chế biến tính albumin [37], [53], [65], [66], [67]
Phương pháp khảo sát tác dụng ức chế biến tính albumin do nhiệt được thực hiện theo phương pháp của Mizushima (1964). [53]
Nguyên tắc
Albumin là protein chiếm tỉ lệ rất lớn trong huyết thanh, có khả năng liên kết tốt với NSAIDs và kém bền nhiệt. Ở nhiệt độ trên 52oC, albumin bắt đầu biến tính và tốc độ biến tính càng tăng khi nhiệt độ càng tăng cao. Nhưng khi có sự hiện diện của NSAIDs, diễn tiến của quá trình biến tính này thay đổi, do NSAIDs có khả năng ức chế biến tính albumin do nhiệt ở nồng độ thấp.
Thực hiện
- Hệ thống phản ứng được thực hiện trong môi trường đệm phosphat pH 5,3 66mM, gồm 1ml ở các giảm dần ½ 500µ
0,957µg/ml và 0,2% albumin.
- Ủ 37o . Sau đó, đun cách thủy ở nhiệt
độ 67oC trong 4 phút. Để nguội, thêm 2ml nước cất và đo độ đục ở 650nm.
- Thí nghiệm được thực hiện 3 lần lặp lại.
Hoạt tính ức chế biến tính albumin do nhiệt (UCBT) được tính theo công thức sau: 100 (%) x ODc ODm ODc UCBT
ODm: mật độ quang của mẫu thử có mang chất thử nghiệm.
ODc: mật độ quang của mẫu mà chất thử nghiệm được thay bằng đệm.
80
Bảng 6.1: Quy trình khảo sát khả năng ức chế biến tính albumin
ng nghi m 0 1 2 … 9 10 ng (µg/ml) 0 500 250 … 1,914 0,957 u (ml) 1 1 1 1 1 1 Albumin (ml) 1 1 1 1 1 1 370 Đun cách thủy ở 67o C trong 4 phút H2O(ml) 2 2 2 2 2 2 Đo OD650nm
6.2 Kết quả khảo sát in vitro khả năng kháng viêm bằng bằng tác dụng ức chế biến tính albumin do nhiệt
NSAIDs có khả năng liên kết với albumin huyết tương và làm thay đổi một số đặc tính vật lý của albumin như là làm giảm độ nhớt và làm giảm sự biến tính dưới tác nhân nhiệt [35]. Do đó, khi gia tăng nồng độ NSAIDs, khả năng biến tính do nhiệt của albumin cũng sẽ giảm, nghĩa là albumin càng được bảo vệ khỏi sự biến tính do nhiệt [35], [53].
Khả năng ức chế biến tính albumin do nhiệt được Williams giải thích dựa trên kết quả phổ NMR 1 chiều và 2 chiều của albumin được công bố bởi Sadler và Tucker (1992). Những chất có khả năng ức chế biến tính albumin thường gắn không cộng hóa trị lên 2 vị trí của albumin là phần nhân thơm của vị trí giàu tyrosin và vị trí có threonin và lysin, làm thay đổi cấu trúc albumin và ảnh hưởng đến các đặc tính của albumin. [66]
Tuy nhiên, khả năng bảo vệ albumin khỏi sự biến tính do nhiệt của NSAIDs thường chỉ có ở nồng độ NSAIDs thấp và khi nồng độ NSAIDs vượt quá một ngưỡng nhất định, albumin sẽ càng biến tính nhiều hơn với cùng một điều kiện nhiệt độ [50], [67]. Khoảng nồng độ của NSAIDs có khả năng ức chế biến tính albumin do nhiệt thường là dưới 1mM, đối với các chất tinh khiết [35]. Các dịch chiết hay hợp chất có công dụng kháng viêm và giảm đau tương tự như NSAIDs cũng có thể có cùng đặc điểm này [35], [50], [53], [67]. Như vậy, khảo sát sự liên quan giữa nồng độ của các dạng cao chiết từ TBL lên sự biến
81
tính albumin do nhiệt sẽ là một dữ liệu tham khảo cho nghiên cứu hoạt tính kháng viêm, giảm đau của cây TBL.
82
Bảng 6.2: Khả năng ức chế biến tính albumin của các dạng cao chiết từ cây TBL
Mẫu Khả năng ức chế biến tính (%)
0,977µg/ml 1,953µg/ml 3,906µg/ml 7,813µg/ml 15,625µg/ml 31,25µg/ml 62,5µg/ml 125µg/ml 250µg/ml 500µg/ml
Cao cồn tổng -9,13 0,83 7,47 20,33 -7,88 -14,52 -30,71 -18,67 -65,15 -156,02 Cao nước tổng -23,65 -10,37 -5,39 -4,98 0,41 2,90 7,05 13,69 23,24 5,81 Cao ether dầu -1,92 -0,76 4,58 6,87 -17,56 -19,47 -32,82 -93,13 -189,31 -396,57 Cao chloroform 1,91 3,44 11,45 0 -0,76 -10,31 -28,63 -45,04 -137,79 -338,93 Cao ethyl acetat -6,49 24,03 -21,43 -25,32 -6,49 -31,82 -17,53 -14,29 -23,38 -75,32 Cao n-buthanol -20,39 -19,08 -15,13 -9,87 -6,58 8,55 -18,42 -42,10 -49,34 -50 Cao nước còn lại -42,11 -27,63 -33,55 -17,76 -11,18 -7,24 1,97 5,92 7,89 -8,55 Indomethacin 7,72 25,72 14,79 13,18 3,86 -7,69 -33,33 -29,06 -55,13 -94,02
83
Tác động ức chế biến tính albumin do nhiệt
-450 -400 -350 -300 -250 -200 -150 -100 -50 0 50 0 100 200 300 400 500 600 nồng độ (µg/ml) U C B T ( % )
Cao ether dầu Cao chloroform Cao ethyl acetat Cao n-Buthanol Cao nước còn lại Cao tổng cồn Cao tổng nước Indomethacin (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
84
Khoảng nồng độ mẫu thử dưới 100µg/ml trong đồ thị 6.1 được thể hiện rõ trong đồ thị 6.2.
Tác động ức chế biến tính albumin do nhiệt
-50 -40 -30 -20 -10 0 10 20 30 0 10 20 30 40 50 60 70 nồng độ (µg/ml) U C B T ( % )
Cao ether dầu Cao chloroform Cao ethyl acetat Cao n-Buthanol Cao nước còn lại Cao tổng cồn Cao tổng nước Indomethacin
Đồ thị 6.2: Khả năng ức chế biến tính albumin của TBL ở nồng độ thấp (<100µg/ml)
Phân tích kết quả thu được trong dãy nồng độ khảo sát, ta thấy:
- Indomethacin, một NSAIDs thuộc nhóm acid indol acetic, thể hiện khả năng ức chế biến tính albumin cao nhất (25,7%) ở nồng độ 1,953µg/ml (tương đương 0,0055mM) và bắt đầu gây biến tính albumin trở lại ở nồng độ 3,906µg/ml (tương đương 0,0109mM). Như vậy, dãy nồng độ của indomethacin cho phép thể hiện hoạt tính ức chế biến tính albumin do nhiệt sẽ nằm trong khoảng dưới của 3,906µg/ml. Kết quả này phù hợp với những nghiên cứu trước đây về khả năng ức chế biến tính albumin của NSAIDs ở nồng độ dưới 1mM.
- 2 dạng cao tổng chiết từ cây TBL đều thể hiện khả năng ức chế biến tính albumin ở mức độ khác nhau. Cao cồn tổng có khả năng ức chế biến tính albumin cao nhất ở nồng độ 7,813µg/ml và giảm khả năng trở lại ở nồng độ 15,625µg/ml. Trong khi đó, cao nước tổng thể hiện
85
khả năng này cao nhất ở nồng độ 250µg/ml và giảm khả năng ở nồng độ 500µg/ml.
- Tương tự trên, nếu dựa vào khoảng nồng độ cao chiết cho khả năng ức chế biến tính albumin cao nhất và khi tăng thêm nồng độ thì khả năng giảm trở lại, 5 phân đoạn cao chiết từ cây TBL thể hiện khả năng ức chế biến tính albumin ở các khoảng nồng độ khác nhau, theo thứ tự từ thấp đến cao là ethyl acetat < chloroform < ether dầu < n-buthanol < dịch nước còn lại.
Theo Williams và cộng sự, khả năng ức chế biến tính albumin sẽ giảm dần khi tăng dần nồng độ mẫu thử [67]. Tuy nhiên, nếu khả năng ức chế biến tính albumin giảm khi gia tăng nồng độ mẫu thử thì có thể xem như mẫu thử gây biến tính albumin, không phải ức chế biến tính. Trên thực tế, hiện tượng giảm khả năng ức chế khi nồng độ mẫu thử gia tăng chỉ xảy ra khi nồng độ mẫu thử đã vượt quá một ngưỡng nhất định, trong khoảng nồng độ cho phép và thường là rất thấp thì khả năng ức chế biến tính albumin sẽ tỉ lệ thuận với nồng độ thuốc [35], [50], [53].
Những chất hay dịch chiết từ cây thuốc có khả năng thể hiện hoạt tính ức chế biến tính albumin do nhiệt, ở nồng độ thấp nhất có thể, sẽ được lựa chọn trong quá trình sàng lọc bước đầu để tiếp tục phát triển thành thuốc dùng trong trị liệu [67]. Williams và cộng sự chọn mức hoạt tính khả năng bảo vệ albumin khỏi sự biến tính do nhiệt là trên 20% làm ngưỡng đánh giá tiềm năng kháng viêm, giảm đau tương tự như NSAIDs [66]. Như vậy, dựa vào nồng độ dịch chiết ức chế biến tính được trên 20% albumin (IC20) ta có thể dự đoán được khả năng kháng viêm, giảm đau của dịch chiết từ cây TBL. Dựa vào các giá trị khảo sát được từ bảng 3.27, ta có thể xác định một cách tương đối giá trị IC20 của các loại cao chiết từ TBL và được thể hiện như bảng 6.3 và đồ thị 6.3.
86
Bảng 6.3: IC20 khả năng ức chế biến tính albumin của cây TBL
Mẫu IC20 (µg/ml) Mẫu IC20 (µg/ml)
Cao cồn tổng 7,5 Cao ethyl acetat 1,8
Cao nước tổng 207 Cao n-buthanol 43
Cao ether dầu - Cao nước còn lại -
Cao chloroform 6,5 Indomethacin 1,6
Khả năng ức chế biến tính albumin
0 50 100 150 200 250
Indomethacin Cao tổng cồn Cao tổng nước Cao chloroform Cao ethyl acetat Cao n- Buthanol Mẫu thử IC 2 0 ( µ g/ m l)
Đồ thị 6.3: IC20 khả năng ức chế biến tính albumin của cây TBL
Khả năng ức chế biến tính albumin càng cao khi IC20 càng thấp. Kết quả đánh giá IC20 cho thấy:
- Indomethacin có khả năng ức chế biến tính albumin tốt nhất (IC20=1,6µg/ml).
- Cao cồn tổng có khả năng ức chế biến tính albumin cao hơn cao nước tổng (IC20 lần lượt là 7,5µg/ml và 207µg/ml).
- Trong 5 phân đoạn cao chiết từ cao tổng cồn có 2 phân đoạn không có khả năng ức chế biến tính albumin là ether dầu và phần dịch nước còn
87 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
lại. Do trong khoảng tuyến tính giữa nồng độ mẫu thử với khả năng ức chế, 2 phân đoạn này không thể đạt được giá trị IC20.
- 3 phân đoạn có khả năng ức chế biến tính albumin do nhiệt được xếp theo thứ tự khả năng giảm dần là ethyl acetat > chloroform > n- buthanol. Trong đó, phân đoạn ethyl acetat (IC20=1,8µg/ml) có hoạt tính gần như ngang bằng với indomethacin. Phân đoạn chloroform (IC20=6,5µg/ml) hoạt tính chỉ gần bằng ¼ indomethacin và phân đoạn n-buthanol tuy có thể hiện hoạt tính nhưng cũng rất thấp (IC20=43µg/ml, gấp gần 27 lần IC20 của indomethacin).
Theo kết quả đánh giá khả năng ức chế biến tính albumin của TBL như trên, ta có thể dự đoán TBL có khả năng kháng viêm, giảm đau và những hoạt chất này của TBL được tập trung chủ yếu trong phân đoạn ethyl acetat. Phân đoạn ethyl acetat cũng là phân đoạn tập trung chủ yếu flavonoid và saponin của TBL. Cả 2 nhóm hợp chất này đều được đánh giá là có khả năng kháng viêm rất tốt [21]. Như vậy, TBL thật sự là cây thuốc có tiềm năng kháng viêm và có thể được đầu tư nghiên cứu sâu hơn về hoạt tính này.
88
Chương 7: PHÂN LẬP HỢP CHẤT HÓA HỌC TỪ TBL 7.1 Phương pháp phân lập hợp chất hóa học từ TBL
Kết quả sơ bộ hóa thực vật và hoạt tính của các phân đoạn cao chiết TBL cho thấy phân đoạn ethyl acetat tập trung chủ yếu các hợp chất của TBL và có hoạt tính tốt nhất. Do đó, phân đoạn ehyl acetat được tiếp tục phân lập để xác định cấu trúc của hợp chất theo sơ đồ khái quát hình 7.1.
89
Hình 7.1: Quy trình tổng quát phân lập hợp chất quan tâm từ TBL
Theo đó, phân đoạn ethyl acetat sẽ được tiếp tục tách chiết thành các phân đoạn nhỏ hơn bằng phương pháp sắc ký nhanh – cột khô. Các phân đoạn này sẽ được khai triển SKLM để chọn lọc ra phân đoạn có mang vạch
SKLM điều chế
Sắc kí cột cổ điển (nhiều lần)
CAO PHÂN ĐOẠN ETHYL ACETAT
Sắc kí nhanh – cột khô
Khai triển SKLM chọn phân đoạn
CÁC PHÂN ĐOẠN CỘT NHANH
CÁC PHÂN ĐOẠN CỘT CỔ ĐIỂN
Khai triển SKLM chọn phân đoạn
PHÂN ĐOẠN CỘT CỔ ĐIỂN QUAN TÂM HỢP CHẤT QUAN TÂM PHÂN ĐOẠN CỘT NHANH QUAN TÂM Kết tinh CHẤT HỢP QUAN TÂM
Các phương pháp đo phổ một chiều và hai chiều
90
chất chiếm ưu thế nhất trong phân đoạn ban đầu và tiếp tục tiến hành sắc ký cột cổ điển một hoặc nhiều lần cho đến khi vạch chất quan tâm này có thể kết tinh. Tinh thể sẽ được cô lập và tiế ổ NMR, UV, MS để xác định cấu trúc.
– [15]
ạt tính sinh học và sơ bộ hóa thực vật,
phân đoạn quan tâm đượ –
.
Thực hiện sắc ký nhanh - cột khô với cao ethyl acetat với các thông số cột cụ thể như bảng 7.1.
Bảng 7.1: Các thông số thực hiện phương pháp sắc ký nhanh – cột khô
Chất hấp phụ Silica gel 60 F254
Lượng chất hấp phụ (g) 500
Kích thước cột (Ф x h) (cm) 10 x 15 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Mẫu Cao ethyl acetat
Khối lượng mẫu (g) 10
Thể tích dịch hứng (ml/lần) 500
Kiểm tra các phân đoạn bằng Sắc kí lớp mỏng Hệ dung môi khai triển SKLM ethyl acetat - methanol -
(100 : 17 : 13)
Thuốc thử FeCl3
Các phần dịch hứng được được cô giảm áp và triển khai SKLM, những phần nào giống nhau ( có Rf bằng nhau) sẽ được gom chung thành 1
91
7.1.2 [15]
. Thực hiện chạy cột cổ điển với thông số cột như bảng 7.2.
Bảng 7.2: Các thông số thực hiện phương pháp cột cổ điển
Chất hấp phụ Silica gel 60 F254
Lượng chất hấp phụ (g) 250
Kích thước cột (Ф x h) (cm) 4 x 60
Mẫu Phân đoạn VI + VII của cột nhanh
Khối lượng mẫu (g) 2,5
Dung môi rửa cột 100 % ethyl acetat
Tốc độ dòng chảy (giọt/phút) 50
Thể tích dịch hứng (ml/lần) 30
Tổng số phân đoạn 11
Kiểm tra các phân đoạn bằng Sắc kí lớp mỏng Hệ dung môi khai triển SKLM ethyl acetat - methanol -
(100 : 17 : 13)
Thuốc thử FeCl3
7.1.3 SKLM điều chế [15]
Phân đoạn đã được chạy qua sắc ký cột cổ điển có mang chất mục tiêu và còn lẫn ít tạp chất được tiếp tục tiến hành SKLM điều chế để cô lập hoàn toàn.
92
Thực hiện
- Chuẩn bị hệ dung môi, đựng vào bình sắc ký, bịt kín
- Chuẩn bị bản mỏng silicagel 10x10cm, dùng viết chì vạch đường xuất phát cách cạnh dưới bản mỏng 1cm và đường kết thúc cách cạnh trên bản mỏng 0,5cm
- Hòa tan mẫu bằng methanol (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Dùng ống mao quản nạp mẫu vào vạch xuất phát, chờ 15 phút cho methanol bay hơi hết
- Nhẹ nhàng đặt bản mỏng vào bình sắc ký đã bão hòa dung môi
- Chờ đến khi vạch dung môi chạm đường kết thúc, gắp bản mỏng ra, chờ dung môi bay hơi đến khô
- Soi bản mỏng đã khai triển dưới đèn UV254nm, dùng viết chì đánh dấu vùng có hợp chất quan tâm.
- Dùng dao lam cạo lớp bột silica có mang chất quan tâm vào cốc methanol. Hòa tan chất quan tâm vào methanol bằng sóng siêu âm, lọc và cô bớt dung môi methol sẽ thu được chất mục tiêu.
- Dùng phương pháp SKLM để đánh giá độ tinh sạch của chất cô lập được.
7.1.4 Phân tích hợp chất đã cô lập
- Phân tích cấu trúc: chạy các phổ NMR 1 chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT), NMR 2chiều (HMBC, COSY, HSQC, …), MS, UV, IR… để xác định cấu trúc hợp chất đã phân lập được.
- Phân tích hoạt tính sinh học: tái đánh giá hoạt tính kháng khuẩn, chống oxy hóa (năng lực khử và khả năng quét gốc tự do) và hoạt tính kháng viêm (ức chế biến tính albumin do nhiệt) của hợp chất phân lập được.
7.2 Kết quả phân lập hợp chất từ TBL
Kết quả khảo sát hoạt tính sinh học cho thấy hoạt tính sinh học chủ yếu của TBL theo hướng chống oxy hóa và kháng viêm. Đồng thời, kết quả
93
cũng cho thấy 2 hoạt tính này thể hiện tốt nhất ở phân đoạn cao chiết ethyl acetat.
Phân đoạn ethyl acetat qua phân tích sơ bộ hóa thực vật cho thấy gồm thành phần chủ yếu là flavonoid. Do đó, phân đoạn ethyl acetat được chọn làm nguyên liệu và hợp chất flavonoid có trong phân đoạn này sẽ là hợp chất mục tiêu để phân lập.
7.2.1 Kết quả sắc kí nhanh –
Kết quả sắc ký nhanh - cột khô phân đoạn ethyl acetat TBL được trình bày như bảng 7.3, bảng 7.4 và hình 7.2, hình 7.3.
Bảng 7.3: Các phân đoạn thu được từ sắc ký nhanh – cột khô Dung môi
rửa giải
Phân đoạn Phân đoạn hứng Thể tích dung môi sử dụng Khối lượng chất cô cặn Cloroform - ethyl acetate (25:50) I 1-15 7,5 L 0,5963 g II 16-45 15 L 0,5154 g Ethyl acetate (100%) III 46-60 7,5L 0,1468g IV 61-70 5L 0,2642g V 71-95 12,5L 1,0004g VI 96-140 22,5L 2,0337g