Từ khảo sát trên, Bình vôi Campuchia đƣợc chiết theo phƣơng pháp chiết cồn acid với acid sử dụng là acid citric thay cho acid sulfuric và có thay đổi pH sử dụng để có kết quả tốt hơn.
Từ 4,5 kg bột củ (96%)–
– citric 0,1%
– dƣới áp suất giảm thu
(2 ).
(pH 2 – 3, pH 7 và pH 9 – 10) alkaloid 3. Mỗi lần chiết sử dụng khoảng 1 lít
cloroform. S lần chiết, dịch chiết đƣợc . các
2.3.1 các ở pH 2-3
Dịch chiết đậm đặc đƣợc hòa tan với 2 lít nƣớc điều chỉnh đến pH 2-3 và chiết phân bố 8 lần với CHCl3, mỗi lần chiết dùng khoảng 1 lít CHCl3. Ngừng chiết khi hầu nhƣ không còn alkaloid qua lớp CHCl3 (kiểm tra bằng SKLM với thuốc thử Dragendorff). Chấm SKLM cho thấy phân đoạn CHCl3 chủ yếu chứa các alkaloid kém phân cực. Cô thu hồi CHCl3 dƣới áp suất giảm thu đƣợc 2 phân đoạn A (167 g) và B (85 g). Dịch chiết sau khi kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng khi thấy không còn alkaloid qua tiến hành nâng lên pH 7.
2.3 các ở pH 7
Dịch chiết nƣớc acid sau khi nâng lên pH 7 đƣợc chiết 5 lần với CHCl3, mỗi lần dùng khoảng 2 lít CHCl3. Ngừng chiết khi hầu nhƣ không còn alkaloid qua lớp CHCl3 (kiểm tra bằng SKLM với thuốc thử Dragendorff).
– C (13 g) và D
1
cloroform nên dung dịch đƣợc nâng lên pH=10.
2.3.3. ở pH 9-10
Dịch nƣớc ở pH 7 sau khi chiết với CHCl3 đƣợc kiềm hóa bằng amoniac đậm đặc đến khoảng pH 10 và tiếp tục chiết 11 lần với CHCl3, mỗi lần dùng khoảng 2 lít CHCl3.
3 F ( 102 g) . các tinh
thể này đƣợc lọc riêng để phân lập alkaloid sau này. Ngừng chiết khi hầu nhƣ không còn alkaloid qua lớp cloroform (kiểm tra bằng SKLM với thuốc thử Dragendorff). Chấm SKLM cho thấy phân đoạn cloroform ở pH 10 chủ yếu chứa các alkaloid phân cực và một phần các alkaloid phân cực trung bình. Cô thu hồi cloroform dƣới áp suất giảm thu đƣợc cao chiết E ở pH 10, khối lƣợng 22 g.
Đến lần chiết thứ 11, do lƣợng alkaloid phân bố vào dung môi không còn nhiều nữa nên việc phân tách đƣợc tạm thời dừng lại. Dịch nƣớc còn lại đƣợc xử lý sau.
Kết quả của quá trình chiết phân bố theo gradient pH của alkaloid toàn phần của củ Bình vôi Campuchia thu đƣợc 6 phân đoạn là: A, B (pH 2-3), C, D (pH 7) và E, F
(pH 9-10) (Sơ đồ 4). Phân đoạn I có khối lƣợng lớn nhất và có chứa alkaloid có hàm lƣợng cao của củ Bình vôi Campuchia.
D c liu (4,5 kg)
ch chit c n citric
ch chi t đ m đ c
Phân đ n III
Cô thu h i dung môi
Phân đ n II Phân đ n I A (167 g) B (85 g) C (13 g) D (14 g) E (22 g) F (k t tinh thô ng 102 g) C n -citric 5% ng v i n c r i l c v i CHCl3 pH 2-3 pH 7 pH 9-10 3 (332 mg) 4 (730 mg) 1 (10 mg) 2 (636 mg) 5 (38.8 mg) 7 (123 mg) 6 (986 mg) 8 (12.85 g) Sơ đồ 4 2.4. Phân lập các alkaloid
Do phân đoạn I có khối lƣợng cao nhiều và có chứa các alkaloid với hàm lƣợng cao của Bình vôi Campuchia nên phân đoạn này đƣợc tiếp tục phân tách để thu đƣợc các alkaloid tinh khiết.
2.4.1. alkaloid từ cao A
Cao A của phân đoạn I đƣợc tiến hành phân lập các alkaloid tinh khiết trên sắc ký cột với đ nhƣ sau:
– sắc ký , kích thƣớc 4 cm x 70 cm.
– Pha tĩnh –
120 o . Pha tĩnh đƣợc đƣa lên .
– Mẫu thử: Cao A của phân đoạn I, k : 8 g. (10ml) và n lên cột dƣới ).
– : benzen-aceton bắt đầu từ (99: tăng dần lƣợng aceton 95:5; 90:1; 8:2 ; 7:3; 6:4.
–
– các phân đoạn là 20 ml.
Kiểm tra các phân đoạn hứng trên sắc ký lớp mỏng, gộp các các ống có thành phần alkaloid tƣơng tự. Kết quả thu đƣợc 5 phân đoạn (A1-A5). Các phân đoạn này đƣợc tiếp tục tinh chế bằng phƣơng pháp kết tinh phân đoạn để thu các chất tinh khiết.
2.4.1.1. 3 A2
Phân đoạn A2 đƣợc tan trong MeOH, để lạnh thấy xuất
hiện kết tinh. Lọc lấy tinh thể và rửa lại bằng MeOH lạnh thu đƣợc tinh thể hình khối, không màu. Tiến hành kết tinh lại nhiều lần với dung môi là methanol thu đƣợc chất 3 tinh khiết hình khối lớn không màu (332 mg).
Hình 8: Sắc ký đồ của chất 3 với hệ dung môi ether d – aceton (1 : 1) (TP: alkaloid toàn phần, T: 3, C: rotundin)
Hình 9: Sắc ký đồ của chất 3 với hệ dung môi CHCl3 – MeOH (13 : 1) (TP: alkaloid toàn phần, T: 3, C: rotundin)
TP T C TP T C TP T C UV 254 Dragendorff UV 365 UV 254 Dragendorff UV 365 TP T C TP T C TP T C
Hình 10: Sắc ký đồ 3 – ethyl acetat (1 : 4) (TP: alkaloid toàn phần, T: 3, C: rotundin)