại.
Tóm tắt quy trình như hình 3.1. Bột cây TBL (2kg) Dịch cồn Bã dược liệu Cao cồn tổng Dịch cao cồn Dịch ether Dịch chloroform Dịch ethyl acetat Dịch lắc n - butanol Dịch nước còn lại
Cô giảm áp Cô giảm áp Cô giảm áp Cô giảm áp Cô giảm áp
Cao ether Cao chloroform Cao ethyl acetat Cao n - butanol Cao nước còn lại Ngấm kiệt cồn 96%
Hòa vào nước Cô giảm áp
Lắc phân đoạn
29
3.1.4 Phân tích định tính thành phần hóa học các phân đoạn dịch chiết: [2], [7], [8], [15] [2], [7], [8], [15]
Các phân đoạn dịch chiết ether, chloroform, ethyl acetat, n – buthanol cùng với phần dịch nước còn lại sau khi lắc phân đoạn được đem phân tích định tính sự hiện diện của các nhóm chất chính đã cho kết quả dương tính trong phần khảo sát sơ bộ hóa thực vật bằng các phản ứng hóa học. Các phản ứng hóa học này được tóm tắt như bảng 3.1.
Bảng 3.1: Tóm tắt phản ứng định tính hóa học cao phân đoạn
Nhóm chất Thuốc thử/ Phản ứng Hiện tượng dương tính
Alkaloid Mayer Tủa trắng – vàng nhạt
Bouchardat Tủa đỏ nâu
Dragendorff Tủa đỏ cam
Flavonoid H2SO4 đđ Màu vàng, cam, đỏ, xanh dương
NaOH 1% Màu vàng, cam, đỏ, tím
Cyanidin Lớp trên màu cam, đỏ, tím FeCl3 5% Màu xanh lục – rêu
Anthraquinon Liebermann Màu đỏ
Coumarin KOH 10% + UV365nm Phát huỳnh quang
Tanin Gelatin-muối Tủa bông trắng
Terpenoid Liebermann- Buchard Màu xanh dương, lục, cam, đỏ Rosenthaler Màu lục, tím
Carr- Price Đổi màu
Steroid Salkowski Màu đỏ, xanh, tím
Saponin Lắc mạnh với nước Bọt bền
Saponin triterpen/ steroid
Fontan- Kaudel Bọt như nhau: saponin triterpen Bọt kiềm cao hơn: saponin steroid
30
3.1.5 Phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKLM) [2], [7], [8], [15]
Các phân đoạn cho phản ứng dương tính với các thuốc thử hóa học được tiến hành khai triển sắc ký trên bản mỏng tráng sẵn silicagel 60 F254 (Merck) bằng các hệ dung môi tương ứng như sau:
- Hệ 1: CHCl3:EtOAc (7:3) phân tích cho phân đoạn chloroform.
- Hệ 2: n-buthanol: CH3COOH: H2O phân tích cho phân đoạn chloroform.
- Hệ 3: EtOAc: MeOH: H2O (100:17:13) phân tích cho phân đoạn ethyl acetat.
- Hệ 4: n-buthanol: CH3COOH: H2O (4:1:5) phân tích cho phân đoạn ethyl acetat.
- Hệ 5: EtOAc: HCOH: CH3COOH: H2O (100:11:11:27) phân tích cho phân đoạn n – buthanol.
Bản mỏng đã khai triển được quan sát và ghi nhận hình ảnh dưới đèn UV254 và UV365, sau đó được cho hiện màu với các thuốc thử tương ứng với từng nhóm chất:
- H2SO4 10%/EtOH, sấy 90oC saponin.
- Thuốc thử Liebermann triterpenoid – steroid.
- Thuốc thử anisaldehyd terpenoid.
- FeCl3 10%/EtOH nhóm phenol.
- Xông hơi NH3 nhóm flavonoid.
- KOH 10%/EtOH anthraquinon.
- KOH 10%/EtOH, sấy nhẹ 60oC, soi đèn UV365 coumarin.
31
3.2 Kết quả nghiên cứu hóa học
3.2.1 Tiêu chuẩn hóa nguyên liệu
3.2.1.1 Độ ẩm bột dược liệu
Bảng 3.2: Kết quả độ ẩm bột dược liệu
Kết quả khảo sát như bảng 3.2 cho thấy bột dược liệu TBL có độ ẩm là 12,3 %. Giá trị này nằm trong khoảng độ ẩm cho phép của dược liệu (dưới 13%), trong khoảng cho phép này thì dược liệu có thể được bảo quản tốt, không bị nấm mốc và mối mọt.
3.2.1.2 Độ tro dược liệu:
Tro toàn phần:
Dược liệu thông thường có độ tro toàn phần giới hạn trong khoảng 4 – 12%. Kết quả khảo sát như bảng 3.3 cho thấy độ tro toàn phần của TBL (14,1%) khá cao so với tiêu chuẩn trên. Điều này cho thấy có khả năng trong TBL có tích tụ khá nhiều khoáng chất. Trong thực tế, TBL là loài thực vật chịu mặn, thường được phân bố trong môi trường có độ mặn cao nên bên trong cơ thể có thể được tích tụ nhiều muối khoáng nhằm cân bằng áp suất thẩm thấu với môi trường đất xung quanh.
Mẫu Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3
Khối lượng mẫu ban đầu (g) 1,9508 1,9609 1,9761 Khối lượng mẫu lúc sau (g) 1,7146 1,7143 1,7348
Độ giảm (g) 0,2362 0,2466 0,2413
Độ ẩm (%) 12,1 12,6 12,2
32
Bảng 3.3: Kết quả độ tro dược liệu
Tro không tan trong acid:
Bảng 3.4: Kết quả độ tro không tan trong acid
Khoáng chất thông thường trong dược liệu sẽ bị hòa tan bởi acid, riêng silic sẽ không bị hòa tan và còn lại trong mẫu tro sau khi hòa và lọc với HCl. Do đó, tro không tan trong acid chủ yếu là silic. Kết quả bảng 3.4 cho thấy TBL có hàm lượng silic khá cao so với các tiêu chuẩn thông thường (< 4%). Như vậy có khả năng dược liệu còn lẫn đất cát hoặc trong dược liệu có tích tụ nhiều tinh thể silic.
3.2.2 Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật
Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật được trình bày như bảng 3.5.
Mẫu Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3
Khối lượng chén không (g) 25,9313 38,7466 34,7596 Khối lượng của chén có tro (g) 26,1682
39,0023 35,0023 Khối lượng dược liệu dùng (g) 1,9456 2,0431 1,9534
Độ tro toàn phần (%) 13,9 14,3 14,2
Giá trị trung bình (%) ± SD 14,1 ± 0,2121
Mẫu Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3
Khối lượng chén không (g) 25,9313 38,7466 34,7596 Khối lượng của chén có tro
(g) 26,0167 38,8399 34,8485
Khối lượng dược liệu dùng (g)
1,9456 2,0431 1,9534
Độ tro không tan trong HCl (%)
5,0 5,2 5,2
33
Bảng 3.5: Kết quả phân tích sơ bộ hóa thực vật trên nguyên liệu của cây TBL
HỢP CHẤT THUỐC THỬ HIỆN TƯỢNG
LOẠI DỊCH CHIẾT Kết quả định tính chung Dịch chiết ether
Dịch chiết cồn Dịch chiết nước Không thủy phân Thủy phân Không thủy phân Thủy phân
Tinh dầu Cồn 96% Có mùi thơm - - Không
Chất béo
Nhỏ dịch chiết lên giấy
sấy nhẹ Vết trong mờ - Không
Carotenoid
Dd SbCl3 Xanh chuyển sang đỏ +
Có H2SO4 đậm đặc Xanh dương hay xanh lục ngả sang xanh dương +
Triterpenoid Liebermann- Burchard Đỏ nâu-tím, lớp trên có màu xanh lục + - Có
Alkaloid
TT Mayer Tủa trắng- vàng nhạt - -
Nghi ngờ
TT Bouchardat Tủa nâu đỏ - - -
TT Dragendorff Tủa đỏ cam - -
Coumarin Phát huỳnh quang
trong kiềm Phát quang mạnh hơn - + + Có
Anthraquinon NaOH 10% Lớp kiềm có màu hồng đến đỏ - - Nghi
ngờ
34
Ghi chú: (-): Không có; ( ): Nghi ngờ; (+): Có
ngờ
Anthocyanosid HCl 10% Đỏ + -
Có
NaOH 10% Xanh + -
Proanthocyanidin HCl / t0 Hồng đến đỏ - + Có
Tannin FeCl3 5% Xanh rêu hay xanh đen (polyphenol) + +
Có
Dd gelatin muối Tủa bông trắng (tannin) - -
Saponin Nước, lắc mạnh Bọt bền + - Có
Chất khử TT Fehling Tủa đỏ gạch + - Có
Acid hữu cơ Na2CO3 Sủi bọt - - Không
35
Kết quả phân tích sơ bộ cho thấy thành phần hóa thực vật của TBL gồm các hợp chất: carotenoid, triterpenoid, flavonoid, saponin, coumarin, anthocyanosid, proanthocyanidin, tannin và các hợp chất khử. Ngoài ra, alkaloid và anthraquinon cũng có khả năng hiện diện trong cây, nhưng có thể chỉ với hàm lượng thấp. Kết quả này hầu hết cũng tương đồng với kết quả của V. R. Mohan và cộng sự [54] đã nghiên cứu về thành phần hóa thực vật của tất cả thành phần từ cây TBL.
3.2.3 Chiết xuất dược liệu
3.2.3.1 Chiết xuất các dạng cao tổng
Chiết cao nước tổng bằng phương pháp siêu âm:
Tiến hành chiết 50g bột dược liệu TBL bằng nước theo phương pháp siêu âm thu được kết quả trình bày như bảng 3.6.
Hiệu suất chiết bột khô TBL bằng dung môi nước với phương pháp siêu âm là khá cao (21%). Đây có thể là vì nguyên liệu khi được chiết bằng dung môi nước sẽ lôi cuốn theo chủ yếu là các polymer cao phân tử như polysacharid, polypeptid hay protein nên xét về mặt trọng lượng thì có thể khá cao. Vì vậy, giá trị hiệu suất này chỉ mang ý nghĩa làm cơ sở tham khảo khi chiết TBL bằng dung môi nước với một phương pháp chiết khác, không có ý nghĩa khi so sánh với phương pháp chiết bằng cồn cao độ. Đồng thời, cao chiết được bằng phương pháp này cũng sẽ mang thành phần chủ yếu là các polymer kể trên cùng một số hợp chất khác có khả năng tan tốt trong nước như saponin, flavonoid…
Bảng 3.6: Hiệu suất chiết cao tổng nước bằng phương pháp siêu âm
Khối lượng nguyên liệu ban đầu (g) 50
Độ ẩm nguyên liệu (%) 12,3
Khối lượng cao nước tổng (g) 10,43
Độ ẩm cao nước tổng (%) 11,8
36
nên khi khảo sát hoạt tính thì chính những nhóm chất này là hoạt chất chủ yếu quyết định hoạt tính của cao chiết.
Chiết cao cồn tổng bằng phương pháp ngấm kiệt:
2kg bột TBL được chiết ngấm kiệt bằng cồn 96% thu được kết quả như bảng 3.7.
Chiết bột cây TBL với cồn cao độ bằng phương pháp chiết ngấm kiệt có hiệu suất chiết là 7,3%. Giá trị này có ý nghĩa tham khảo để so sánh với các phương pháp chiết khác khi chiết TBL với cồn cao độ bằng các phương pháp chiết khác. Cao tổng cồn thu được bằng phương pháp chiết này sẽ gồm những hợp chất có độ phân cực khác nhau, từ thấp đến cao như: alkaloid, terpenoid, coumarin, anthraquinon, flavonoid, saponin… nhưng sẽ rất ít các thành phần cao phân tử như polysaccharid và polypeptid, protein. Như vậy, ngược lại với cao nước, hoạt tính của dạng cao chiết này sẽ không do polysaccharid hay polypeptid quyết định.
3.2.3.2 Chiết xuất các phân đoạn dịch chiết:
Chiết cao cồn tổng cồn bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần thu được kết quả như bảng 3.8.
Bảng 3.7: Hiệu suất chiết cao tổng cồn bằng phương pháp ngấm kiệt
Khối lượng nguyên liệu ban đầu (g) 2000
Độ ẩm nguyên liệu (%) 12,3
Khối lượng cao cồn tổng (g) 140
Độ ẩm cao cồn tổng (%) 8,0
37
Kết quả cho thấy cao ether dầu chiếm tỷ trọng lớn nhất (24,6%) vì nguyên liệu chiết bao gồm rễ, thân, lá nên hàm lượng chlorophyl khá cao và tất cả đều được tập trung vào phân đoạn này. Phân đoạn ethyl acetat và n-buthanol cũng có tỷ trọng khá cao (14% và 12,5%), có khả năng hầu hết thành phần hóa học của TBL tập trung trong 2 phân đoạn này mà chủ yếu là flavonoid, polyphenol và saponin. Phân đoạn chloroform chiếm tỷ trọng thấp nhất (3,9%), có thể TBL ít các hợp chất kém phân cực như terpenoid, coumarin, alkaloid… Phần dịch nước còn lại chủ yếu là các cao phân tử và chiếm tỷ trọng cũng rất thấp (5,1%) nên có thể còn rất ít các hợp chất tan tốt trong nước sót lại.
3.2.4 Phân tích định tính thành phần hóa học các phân đoạn dịch chiết:
Các phân đoạn dịch chiết thu được từ phương pháp chiết lỏng – lỏng cao cồn tổng với các dung môi có độ phân cực tăng dần được tiến hành khảo sát định tính thành phần hóa học như mục 3.1.4. Kết quả thu được được trình bày như bảng 3.9 và bảng 3.10.
Bảng 3.8: Hiệu suất chiết các cao phân đoạn
Mẫu Khối lượng (g) Độ ẩm (%) Hiệu suất (%)
Cao cồn tổng 140 8,0 100
Cao ether dầu 33,47 5,2 24,6
Cao chloroform 5,47 8,6 3,9
Cao ethyl acetat 19,45 7,5 14,0
Cao n – butanol 17,29 7,0 12,5
38
Bảng 3.9: Kết quả định tính bằng phản ứng hóa học trên các phân đoạn cao
Nhóm chất Thuốc thử Cao ether Cao chloroform Cao ethyl acetat Cao n - Butanol Cao nước còn lại
Alkaloid
TT Mayer Không tủa Tủa vừa Không tủa Không tủa Không tủa
TT Bouchardat Không tủa Không tủa Không tủa Không tủa Không tủa
TT Dragendorff Không tủa Tủa ít Không tủa Không tủa Không tủa
Flavonoid
H2SO4 đđ Xanh lục Không đổi màu Đỏ cam Hơi vàng Không đổi màu
NaOH 1% Không đổi màu Không đổi màu Cam Vàng xanh Không đổi màu
Cyanidin Không đổi màu Không đổi màu Không đổi màu Không đổi màu Không đổi màu
FeCl3 Không đổi màu Không đổi màu Xanh rêu đen Xanh rêu Không đổi màu
Anthraquinon NaOH 10% Không hiện tượng Vàng ửng đỏ Vàng đỏ vàng đỏ Không hiện tượng
Coumarin KOH 10% + UV 365 Không phát quang Phát quang yếu Phát quang mạnh Phát quang mạnh Không phát quang
Tannin Gelatin- muối Không hiện tượng Hơi đục Đục vừa Đục ít Không hiện tượng
Terpenoid
Libermann- Burchard Không đổi màu Xanh lục Không đổi màu
Rosenthler Không đổi màu Xanh lục Không đổi màu
Carr- Price Không đổi màu Không đổi màu Không đổi màu
Steroid Salkowski Không hiện tượng Đỏ đậm Không hiện tượng
Saponin
Nước, lắc mạnh Không bọt Không bọt Bọt bền Bọt kém bền Không bọt
39
Chú thích: (-): Không có, (±): Nghi ngờ, ( ): Có ít, ( ): Có vừa, ( ): Có nhiều.
Kết quả định tính trên các phân đoạn dịch chiết từ cao chiết cồn cho thấy hầu hết các hợp chất trong cây TBL đều tập trung trong 2 phân đoạn là chloroform và ethyl acetat; phân đoạn n-buthanol có mang hoạt chất nhưng cho hiện tượng rất mờ nhạt, chứng tỏ có thể hàm lượng các chất không nhiều; phân đoạn ether chủ yếu chỉ thấy sự hiện diện của chlorophyl, không thấy phản ứng dương tính với các nhóm chất khác; phần dịch nước còn lại cho kết quả âm tính tất cả các phản ứng khảo sát, chứng tỏ có khả năng các chất đã được thu nhận hết qua các phân đoạn dịch chiết trước đó. Các nhóm chất cụ thể được phân bố trong các phân đoạn dịch chiết như sau:
- Trong cao ether: thành phần chủ yếu là chlorophyl
- Trong cao chloroform: terpenoid chiếm chủ yếu; đồng thời còn có steroid và alkaloid, nhưng kết quả dương tính ít rõ ràng hơn. Có thể có thêm anthraquinon, tannin và coumarin. Ngoài ra còn có một ít chlorophyl của phân đoạn ether còn sót lại.
- Trong cao ethyl acetat: các nhóm hợp chất cho kết quả dương tính thấy rất rõ, có thể chiếm hàm lượng rất nhiều, đó là: flavonoid, tannin, coumarin, saponin. Ngoài ra còn có thể có thêm anthraquinon.
Bảng 3.10: Các nhóm chất hiện diện trong các phân đoạn dịch chiết
Nhóm chất Cao Ether Cao choloroform Cao ethyl acetat Cao n - butanol Cao nước còn lại Terpenoid - ++ - Steroid - +++ - Flavonoid - - +++ + - Alkaloid - + - - - Tannin - ++ + - Athraquinon - - Coumarin - +++ + -