Kết quả khảo sát hoạt tính sinh học cho thấy hoạt tính sinh học chủ yếu của TBL theo hướng chống oxy hóa và kháng viêm. Đồng thời, kết quả
93
cũng cho thấy 2 hoạt tính này thể hiện tốt nhất ở phân đoạn cao chiết ethyl acetat.
Phân đoạn ethyl acetat qua phân tích sơ bộ hóa thực vật cho thấy gồm thành phần chủ yếu là flavonoid. Do đó, phân đoạn ethyl acetat được chọn làm nguyên liệu và hợp chất flavonoid có trong phân đoạn này sẽ là hợp chất mục tiêu để phân lập.
7.2.1 Kết quả sắc kí nhanh –
Kết quả sắc ký nhanh - cột khô phân đoạn ethyl acetat TBL được trình bày như bảng 7.3, bảng 7.4 và hình 7.2, hình 7.3.
Bảng 7.3: Các phân đoạn thu được từ sắc ký nhanh – cột khô Dung môi
rửa giải
Phân đoạn Phân đoạn hứng Thể tích dung môi sử dụng Khối lượng chất cô cặn Cloroform - ethyl acetate (25:50) I 1-15 7,5 L 0,5963 g II 16-45 15 L 0,5154 g Ethyl acetate (100%) III 46-60 7,5L 0,1468g IV 61-70 5L 0,2642g V 71-95 12,5L 1,0004g VI 96-140 22,5L 2,0337g VII 135-165 15L 0,7191g methanol ( 100%) VIII 1 0.5L 3,3274g 2 - 4 1.5L 1,2663g 5 - 10 3L 0,0214g 11 0.5L 0,0073g
94
Hình 7.3: Hình SKLM các phân đoạn thu đượ - hạy hệ ethyl acetat – methanol - nước (100:17:13)
Hình 7.2: Hình SKLM các phân đoạn thu đượ
khô chạy hệ ethyl acetat – methanol - nước ( 100:17:13)
Vạch 1 (Rf = 0,475) Vạch 2 (Rf = 0,425) Vạch 3 (Rf = 0,35)
95
Bảng 7.4: Bảng nhận xét SKLM các phân đoạn thu được từ phương pháp sắc ký nhanh – cột khô
PHÂN ĐOẠN HỆ DUNG MÔI ĐẶC ĐIỂM VẠCH SẮC KÝ
I Cloroform – ethyl acetate (25:50) 1 vệt dài II 1 vệt dài III Ethyl acetate (100%) 3 vệt dài: vệt 1, 2 mờ; vệt 3 đậm IV 3 vệt: vệt 1, 2 mờ hơn, vệt 3 rõ hơn V 2 vạch 1 và 2 đậm màu nằm sát nhau, vạch thứ 3 nằm phía dưới, tách hẳn khỏi 2 vạch trên nhưng vẫn còn kéo
vệt VI Vạch 1 và 2 rõ hơn, vạch 3 còn kéo vệt VII 3 vạch đều mờ dần VIII Me1 Methanol ( 100%) Vạch 1, 2, 3 gần như mất hẳn, vạch 4 đậm màu Me2 Vạch 1, 2, 3 mất hẳn, vạch 4 mờ Me3 1 Vệt mờ
Me4 Gần như không thấy hình ảnh sắc ký
Dựa vào bản sắc kí các phân đoạn thu được ta thấy:
- Phân đoạn I và II : chạy hệ chloroform - ethyl acetat ( 25:50), kết quả thu được chủ yếu là các tạp chất kém phân cực, ít polyphenol.
96
- Phân đoạn III, IV: dùng dung môi ly giải ethyl acetat 100 %, bắt đầu xuất hiện các hợp chất polyphenol.
- Phân đoạn V, VI, VII: chạy hệ ethyl acetat (100%), cho 3 vạch màu xanh rêu đậm rất rõ ràng trên bản sắc kí, nên có thể lượng polyphenol tập trung trong 3 phân đoạn này là nhiều nhất. Tuy nhiên, phân đoạn V vẫn còn lẫn nhiều phần hợp chất kém phân cực kéo vệt dài phía trên bản sắc ký. Phân đoạn VI và VII hiện màu 3 vạch chất quan tâm đậm, rõ và ít tạp kéo vệt hơn.
- Phân đoạn VIII: ta sử dụng methanol 100% để rửa cột, các hợp chất hầu như đã được thu nhận trong các phân đoạn trước, phần còn lại tâp trung trong phân đoạn Me1. Trong phân đoạn này cũng xuất hiện vạch thứ 4 hiện màu xanh rêu trong FeCl3.
Tổng kết cột nhanh ta thu được 8 phân đoạn và có 4 vạch chất hiện màu khá rõ ràng với thuốc thử FeCl3 tập trung trong các phân đoạn V, VI, VII, VIII. Trong đó, 2 vạch chất 1 và 2 gom vết rõ nét còn 3 và 4 còn kéo vệt mờ, dự đoán còn lẫn tạp. Phân đoạn VI, VII có vạch 1 và 2 rõ ràng và nhiều nhất. Do đó, ta sử dụng 2 phân đoạn VI và VII tiếp tục chạy cột chậm để tinh sạch 2 hợp chất mục tiêu tương ứng vị trí vạch 1 và 2.
7.2.2 Kết quả sắc kí cộ
Kết quả các phân đoạn thu được từ cột cổ điển được trình bày như bảng 7.5, bảng 7.6 và hình 7.4
97
Bảng 7.5: Các phân đoạn thu được từ sắc ký cột cổ điển
Dung môi rửa giải Phân đoạn Phân đoạn hứng Thể tích dung môi sử dụng (ml) Khối lượng cắn (g) Ethyl Acetat 100% A1 1-6 180 0,1584 A2 7-11 150 0,1011 A3 12-15 120 0,0899 A4 16-22 140 0,2512 A5 23-36 420 0,2946 A6 37-45 270 0,2200 A7 46-106 1830 0,5705 A8 107-120 420 0,1745
Ethyl acetat - Methanol (50:50)
A9 121-140 600 0,0966
A10 141-155 450 0,0445
Methanol 100% A11 Methanol 2000 0,3132
Vạch 1 (Rf=0,475)
Vạch 2 (Rf=0,425)
98
Bảng 7.6: Bảng nhận xét kết quả SKLM các phân đoạn thu được từ sắc ký cột cổ điển
PHÂN ĐOẠN HỆ DUNG MÔI ĐẶC ĐIỂM VẠCH SẮC KÍ
A1
Ethyl acetat 100%
1 vệt dài phía trên vạch 1 và 2
A2 A3 A4
A5
1 vạch màu cam nằm sát phía trên vạch 1 và 2
A7
2 vạch 1 và 2 tách rõ ràng, màu xanh đen, hầu như không còn tạp
A8
2 vạch 1 và 2 mờ hơn, phần phía dưới 2 vạch này bắt đầu có vệt mờ
A9 Ethyl
acetat:Methanol (50:50)
2 vạch 1 và 2 không tách rõ ràng, phần phía dưới kéo vệt đậm
A10 1 vệt dài phía dưới vạch 1 và 2
Như vậy, kết quả thu được từ cột A như sau:
- Phân đoạn A1 – A4: tạp chất kém phân cực
- Phân đoạn A5: 1 vạch chất kém phân cực, hiện màu vàng cam với FeCl3 và còn lẫn tạp, khối lượng nhỏ.
99
- Phân đoạn A7: chiếm khối lượng lớn nhất và mang 2 vạch chất mục tiêu, rất ít tạp
- Phân đoạn A8: 2 chất mục tiêu ít hơn, tạp nhiều hơn
- Phân đoạn A9, A10: tạp chất phân cực mạnh
Do đó, phân đoạn A7 được chọn để chạy sắc ký lớp mỏng điều chế nhằm tinh sạch 2 chất mục tiêu 1 và 2.
7.2.3 Kết quả sắc ký lớp mỏng điều chế
Phân đoạn A7 được khai triển SKLM trên hệ dung môi chloroform - methanol (8:2) cho kết quả như hình 7.5.
Hệ dung môi chloroform:methanol (8:2) có khả năng phân tách 2 chất mục tiêu tương đối tách biệt nhau. Vì vậy, hệ chloroform:methanol (8:2) được chọn sử dụng trong SKLM điều chế để phân lập chất 1 và 2.
0,3g cắn phân đoạn A7 được hòa tan trong methanol và nạp lên bản mỏng silicagel 10cm x10cm. Do khối lượng mẫu nạp lên bản mỏng khá lớn nên hê dung môi cơ sở chloroform - methanol (8:2) được tăng độ phân cực lên thành chloroform - methanol (7:3) nhằm tăng khả năng phân tách tốt hơn. Sau khi đã được khai triển, bản mỏng được soi dưới đèn UV254nm và dùng viết chì khoang vùng chất 1 và 2 đã được tách biệt. Dùng kéo cắt vùng
Chất 2 (Rf=0,73)
Chất 1 (Rf=0,57)
a. Dưới đèn UV254nm b. Với thuốc thử FeCl3
100
đã được đánh dấu, cạo lớp silicagel mang chất 1 và 2 vào 2 cốc methanol, đánh siêu âm hòa tan và lọc qua giấy lọc. Phần dịch lọc thu được là 2 chất 1 và 2 đã phân lập. (Hình 7.6)
Chất 1 sau phân lập được khai triển SKLM thu được kết quả như hình 7.7.
7.2.4 Kết quả phổ chất 1
Chất 1 sau phân lập được đặt tên là TBL-1, cân được 12mg, gửi đo và giải phổ NMR (13C-NMR, 1H-NMR) và IR.
Kết quả chạy phổ cho thấy TBL-1 là một hỗn hợp chất chưa thật sự được phân tách sạch hoàn toàn, vẫn còn lẫn nhiều tạp.
Hình 7.6: Các bước phân lập chất 1 và 2
101
Chương 8: KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 8.1 Kết luận:
8.1.1 Thực vật học:
TBL là loài duy nhất thuộc chi Blepharis có ở Việt Nam. Các đặc điểm hình thái bên ngoài của TBL nhìn chung cũng tương đồng với mô tả của tài liệu thực vật học thế giới.
Xét về mặt vi học, TBL có mang những đặc điểm riêng đặc trưng về thành phần và vị trí phân bố mô, tế bào. Những đặc điểm này có ý nghĩa trong công tác xây dựng tiêu chuẩn phát triển TBL thành dược liệu phổ biến.
8.1.2 Hóa học:
Thành phần hóa học của TBL gồm: flavonoid, triterpenoid, saponin, coumarin, tanin, anthraquinon, alkaloid và hợp chất khử. Các thành phần này tập trung chủ yếu trong 2 phân đoạn cao chiết là ethyl acetat và chloroform.
Hệ sắc ký ethyl acetat – methanol – H2O (100:17:13) có khả năng phân tách tốt các thành phần flavonoid trong phân đoạn ethyl acetat và các thành phần saponin của phân đoạn này được phân tách tốt bởi hệ n-buthanol – a. acetic – H2O (4:1:5). Phân đoạn chloroform được phân tách tương đối tốt bằng hệ chloroform – ethyl acetat (7:3), nhưng chỉ có hệ n-buthanol – a. acetic – H2O (7:1:2) cho hiển thị được nhóm alkaloid trong phân đoạn này.
Thành phần hóa học chính của TBL là polyphenol, được tập trung chủ yếu trong phân đoạn ethyl acetat của cao chiết cồn, có thể được phân lập bằng phương pháp sắc ký nhanh – cột khô kết hợp với sắc ký cột cổ điển và SKLM điều chế.
8.1.3 Hoạt tính sinh học:
Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của TBL rất yếu, hầu như không có. TBL kháng đặc biệt mạnh với Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes và Pseudomonas aeruginosa, tuy nhiên, khả năng cũngchỉ thể hiện ở nồng độ mẫu thử rất cao (MIC = 12,5 – 250mg/ml). Ở nồng độ cao thì
102
phân đoạn chloroform thể hiện khả năng kháng khuẩn mạnh hơn phân đoạn ethyl acetat, và 2 phân đoạn này là phân đoạn chủ yếu thể hiện tính kháng khuẩn của TBL.
Hoạt tính chống oxy hóa của TBL, được đánh giá bằng các phương pháp khảo sát năng lực khử, khảo sát khả năng quét gốc tự do, nhìn chung khá mạnh. Phân đoạn ethyl acetat có năng lực khử và khả năng quét gốc tự do DPPH mạnh nhất, do polyphenol tập trung chủ yếu trong phân đoạn này. Phân đoạn ether dầu có hoạt tính quét gốc hydroxyl tự do mạnh nhất.
Thử nghiệm in vitro hoạt tính kháng viêm bằng phương pháp khảo sát khả năng ức chế biến tính albumin do nhiệt là phương pháp mới lần đầu tiên được công bố tại Việt Nam. Theo phương pháp này, kết quả cho thấy TBL có tiềm năng là thực vật kháng viêm và phân đoạn ethyl acetat quyết định hoạt tính kháng viêm của TBL.
Cao chiết bằng cồn 96% cho hoạt tính kháng khuẩn, còn cao chiết bằng nước thì không. Đối với các hoạt tính sinh học còn lại, chống oxy hóa và kháng viêm, cả 2 dạng cao chiết đều thể hiện hoạt tính nhưng cao chiết cồn cho hoạt tính mạnh hơn rất nhiều so với cao chiết nước. Đồng thời, 2 phân đoạn chloroform và ethyl acetat luôn cho hoạt tính nổi trội hơn hẳn các phân đoạn khác.
8.2 Đề nghị:
Nghiên cứu thêm về khả năng kháng khuẩn in vivo của TBL để làm rõ thêm kết quả thực nghiệm cho thấy khả năng TBL kháng khuẩn in vitro rất yếu.
Tiếp tục hoàn chỉnh hệ thống khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của TBL bằng thử nghiệm khảo sát khả năng bắt cặp với các ion kim loại chuyển tiếp như Fe2+, Cu+; khả năng chống oxy hóa lipid màng… và tiếp tục nghiên cứu in vivo về khả năng ứng dụng TBL trong điều trị tiểu đường, chống xơ vữa mạch máu, bảo vệ gan…
103
Tiếp tục khảo sát hoạt tính kháng viêm của TBL bằng phương pháp in vivo trên các mô hình: gây phù chân chuột, gây u hạt, gây áp xe, gây đau, gây sốt…
Tiếp tục phân lập các hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa và kháng viêm có trong cây TBL, chủ yếu là nhóm polyphenol tập trung trong phân đoạn ethyl acetat.
Về thực tiễn, nghiên cứu cho thấy thực chất TBL có khả năng kháng khuẩn rất thấp, chủ yếu thiên về khả năng làm vết thương mau lành, kháng viêm (chống sưng đỏ, giảm đau, không tụ rỉ dịch). Kết quả này củng cố cho phương pháp điều trị dân gian, nhưng cần phải có sự kết hợp với các loại dược liệu khác, cụ thể là các dược liệu có khả năng kháng khuẩn mạnh, để có hiệu quả điều trị cao hơn. Ngoài ra, nghiên cứu còn cho thấy TBL còn có những tiềm năng khác ngoài công dụng kháng khuẩn, trị áp xe.