nghiên cứu thành phần hóa học của loài bình vôi ở vùng núi an giang

– Stephania bancroftii FM Bailey – Stephania cambodica Gagnep.: Bình vôi Campuchia – Stephania cepharantha Hayata: Kim tuyến điếu ô quy, hán phòng kỷ – Stephania dielsiana C.Y.Wu:

The tuber of Stephania spp (Menispermaceae) is widely used in traditional medicine for

the treatment of fever, stomachache, dysentery and venomous snakebites Many

investigations in Stephania species concentrated in constituent of alkaloids which have

proven that the alkaloid exerts diverse pharmacological effects include anti-inflammatory, antiallergic, sedative and reduce hypertension, anaesthetic, antimalaria, cytotoxicity In

South of Vietnam the tuber of Stephania cambodica Gagnep (Menispermaceae) is used for

treatment of insomnia, anxious… Although it is used for a long time, the chemical constituents of this plant are still unknown In this paper, the alkaloids constituents from

tuber of Stephania cambodica will be reported The aim of this study was investigated chemicals constituent of tuber Stephania cambodica by extraction, isolation give pure

compound for further pharmacological studies or practical therapeutic of those compound

TÓM TẮT ĐỀ TÀI 2

3

5

6

6

6

10

10

1.1 Đặc điểm về mặt thực vật học 10

1.2 Phân bố, sinh thái 14

15

15

2.1.1 Alcaloid khung protoberberin 15

2.1.2 Alcaloid khung aporphin 16

2.1.3 Alcaloid khung proaporphin 17

2.1.4 Alcaloid khung benzylisoquinolein 18

2.1.5 Alcaloid khung bisbenzylisoquinolein 18

2.1.6 Alcaloid khung hasubanan 20

2.1.7 Alcaloid khung morphinan 21

2.1.8 Alcaloid khung eribidin (benzazonin) 23

23

23

24

25

25

inh trung ương 25

26

26

27

27

28

28

28

28

31

31

31

31

31

32

32

32

2.2.1 Phương pháp định tính và định lượng sơ bộ thành phần alkaloid 32

2.2.2 Phương pháp chiết xuất 32

2.2.3 Phương pháp chiết phân bố lỏng – lỏng 32

2.2.4 .33

33

33

2.2.5 Phương pháp kết tinh phân đoạn 33

2.2.6 Phương pháp xác định cấu trúc các chất 33

35

35

35

1.2 Xác định loài mẫu Bình vôi nghiên cứu 36

37

38

2.1 Định tính thành phần alkaloid 38

2.1.1 Định tính bằng hoá học 38

2.1.2 Định tính bằng sắc ký 38

39

2.2.1 Khảo sát các phương pháp chiết 39

(phương pháp A) 40

2 SO 4 1% (phương pháp B) 41

2 SO 4 1% (phương pháp C) 41

42

2.3 Chiết xuất và tách các phân đoạn alkaloid từ Bình vôi Campuchia 43

2-3 44

7 44

9-10 44

2.4 Phân lập các alkaloid 45

aloid từ cao A 45

3 A2 46

2.4.1.2 Phân lập chất 4 từ phân đoạn A3 47

48

48

49

2.5 Xác định cấu trúc các alkaloid phân lập được 50

2.5.1 Xác định cấu trúc hợp chất 3 50

2.5.2 Xác định cấu trúc hợp chất 4 51

2.5.3 Xác định cấu trúc hợp chất 6 53

2.5.4 Xác định cấu trúc hợp chất 7 55

58

58

58

60

PHỤ LỤC 1 63

Phổ khối của rotundin (l-tetrahydropalmatin) 63

PHỤ LỤC 2 63

Phổ khối của crebanin 63

Phổ 1 H-NMR của crebanin (CDCl 3 , 500 MHz) 64

Phổ 13 C-NMR của crebanin (CDCl 3 , 125 MHz) 64

Phổ DEPT của crebanin 65

Phổ COSY của crebanin 65

Phổ HMBC của crebanin 66

Phổ HSQC của crebanin 67

PHỤ LỤC 3 68

Phổ khối của palmatin 68

Phổ 1 H-NMR của palmatin (CD 3 OD, 500 MHz) 68

Phổ 13 C-NMR của palmatin (CD 3 OD, 125 MHz) 69

Phổ DEPT của palmatin 69

Phổ COSY của palmatin 70

Phổ HSQC của palmatin 71

Phổ HMBC của palmatin 72

PHỤ LỤC 4 73

Phổ khối của jatrorrhizin 73

Phổ DEPT của jatrorrhizin 74

Phổ HMBC của jatrorrhizin 75

Phổ HSQC của jatrorrhizin 76

Phổ NOESY của jatrorrhizin 77

Phổ NOESY của jatrorrhizin 77

STT

cs

DĐVN III

SKLM

Trang

Bản Stephania 12

S cambodica Gagnep Menispermaceae 36

38

42

Bảng 5: Dữ liệu phổ của chất 4 so sánh với crebanin 52

Bảng 6: Dữ liệu phổ của chất 6 so sánh với palmatin 54

Bảng 7: 56

Trang 35

35

36

Hình 4: Cụm hoa 36

36

38

Hình 7: Sắc ký đồ của cao chiết toàn phần so sánh với rotundin chuẩn 39

– aceton (1 : 1) 46

Hình 9: Sắc ký đồ của chất 3 với hệ dung môi CHCl3 – MeOH (13 : 1) 46

– ethyl acetat (1 : 4) 47

Hình 11: Sắc ký đồ của chất 4 với 2 hệ dung môi 47

Hình 12: Sắc ký đồ tinh thể 6 và 7 49

Hình 13: Sắc ký đồ của tinh thể 8 50

Hình 14: Cấu trúc của rotundin 50

Hình 15: Cấu trúc và các tương tác của hợp chất 4 53

54

56

Trang 40

41

Sơ 41

45

–

– Stephania bancroftii FM Bailey

– Stephania cambodica Gagnep.: Bình vôi Campuchia

– Stephania cepharantha Hayata: Kim tuyến điếu ô quy, hán phòng kỷ

– Stephania dielsiana C.Y.Wu: Củ dòm, củ ngỗng, củ gà ấp

– Stephania glabra (Roxb.) Miers: Bình vôi

– Stephania hernandiifolia (Willd.) Walp.: Dây Lõi tiền

– Stephania hispidula Yamamoto:

– Stephania japonica (Thunb.) Miers: Dây Lõi tiền, Thiên kim đằng, dây mối

– Stephania longa Lour.: Dây Lõi n cơ đốc

– Stephania pierrei Diels.: Bình vôi, dây Đồng tiền

– Stephania rotunda Lour.: Bình vôi, củ một, dây mối trơn

– Stephania sinica Diels.: Bình vôi

– Stephania suberosa L.L.Forman:

– Stephania tetrandra S Moore: Thạch thiềm thừ, phòng kỷ, phấn phòng kỷ, hán

phòng kỷ, đảo địa củng

– Stephania venosa (Blume) Spreng

Năm 1999 Phạm Hoàng Hộ mô tả một số loài thường thấy ở Việt Nam trong đó có

7 loài [8]:

– Stephania rotunda Lour

– Stephania pierrei Diels

– Stephania longa Lour

– Stephania venosa (Blume) Spreng

– Stephania sinica Diels.: Bình vôi

– Stephania japonica (Thunb)

– Stephania japonica (Thunb) var discolor Miers

So với khóa phân loại của cùng tác giả vào năm 1970 trong quyển ― Cây cỏ miền

Nam‖ có thêm 2 loài là S venosa (Blume) Spreng và S sinica Diels Và cũng mô

tả rõ 2 loài S rotunda Lour với S longa Lour

chưa rõ‖ [8]

rotunda sensu Gagnep

non Lour., S erecta Craib

vôi

n Nai

– Stephania pierrei

– Stephania longa Lour

1.2 Phân bố, sinh thái

Stephania Lour là chi có khoảng 45 loài dây leo, thường xanh hoặc rụng lá, trong

đó nhiều loài có rễ phình to thành củ Ở Malaysia, có 12 hoặc 13 loài, Trung Quốc

có rễ củ to thường được gọi chung là ―củ Bình vôi‖

Bình vôi là cây ưa sáng, khi còn nhỏ cây có thể chịu bóng, thường mọc trong các quần thể cây bụi và dây leo nhỏ ở rừng núi đá vôi ẩm Độ cao phân bố phổ biến ở Việt Nam từ vài chục đến vài trăm mét Chưa phát hiện thấy cây ở độ cao trên 1000 m[5]

Hằng năm, Bình vôi có hiện tượng rụng lá vào cuối thu, đầu đông Đến cuối mùa xuân (khoảng đầu tháng 4), cùng với việc ra lá non trên cá –

Để có 1 củ Bình vôi nặng 3-5

kg cây phải có độ tuổi khoảng 10 năm

Nam, loài S sinica Diels có vùng phân bố rộng rãi nhất ở các tỉnh phía Bắc,

nhất là Thanh Hóa, Ninh Bình, Hà Nam, Hòa Bình và các tỉnh khác ở vùng Đông Bắc cũng như Tây Bắc Loài này còn có ở Trung Quốc và Lào

Trữ lượng Bình vôi ở Việt Nam trước đây rất phong phú Gần 10 năm trở lại đây,

do bị khai thác ồ ạt bán qua biên giới và sử dụng trong nước, nên nguồn dự trữ này

bị can kiệt nhanh chóng Vấn đề bảo vệ và khai thác hợp lý các loài bình vôi ở Việt Nam đang là vấn đề cấp thiết hiện nay [1,4,5]

Trong đó Sách đỏ Việt Nam đã đưa một số loài vào danh sách cần được bảo vệ nghiêm ngặt để duy trì nguồn gen quý hiếm [9] Cụ thể với một số loài:

– Stephania cepharantha Hayata (S tetrandra S Moore var glabra Maxim, S disciflora Hand - Mazz.) - Mức độ đe dọa: Bậc V

– Stephania kwangsiensis H S Lo - Mức độ đe dọa: Bậc E

– Stephania brachyandra Diels - Mức độ đe dọa: Bậc R

– Stephania dielsiana C Y Wu - Mức độ đe dọa: Bậc V

Stephania

: Benzylisoquinolin, bisbenzylisoquinolin, protoberberin, aporphin, proaporphin, hasubanan, morphinan, dibenzazonin [5]

2.1.1 Alcaloid khung protoberberin

), Fibraurea

protoberberin: Abuta, Anamirta, Anisocycla, Arcangelisia, Burasaia, Chasmanthera, Cocculus, Cosinium, Dioscoreophyllum, Fibraurea, Heptacyclum, Jateorhiza, Legnephora, Menispermum, Parabaena, Penianthus, Rhigiocarya,

Sinomenium, Stephania, Sphenocentrum, Tinospora, Triclisia [10]

: noraporphin, aporphin, aporphin

-: loại duguenaine aporphinoid, telazolin, oxoisoaporphin, taspin, azafluoranthen, diazafluoranthen, tropoloisoquinolin [14]

NH

alkaloid khung aporphin

N O

O OCH3

N

O O

CH3

Liriodenin Stephanin Oxostephanin Dehydroemerin

S dinklagei Diels; Stephania sp.; S mashanica H.S Lo & B.N Wang; S dicentrinifera H.S Lo & M Yang; S epigeae H.S Lo; S disciflora Hand.-Mazz.;

S zippeliana Miq.; S brachyandra Diels; S dentifolia H.S Lo & M Yang; S pierrei Diels; S abysinica Walp.; S cepharantha Hayata

N+O

3

O OCH3

N O

O

OH H

OCH3

CH3

N O

3

H OH H

OCH3OCH3

2.1.3 Alcaloid khung proaporphin

[10]

NH

OProaphorphin alkaloid

N

O

H

CH3O

H3CO

NH

O

H O

S venosa (Blume) Spreng.; S cepharantha Hayata

glabra (Roxb.) Miers (= S rotunda Lour.); Cocculus laurifolius DC.,

Menispermaceae; S sutchuenensis H.S Lo.; S cephalantha Hayata

trong S glabra, S cepharantha

2.1.4 Alcaloid khung benzylisoquinolein

N

Benzylisoquinolin alkaloid

N

Benzylisotetrahydroquinolin alkaloid

Stephania Abuta, Burasaia, Caryomene, Cissampelos,

Cocculus, Cyclea, Pachygone, Parabaena, Sarcopetalum, Sciadotenia, Stephania, Tiliacora, Tinospora

OH OH

2.1.5 Alcaloid khung bisbenzylisoquinolein

uinolein

O

N

O O

O

NH

N O

O O

O C

H3

OCH3

H H

O OCH3

CH3

H3CO N

O C

H3

OCH3

H H

O OCH3

CH3OCH3

N

O OCH3

C

H3

O

N O

H3CO

H H

N H H

OCH3

OH

O OH

O N

C

H3

H3CO O

H

N

CH3

O OCH32-N-Methyltelobin

2.1.6 Alcaloid khung hasubanan

C

H3

OH OMe

N O O

C

H3

OH O

OCH3

O O O

N

O

O O

H H

-NH C

6

O

Morphinan-6-on

NH C

7

O

Morphinan-7-on

Cocculus, Sinomenium, Stephania,

Menispermum

Antizoma, Chasmanthera, Cocculus, Kolobopetalum, Rhigiocarya, Sinomenium, Stephania

NH C

N

CH3

H3CO

O H

C

6

O

HH R OCH3

H3CO

N C

N C

H3CO

H H

O H

OCH3

N

CH3

O H

2.1.8 Alcaloid khung eribidin (benzazonin)

Cocculus, Hyperbaena, Stephania

N

NH OH

OH

H3CO

H3CO

H H

[12]

O

O O

dehydrodicentrin, dicentrin, stepharin, sinoacutin

– S hainanensis l-tetrahydropalmatin, crebain, oxocrebain

berbamin, cepharamin, homoaromolin, l-tetrahydropalmatin, aknadinin, aknadicin, aknadilactam, cepharamin, cephatonin, cephakicin, cephamonin, cephamorphinamin, cephamunin, cephasamin, cephasugin, 14-episinomenin, sinoacutin, aromolin, palmatin, nor-nuciferin

– S pierrei , asimilobin, nor-dicentrin, phanosterin, xylopin, cepharanthin, l-tetrahydropalmatin

– S glabra , tuduranin, stepharin, palmatin, l-tetrahydropalmatin, hyndaricin

-

Ninh

, tetrahydropalmatin hydroclorid 50

3.1.4

S cepharantha S pierrei

b

m invitro

Hela S3 [5

-1

Herpes simplex type I, tetrandin c

(Lee et al.,

–,

Trong Đông y người ta chủ yếu dùng S tetrandra và S cepharantha với tên gọi hán

(phấn) phòng kỷ Vị đắng, hăng và rất lạnh, có tác dụng với bàng quang, thận và tì (lá lách) Các hoạt chất chính của hán phòng kỷ sản xuất tại Trung Quốc là tetrandin

C38H42N2O6 và fangchinolin C37H46N2O6 còn hán phòng kỷ sản xuất tại Nhật Bản lại là sinomenin C19H22NO4 Hán phòng kỷ Trung Quốc dùng điều trị bệnh liệt mặt (liệt Bell), hen suyễn, phù và có tác dụng lợi tiểu Hán phòng kỷ Nhật Bản dùng làm thuốc giảm đau: Viêm dây thần kinh, cứng vai, gút và các thương tổn cột sống Người ta cũng lưu ý rằng các đơn thuốc Đông y nếu chỉ ghi phòng kỷ thì được hiểu

là Hán (phấn) phòng kỷ, còn Mộc phòng kỷ thì phải ghi rõ ràng Liều dùng không quá 5-10 g, nấu với nước để uống, còn thuốc dùng để tiêm thì không quá 300 mg/liều

2.2 thành phần hóa học

2.2.1 Phương pháp định tính và định lượng sơ bộ thành phần alkaloid

- Định tính thành phần alkaloid trong dịch chiết dược liệu dựa vào phản ứng tạo tủa với các thuốc thử chung của alkaloid, đồng thời định tính bằng SKLM, hiện màu với thuốc thử Dragendorff

- Định lượng sơ bộ thành phần alkaloid theo phương pháp cân

2.2.2 Phương pháp chiết xuất

2.2.5 Phương pháp kết tinh phân đoạn

Các cao chiết, phân đoạn hoặc kết tinh thô đƣợc hòa tan trong dung môi thích hợp với một lƣợng tối thiểu, để kết tinh ở nhiệt độ lạnh, lọc lấy tinh thể bằng phễu thủy tinh xốp, rửa bằng dung môi lạnh, sấy trong tủ sấy chân không đến khô

2.2.6 Phương pháp xác định cấu trúc các chất

Xác định cấu trúc các chất phân lập đƣợc dựa trên các dữ liệu phổ MS, NMR và so sánh với dữ liệu phổ đã biết

1.1 của loài Bình vôi Campuchia

là một lớp vảy mỏng màu xám dễ bong ra cho

Hình ảnh về mẫu bình vôi đƣợc trình bày ở Hình 1-5

Hình 3: Hình 4: Cụm hoa

Hình 5: Cụm h

1.2 Xác định loài mẫu Bình vôi nghiên cứu

Việc xác định tên loài của mẫu nghiên cứu chủ yếu dựa vào đặc điểm hình thái của

các loài So sánh mẫu Bình vôi nghiên cứu với các tài liệu mô tả đƣợc trình bày ở Bảng 3

9 – 11 gân

Hoa ẽ

9,5 – 18 cm

3 – 6 cm 0,1 - 0,4 cm

,

7 – 12 cm

4 - 6,2 cm

Qua khảo sát so sánh mẫu nghiên cứu với tài liệu có thể xác định được mẫu Bình

vôi nghiên cứu là loài S cambodica Gagnep

1.3

i thơm hơi hăng

bột dược liệu soi dưới kính :

Qua thăm dò một số hệ dung môi SKLM cho thấy hệ dung môi CHCl3-MeOH (9:1)

tách tốt các alkaloid của mẫu Bình vôi Sắc ký đồ alkaloid toàn phần loài S

cambodica đƣợc trình bày Hình 7

Hình 7: Sắc ký đồ của cao chiết toàn phần so sánh với rotundin chuẩn

Nhận xét: Từ thành phần alkaloid khảo sát bằng sắc ký lớp mỏng ở Hình 7 trên cho thấy các alkaloid tách ra rõ rệt: Các alkaloid kém phân cực ở phía trên, các alkaloid phân cực trung bình ở giữa, còn các alkaloid phân cực mạnh ở phía dưới Kết quả sắc ký lớp mỏng so sánh với rotundin cũng cho thấy rotundin không phải là chất có hàm lượng cao nhất trong cây Do đó không nên sử dụng nguyên liệu này để chiết rotundin là chính

2.2 Khảo sát phương pháp c alkaloid từ củ Bình vôi

2.2.1 Khảo sát các phương pháp chiết

quy theo nguyên tắc chung như sau:

Quy trình chiết alkaloid trong Bình vôi dưới dạng base được trình bày ở sơ đồ 1

Dược liệu (10g)

Làm ẩm bằng NH 4 OH đđ Chiết bằng CHCl 3 (30ml x 11 lần) Đun hồi lưu/ BM 15', lọc

H 2 SO 4 1% (20ml x 10 lần)

Cho qua Na 2 SO 4 khan

B c hơi t i c n khô

Kiềm hóa bắng NH 4 OH đđà pH 10

Dịch kiềm Dịch chiết nước acid Dịch chiết CHCl3

Dịch chiết CHCl3

Chiết bằng CHCl 3

3.2.1.2 Phương pháp acid H 2 SO 4 1% (phương pháp B)

Quy trình chiết alkaloid trong Bình vôi dưới dạng muối với acid sulfuric 1% được trình bày ở Sơ đồ 2

Dược liệu (10g)

Chiết bằng H 2 SO 4 1% (50ml x 12 lần) Đun hồi lưu/ BM 15', lọc

Cho qua Na 2 SO 4 khan

Trung hòa acid đến pH 5-6 Bay hơi cồn trên bếp cách thủy

Cho qua Na 2 SO 4 khan

B c hơi t i c n khô

Kiềm hóa bắng NH 4 OH đđà pH 10 Chiết bằng CHCl 3

Sơ đồ 3

Thành phần alkaloid chiết đƣợc nhiều nhất do cồn có thể chiết đƣợc cả các

alkaloid toàn phần H trong

và lập lại việc chiết alkaloid như trên

2.3 Chiết xuất và tách các phân đoạn alkaloid từ Bình vôi Campuchia

Từ khảo sát trên, Bình vôi Campuchia được chiết theo phương pháp chiết cồn acid với acid sử dụng là acid citric thay cho acid sulfuric và có thay đổi pH sử dụng để

pH 9 – 10) alkaloid 3 Mỗi lần chiết sử dụng khoảng 1 lít

dịch chiết có thành phần tương tự được gộp chung