Nghiên cứu hoạt tính chống oxi hóa và độc tính tế bào của một số hợp chất lignan và stilbene

Từ các kết quả nghiên cứu về hoạt tính chống oxi hóa và độc tính tế bào của RES nên hiện nay hợp chất này được ứng dụng rộng rãi trong các loại dược phẩm hiện có trên thị trường.. Các ng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LÊ THANH TÂM

NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH CHỐNG OXI HÓA VÀ ĐỘC TÍNH TẾ BÀO CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT LIGNAN VÀ

Lời Cảm Ơn



Trước tiên, tôi xin gởi lời cám ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Thị Thanh Mai,

người đã tận tình giúp đỡ, chỉ dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất trong suốt quá trình thực hiện luận văn này

Xin cảm ơn tất cả các thầy cô đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt quá trình học tập nghiên cứu chương trình sau đại học

Xin cảm ơn các thầy cô thuộc dự án DANIDA đã tạo điều kiện cho tôi được thực hiện luận văn tại trường Đại Học Roskilde – Đan Mạch

Xin cảm ơn thầy Nguyễn Trung Nhân, người đã cung cấp mẫu thử và cung cấp nhiều lời khuyên quý báu trong quá trình thực hiện đề tài

Và cuối cùng, xin cảm ơn gia đình, bạn bè và đặc biệt các bạn trong lớp cao học phân tích K16, những người luôn bên tôi động viên, giúp đỡ để tôi có thể hoàn thành tốt luận văn thạc sĩ này

Thành phố Hồ Chí Minh tháng 1, 2010

MỤC LỤC

Trang phụ bìa

Lời Cảm Ơn I MỤC LỤC II DANH MỤC CÁC BẢNG VII DANH MỤC CÁC HÌNH VIII DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ IX DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ X 1 Giới thiệu đề tài 1

2 Giới thiệu một số phương pháp nghiên cứu khả năng chống oxi hóa 3

2.1 Khái niệm về gốc tự do 3

2.2 Lợi ích của gốc tự do đối với cơ thể 3

2.3 Tác hại của gốc tự do đối với cơ thể 4

2.4 Các phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa 6

2.4.1 Phương pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH 6

2.4.2 Phương pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do NO 7

2.4.3 Phương pháp xác định hàm lượng MDA 9

2.4.4 Phương pháp đánh giá khả năng kết hợp với ion sắt II (Iron chelating activity) 10

2.4.5 Phương pháp thử hoạt tính ức chế enzyme Xanthine oxidase (XO) 10

2.4.5.1 Giới thiệu 10

2.4.5.2 Cấu tạo 10

2.4.5.3 Cơ chế hoạt động của enzyme XO 10

2.4.5.4 Nguyên tắc quy trình thử hoạt tính ức chế enzyme XO 11

3 Giới thiệu phương pháp nghiên cứu độc tính tế bào 12

3.1 Nuôi cấy tế bào 12

3.2 Các phương pháp nghiên cứu độc tính tế bào 13

3.2.1 Phương pháp nghiên cứu sự phát triển tế bào 13

3.2.2 Phương pháp SRB 13

4 Tổng quan các chất nghiên cứu thuộc họ lignan và stilbene 14

4.1 Lignan 14

4.1.1 Isotaxiresinol (ITR) 15

4.1.2 Secoisolariciresinol (SSR) 15

4.2 Stilbene 16

4.2.1 Resveratrol (RES) 17

4.2.2 Pterostilbene (PTS) 18

4.2.3 Piceatannol (PI) 19

5 Kết quả và thảo luận 21

5.1 Kết quả nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa 21

5.1.1 Kết quả thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH 21

5.1.2 Kết quả thử hoạt tính ức chế gốc tự do NO 25

5.1.3 Kết quả thử hoạt tính ức chế enzyme XO 27

5.1.4 Tóm tắt kết quả thử hoạt tính chống oxi hóa 28

5.2 Kết quả nghiên cứu độc tính tế bào 31

5.2.1 Isotaxiresinol 31

5.2.2 Secoisolariciresinol 34

5.2.3 Resveratrol, Pterostilbene và Piceatannol 37

5.2.4 Tóm tắt kết quả nghiên cứu độc tính tế bào 42

6 Thực nghiệm 45

6.1 Hóa chất và dụng cụ 45

6.1.2 Dụng cụ thí nghiệm 46

6.1.3 Chuẩn bị mẫu 47

6.1.4 IC50 và cách xác định 48

6.1.4.1 Định nghĩa 48

6.1.4.2 Cách xác định IC50 48

6.2 Nghiên cứu khả năng chống oxy hóa 49

6.2.1 Phương pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH 49

6.2.1.1 Nguyên tắc 49

6.2.1.2 Quy trình thử hoạt tính bắt gốc tự do DPPH 49

6.2.1.3 Chuẩn bị hóa chất 50

6.2.2 Phương pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do NO 51

6.2.2.1 Nguyên tắc 51

6.2.2.2 Chuẩn bị hóa chất 52

6.2.2.3 Sơ đồ biểu diễn quy trình thử hoạt tính ức chế gốc tự do NO 52

6.2.3 Phương pháp ức chế enzyme XO 54

6.2.3.1 Nguyên tắc 54

6.2.3.2 Chuẩn bị hóa chất 54

6.2.3.3 Quy trình thử hoạt tính ức chế enzyme XO 54

6.3 Nghiên cứu độc tính tế bào 56

6.3.1 Phương pháp nghiên cứu sự phát triển tế bào 56

6.3.2 Phương pháp SRB 57

7 Tài Liệu Tham Khảo 63

ROS Reactive oxygen species

DNA Deoxyribonucleic acid

RNA Ribonucleic acid

NED N-1-naptyletilendiamin dihydroclorur

IC50 Half maximal inhibitory concentration

DMSO Dimethylsulfoxide

NaCl Sodium chloride

PBS Phosphate buffer saline

FBS Fetal bovin serum

TCA Trichloroacetic acid

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1 Tóm tắt kết quả thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH của PI, RES và PTS 21

Bảng 2 Tóm tắt kết quả thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH 21

Bảng 3 Tóm tắt kết quả thử hoạt tính ức chế gốc tự do NO 25

Bảng 4 Tóm tắt kết quả thử hoạt tính ức chế gốc enzyme XO 27

Bảng 5 Tóm tắt kết quả thử hoạt tính ức chế gốc enzyme XO của Allopurinol ở nồng độ từ 0.2 đến 5 uM 27

Bảng 6 Tóm tắt kết quả thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH, gốc tự do NO và enzyme XO của các chất 30

Bảng 7 Kết quả ảnh hưởng của ITR 300µM lên hình dạng tế bào 33

Bảng 8 Kết quả ảnh hưởng của ITR lên dạng hình học của tế bào 33

Bảng 9 Kết quả ảnh hưởng của SSR lên dạng hình học của tế bào 35

Bảng 10 Ảnh hưởng của RES lên dạng hình học của dòng tế bào DLD-1 40

Bảng 11 Ảnh hưởng của PTS lên dạng hình học của dòng tế bào DLD-1 41

Bảng 12 Ảnh hưởng của PI lên dạng hình học của dòng tế bào DLD-1 42

Bảng 13 Tóm tắt kết quả nghiên cứu độc tính tế bào theo phương pháp CC và SRB 44

Bảng 14.Cách pha dung dịch thử hoạt tính DPPH có nồng độ từ 10 đến 100 μM 50

Bảng 15 Cách pha dung dịch thử hoạt tính DPPH có nồng độ từ 1 đến 10 μM 51

Bảng 16.Cách pha dung dịch thử hoạt tính NO có nồng độ từ 10 đến 100 μM 53

Bảng 17 Cách pha dung dịch thử hoạt tính ức chế enzyme XO có nồng độ từ 10 đến 100 μM 56

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1 Phản ứng trung hòa gốc DPPH 7

Hình 2 Cơ chế phản ứng lên màu nitrit bằng thuốc thử Greiss 8

Hình 3 Cơ chế phản ứng lên màu của MDA và Acid thiobarbituric 9

Hình 4 Cơ chế xúc tác của XO cho phản ứng biến đổi xanthine thành acid uric 11

Hình 5 Phản ứng tạo acid uric 12

Hình 6 Khung sườn cấu trúc Lignan 14

Hình 7 Công thức cấu tạo của Isotaxiresinol 15

Hình 8 Công thức cấu tạo của Secoisolariciresinol 16

Hình 9 Khung sườn trans-stilbene 17

Hình 10 Khung sườn cis-stilbene 17

Hình 11 Công thức cấu tạo của Resveratrol 17

Hình 12 Công thức cấu tạo của Pterostilbene 18

Hình 13 Công thức cấu tạo của Piceatannol 19

Hình 14 Công thức cấu tạo của Quercetin 51

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 1 Quy trình thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH 50

Sơ đồ 2 Quy trình thử hoạt tính ức chế gốc tự do NO 53

Sơ đồ 3 Quy trình thử hoạt tính ức chế enzyme XO 55

DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ

Đồ thị 1 Biễu diễn % ức chế gốc tự do DPPH• theo nồng độ các chất 22

Đồ thị 2 Biễu diễn % ức chế gốc tự do NO theo nồng độ các chất 26

Đồ thị 3 Biễu diễn % ức chế enzyme XO theo nồng độ các chất 28

Đồ thị 4 Sự phụ thuộc thời gian phơi nhiễm ITR trên số tế bào 31

Đồ thị 5 Sự phụ thuộc nồng độ ITR trên sự phát triển tế bào theo SRB 32

Đồ thị 6 Biễu diễn ảnh hưởng của ITR lên đường kính tế bào DLD-1 34

Đồ thị 7 Sự phụ thuộc thời gian phơi nhiễm SSR trên số tế bào theo CC 34

Đồ thị 8 Sự phụ thuộc nồng độ SSR trên số tế bào theo SRB 35

Đồ thị 9 Ảnh hưởng của SSR lên đường kính của dòng tế bào DLD-1 36

Đồ thị 10 Sự phụ thuộc thời gian vào số tế bào phát triển dưới sự phơi nhiễm các chất RES, PTS, PI tương ứng với hình (A), (B), (C) theo phương pháp CC 38

Đồ thị 11 Sự phụ thuộc nồng độ của các chất phơi nhiễm RES, PTS và PI vào số tế bào tương ứng ở các hình (A), (B), (C) theo phương pháp SRB 39

Đồ thị 12 Ảnh hưởng của RES trên đường kính của dòng tế bào DLD-1 40

Đồ thị 13 Ảnh hưởng của PTS lên đường kính của dòng tế bào DLD-1 41

Đồ thị 14 Ảnh hưởng của PI lên đường kính của dòng tế bào DLD-1 42

1 Giới thiệu đề tài

Mặc dù việc sử dụng các sản phẩm thiên nhiên có hoạt tính sinh học như

là các loại thuốc thảo dược có từ cách đây vài trăm năm và thậm chí vài ngàn năm, tuy nhiên việc cô lập và mô tả các hợp chất đóng góp vào sự phát triển và khám phá các loại dược phẩm hiện đại chỉ mới bắt đầu từ thế kỷ 19, mở đầu cho

kỷ nguyên hóa học trị liệu của các hợp chất thiên nhiên

Hóa dược ngày nay phát triển dựa trên nền tảng của sự phát triển của hóa học các hợp chất có hoạt tính sinh học, là cầu nối của nhiều lĩnh vực khác nhau, bao gồm sự cô lập và mô tả đặc tính của các chất có hoạt tính sinh học từ nguồn gốc thiên nhiên, sự thay đổi cấu trúc để có sự tối ưu hóa hoạt tính và các tính chất vật lý khác, sự tổng hợp hoàn toàn hoặc bán tổng hợp cho quá trình nghiên cứu sâu mối quan hệ giữa hoạt tính và cấu trúc của các chất Thêm vào đó, quá trình tổng hợp các sản phẩm tự nhiên cũng đóng vai trò thiết yếu trong việc giải quyết vấn đề cung cấp và quảng bá dược phẩm

Từ những năm 1980, sự tiến bộ vượt bậc trong sinh học phân tử, hóa học tính toán, hóa học tổ hợp, và các kỹ thuật khảo sát lâm sàng nhanh đã định hình lại ngành công nghiệp dược phẩm và thay đổi cái nhìn của chúng ta vào các sản phẩm tự nhiên Một khi con người đã nghĩ rằng sự khám phá các sản phẩm tự nhiên ít có giá trị vì quá trình đòi hỏi rất nhiều thời gian và do đó là không kinh

tế Tuy nhiên, các sản phẩm tự nhiên đã vẫn tiếp tục tồn tại như là kết quả của quá trình nghiên cứu không thành công của hóa học tổ hợp và khảo sát lâm sàng

Từ đó, một lần nữa con người đã bắt đầu hiểu rõ giá trị của các sản phẩm tự nhiên và làm sống lại nghiên cứu các sản phẩm tự nhiên bằng cách kết hợp các

kỹ thuật tách và xác định nhanh, tổng hợp song song, tính toán và có lẽ thêm nhiều kỹ thuật mới vào trong hóa dược của các hợp chất thiên nhiên29

Các hợp chất phenolic đại diện cho một nhóm lớn của các phân tử với các nhóm chức khác nhau bao gồm nhiều loại như: các phenolic đơn giản (C6), phenolic acid và các dẫn xuất (C6-C1), acetophenone và phenylacetic acid, (C6-

C2), cinnamic acid, cinnamyl aldehyde, cinnamyl alcohol, coumarin, isocoumarin

và chromone (C6-C3), chalcone, aurone, dihydrochalcone, flavan, flavone, anthocyanidin, anthocyanin (C ), biflavonyl (C ), benzophenon, xanthone,

stilbene (C6-C1-C6, C6-C2-C6), quinone (C6, C10, C14), betacyanin (C18), dimer hoặc oligomer (lignan và neolignan), polymer (lignin), oligomer hoặc polymer (tannin), polymer (phlobaphene)55

Trong những thành phần thuộc họ phenolic đã được liệt kê ở trên, có lẽ

trans-resveratrol (RES), một hợp chất stilbene có nhiều trong quả nho, đậu

phộng, đậu nành,… đã được nghiên cứu nhiều về hoạt tính sinh học Các công bố khoa học cho thấy RES có các hoạt tính như kháng viêm, chống oxy hóa, ức chế sinh trưởng tế bào và các thuộc tính ngăn ngừa và bảo vệ tim mạch, Ngoài ra, RES cũng thể hiện hoạt tính kháng khuẩn 4,13,16,20,26,30,36,37,39,46,47,48,49,58

Các hợp chất stilbene khác, cụ thể là piceatannol (PIC) và

trans-pterostilbene (TPS), cũng được báo cáo là thể hiện các hoạt tính ngăn ngừa bệnh, kháng viêm và chống oxi hóa Các nghiên cứu sự ức chế sinh trưởng hay chu trình chết apoptosis được thực hiện trên các dòng tế bào lymphocyte, tế bào melanocyte, các tế bào dạng biểu bì 13,27,36,37,46,50

Trong khi đó, các hợp chất lignan được biết đến như là những estrogen thực vật, có hoạt tính chống oxy hóa mạnh Ngoài ra, các lignan như secoisolariciresinol (SSR) và isotaxiresinol (ITR) được công bố có hoạt tính ức chế chu trình chết của khối u gan 11,12,16,17,24,25

Từ các kết quả nghiên cứu về hoạt tính chống oxi hóa và độc tính tế bào của RES nên hiện nay hợp chất này được ứng dụng rộng rãi trong các loại dược phẩm hiện có trên thị trường Trong khi đó, các hợp chất khác thuộc họ phenolic cũng được tìm thấy có nhiều hoạt tính sinh học nhưng ít được sử dụng Do đó mục tiêu của đề tài này là xác định và so sánh hoạt tính chống oxy hóa và độc tính tế bào trên dòng tế bào DLD-1 của các hoạt chất RES, PTS, PI thuộc họ stilbene và SSR, ITR thuộc họ lignan Từ đó đề ra các hướng ứng dụng mới cho hợp chất tiềm năng và có thể thay thế RES

2 Giới thiệu một số phương pháp nghiên cứu khả năng chống oxi hóa

2.1 Khái niệm về gốc tự do

Oxy được xem như một nguyên tố quan trọng giúp con người duy trì sự sống, chúng tham gia vào quá trình hô hấp ở tế bào, sản sinh năng lượng cung

cấp cho mọi hoạt động sống của con người

Khoảng vài thập niên gần đây, các nghiên cứu khoa học đã chứng tỏ rằng oxy vào cơ thể tham gia nhiều quá trình sinh hóa và trong các quá trình đó oxy tạo ra những tiểu phân trung gian gọi là các gốc tự do Các gốc tự do có nguồn gốc oxy này có hoạt tính cao, kém bền vững và được gọi chung là các gốc dạng oxy hoạt động (ROS: Reactive oxygen species) 1,2

Ban đầu oxygen nhận một điện tử tạo ra gốc superoxyde (O2•–), đây là gốc

tự do quan trọng nhất của tế bào Từ superoxyde (O2•–) nhiều gốc tự do và các phân tử khác của oxy có khả năng phản ứng cao được tạo ra như hydroxyl (HO●), hydroperoxyl (HOO●), peroxyl (ROO●), alkoxyl (RO●), lipoperoxyde (LOO•), H2O2 2,10,18

Các dạng oxy hoạt động này do có năng lượng cao, kém bền nên dễ dàng phản ứng với những đại phân tử như protein, lipid, DNA, … gây rối loạn các quá trình sinh hóa trong cơ thể Đồng thời, khi một phân tử sống bị các gốc tự do tấn công, nó sẽ mất điện tử và trở thành một gốc tự do mới, tiếp tục phản ứng với những phân tử khác tạo thành một chuỗi phản ứng thường gọi là phản ứng dây chuyền, gây ra các biến đổi có tác hại đối với cơ thể 2,10

Gốc tự do được tạo ra bằng nhiều cách Nó có thể là sản phẩm của những căng thẳng tâm thần, bệnh hoạn thể xác, mệt mỏi, ô nhiễm môi trường, thuốc lá, dược phẩm, tia phóng xạ mặt trời, thực phẩm có chất màu tổng hợp, nước có nhiều chlorine và ngay cả oxy 9,10

2.2 Lợi ích của gốc tự do đối với cơ thể

Không phải là gốc tự do nào cũng có hại đối với cơ thể Nếu được kiểm soát, nó là nguồn cung cấp năng lượng cho cơ thể, tạo ra chất màu melamine cần

trùng, tăng cường miễn dịch, làm dễ dàng cho sự truyền đạt tín hiệu thần kinh, co bóp cơ thịt 2

2.3 Tác hại của gốc tự do đối với cơ thể

Gốc tự do có tác dụng không tốt cho cơ thể liên tục ngay từ lúc con người mới sinh ra và mỗi tế bào chịu sự tấn công của cả chục ngàn gốc tự do mỗi ngày Nếu không được kiểm soát, kiềm chế, gốc tự do gây ra các bệnh thoái hóa như: ung thư, xơ vữa động mạch, làm suy yếu hệ thống miễn dịch gây dễ bị nhiễm trùng, làm giảm trí tuệ, teo cơ quan bộ phận ở người cao niên, phá rách màng tế bào khiến chất dinh dưỡng thất thoát, tế bào không tăng trưởng, tu bổ, rồi chết Chúng tạo ra chất lipofuscin tích tụ dưới da khiến ta có những vết đồi mồi trên mặt, trên mu bàn tay Ngoài ra, chúng còn tiêu hủy hoặc ngăn cản sự tổng hợp các phân tử protein, đường bột, lipid, enzyme trong tế bào, gây đột biến ở gene, ở DNA, RNA, làm chất collagen, và elastin mất đàn tính, dẻo dai khiến da nhăn nheo, cơ khớp cứng nhắc 2,38

Theo các nhà nghiên cứu, gốc tự do hủy hoại tế bào theo chu trình sau đây: Trước hết, gốc tự do oxy hóa màng tế bào, gây trở ngại trong việc thải chất

bã và tiếp nhận thực phẩm, dưỡng khí rồi gốc tự do tấn công các ty lập thể, phá

vỡ nguồn cung cấp năng lượng Sau cùng, bằng cách oxy hóa gốc tự do làm suy yếu kích thích tố, enzyme khiến cơ thể không tăng trưởng được 2,38

Trong tiến trình hóa già, gốc tự do cũng góp phần và có thể là nguy cơ gây tử vong Hóa già được coi như một tích tụ những đổi thay trong mô và tế bào Theo bác sĩ Denham Harman, các gốc tự do là một trong nhiều nguyên nhân gây ra sự hóa già và sự chết của các sinh vật Ông cho là gốc tự do phản ứng lên

ty lạp thể, gây tổn thương các phân tử bằng cách làm thay đổi hình dạng, cấu trúc, khiến chúng trở nên vô dụng và mất khả năng sản xuất năng lượng 1,2 Theo các nhà khoa học thì gốc tự do có thể là thủ phạm gây ra tới trên 60 bệnh, đáng kể nhất gồm có: bệnh xơ vữa động mạch, ung thư, Alzheimer, Parkinson, đục thủy tinh thể, bệnh tiểu đường, cao huyết áp không nguyên nhân,

xơ gan 2

Các nghiên cứu cũng phát hiện rằng các gốc dạng oxy hóa hoạt động (ROS)

sẽ được loại bỏ bằng các chất chống oxy hóa tự nhiên có sẵn trong cơ thể như enzyme superoxid dismutase (SOD), enzyme glutathion peroxidase (GSP-Px), enzyme catalase (CAT)… để tạo sự cân bằng giữa các dạng oxy hoạt động và các dạng chống oxy hóa trong cơ thể con người Đó là một trạng thái cơ bản của cân bằng nội mô (homeostasis) Do ảnh hưởng của nhiều yếu tố tác động từ bên ngoài hay bên trong cơ thể, làm cân bằng này di chuyển theo hướng gia tăng các dạng oxy hoạt động Trạng thái sinh lý này gọi là stress oxy hóa (oxidative stress) Hay nói cách khác, stress oxy hóa là sự rối loạn cân bằng giữa các chất chống oxy hóa và các chất oxy hóa theo hướng tạo ra nhiều các chất oxy hóa 5,38

Ngày nay, do ảnh hưởng của điều kiện sống như: ô nhiễm môi trường, tiếng ồn, căng thẳng, lo lắng hay sử dụng các thực phẩm chứa nhiều chất oxy hóa

đã tạo điều kiện làm gia tăng gốc tự do, kéo theo sau đó là sự gia tăng các dạng oxy hoạt động Các dạng oxy hoạt động gia tăng, gây ra nhiều phản ứng bất lợi, tổn thương cho cơ thể và là nguyên nhân của nhiều căn bệnh nan y Do đó cần có những nghiên cứu, tìm hiểu về các chất có khả năng chống oxy hóa mang lại những tác dụng tốt, có lợi cho sức khỏe của con người Bên cạnh đó, chúng ta cũng cần khảo sát thêm những quy trình thử hoạt tính chống oxy hóa tối ưu và dễ thực hiện để phục vụ cho việc nghiên cứu Dưới đây chúng tôi xin giới thiệu một

số phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa đơn giản, ổn định và đã được

sử dụng rộng rãi trong thực tế

2.4 Các phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa

2.4.1 Phương pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH

Năm 1922 Goldschmidt và Renn đã phát hiện ra một gốc tự do bền có màu tím đậm, hầu như không phân hủy, không nhị trùng hóa và cũng không phản ứng với oxy đó chính là gốc tự do DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) DPPH•

là một gốc tự do có màu tím giống như màu của dung dịch KMnO4, không tan trong nước, tan trong dung môi hữu cơ Dung dịch DPPH có cực đại hấp thu tại bước sóng 517nm, và sản phẩm khử của nó là 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazine (DPPH-H) thì có màu vàng cam 3,5,8,19,23,36,51

Ngày nay DPPH được sử dụng để khảo sát khả năng ức chế gốc tự do Phương pháp này rất hữu hiệu được dùng phổ biến vì đơn giản, nhanh chóng và

dễ ổn định

Nguyên tắc

Các chất có khả năng kháng oxi hóa sẽ trung hòa gốc DPPH bằng cách cho hydrogen, làm giảm độ hấp thu tại bước sóng cực đại và màu của dung dịch phản ứng sẽ nhạt dần, chuyển từ tím sang vàng nhạt

Phản ứng trung hòa gốc DPPH của các chất kháng oxy hóa được minh họa bằng phản ứng được mô tả bên dưới:

Hình 1 Phản ứng trung hòa gốc DPPH

2.4.2 Phương pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do NO

Trong hệ thống thần kinh trung ương và ngoại biên, vai trò của NO rất quan trọng: Đóng vai trò dẫn truyền thần kinh, mang tín hiệu đến bất cứ nơi nào trong cơ thể, điều khiển cân bằng nội mô mạch não, điều hòa cảm nhận đau, điều khiển quá trình tư duy và trí nhớ 2,33,39

NO được sinh ra từ NOS tổ chức (nNOS và eNOS) sẽ ảnh hưởng lên trương lực cơ bản của mạch não và góp phần điều hòa vận mạch khi bị kích thích Vì vậy, sự rối loạn NO sẽ dẫn đến một số bệnh về não như bệnh: Alzeimer, thiếu máu não, đột quỵ 22

NO có một vai trò vô cùng quan trọng đối với cơ thể là tác nhân góp phần điều hòa huyết áp, ngoài ra NO còn là yếu tố gây giãn mạch nội sinh Nếu quá nhiều NO được sinh ra thì sự dãn mạch máu sẽ dẫn đến sự giảm huyết áp, và ngược lại, nếu lượng NO sinh ra ít sẽ dẫn đến hiện tượng tăng huyết áp 18

Sự rối loạn con đường chuyển hóa L-arginin – NO làm thay đổi nồng độ

NO tạo ra Những sự rối loạn này thường dẫn đến một số bệnh như: chứng tăng huyết áp, tiểu đường, béo phì, suy tim, xơ vữa động mạch, lão hóa, tổn thương mạch máu Ngoài ra, khi lượng NO sản xuất quá nhiều thì chính nó sẽ trở thành

DPPHH

chất nội độc tố và khi đó NO còn phản ứng với các ROS gây hại cho cơ thể, ví dụ gốc tự do ONOO-, là gốc nitrite gây hại cho cơ thể 2,7,9,18

có bước sóng hấp thu cực đại ở 540 nm Dựa trên sự giảm nồng độ nitrite tạo thành, ta tính được khả năng ngăn chặn gốc tự do NO của hoạt chất (tính trên %

ức chế) 5,8,33,39

Hình 2 Cơ chế phản ứng lên màu nitrite bằng thuốc thử Greiss

Thuốc thử Greiss là hỗn hợp của hai dung dịch: N-1-napthylethylene diamine dihydrochloride (NED) và sulfanilamide trong môi trường H3PO4 Cơ chế của phản ứng tạo sản phẩm màu diazo hóa như trên

2.4.3 Phương pháp xác định hàm lượng MDA

MDA (Malonyl dialdehyde) là sản phẩm cuối cùng của quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào nên được áp dụng rộng rãi trong thực tế để nghiên cứu quá trình peroxy hóa lipid của màng tế bào

Nguyên tắc

MDA được sinh ra trong quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào, khi cho phản ứng với acid thiobarbituric, một phân tử MDA phản ứng với hai phân tử acid thiobarbituric tạo phức màu hồng hấp thu cực đại ở bước sóng 532 nm, phản ứng được thực hiện ở môi trường pH bằng 2-3, nhiệt độ là 90-100oC trong thời gian từ 10 đến 15 phút Dựa trên sự giảm cường độ hấp thu của phức ta tính được khả năng kháng oxy hóa của chất cần nghiên cứu 3,5

Phản ứng tạo phức giữa MDA và acid thiobarbituric được biểu diễn như sau:

Hình 3 Cơ chế phản ứng lên màu của MDA và Acid thiobarbituric

Malonyl dialdehyd Acid thiobarbituric Phức

Trimethin

HN N

O

S H O

HN N

O

H

N O

S N O H

2.4.4 Phương pháp đánh giá khả năng kết hợp với ion sắt II (Iron chelating activity)

Nguyên tắc:

Ion sắt hay đồng ở trạng thái tự do dễ dàng xúc tác sinh ra gốc tự do Khi cho ion Fe2+ tác dụng với thuốc thử Ferrozin sẽ sinh ra phức màu có cực đại hấp thu tại bước sóng  = 562nm 5,7,28

Mẫu thử sẽ khóa các kim loại vào dạng phức, không cho kim loại tồn tại ở dạng tự do nên làm mất khả năng xúc tác của kim loại

Hoạt tính chống oxy hóa của mẫu thử sẽ được thể hiện qua việc ngăn chặn tạo thành phức chất có màu giữa ion Fe2+ với thuốc thử Ferrozin

2.4.5 Phương pháp thử hoạt tính ức chế enzyme Xanthine oxidase (XO) 2.4.5.1 Giới thiệu

Xanthine oxidase (XO) là một loại enzyme giữ vai trò quan trọng trong quá trình thoái hóa của purine, nó đóng vai trò là chất xúc tác cho phản ứng oxy hóa hypoxanthine thành xanthine và sau đó tiếp tục xúc tác cho phản ứng oxy hóa xanthine thành acid uric 5,7,38,51

2.4.5.2 Cấu tạo

Enzyme XO là một protein dimer đồng nhất (homodimeric protein) có phân tử lượng là 300000 Da, trong đó mỗi monomer của protein tổ chức gồm 3 phần (domain) chính: một phần chứa 2 tâm Fe2S2, một phần chứa tâm molybdenum (Mo) liên kết với pterin gọi là molybdopterin, một phần là flavin adenine dinucleotide (FAD) Trong đó phần chứa Mo là phần lớn nhất và là trung tâm hoạt tính xúc tác của enzyme, tâm Fe2S2 và FAD đóng vai trò là những chất vận chuyển điện tử trong quá trình oxy hóa được xúc tác bởi enzyme 21

2.4.5.3 Cơ chế hoạt động của enzyme XO

Enzyme XO là một trong ba loại enzyme chứa tâm hoạt tính xúc tác là molybdenum (XO, DMSO reductase, sulfite oxidase) Enzyme XO xúc tác cho

sự hydroxyl hóa các chất nền khác nhau theo phản ứng tổng quát:

RH + H2O ROH + 2H+ + 2e─

Phản ứng xảy ra tại tâm Mo, Mo bị khử từ Mo (VI) xuống Mo (IV), và trong quá trình phản ứng, các electron tạo thành được chuyển tới các tâm nhận electron trong enzyme 21

Với chất nền là xanthine, cơ chế phản ứng hydroxygen hóa dưới sự hiện diện của XO được các nhà khoa học đề nghị như sau 21:

Hình 4 Cơ chế xúc tác của XO cho phản ứng biến đổi xanthine thành acid uric

2.4.5.4 Nguyên tắc quy trình thử hoạt tính ức chế enzyme XO

Xanthine oxidase là một enzyme thân oxy hóa, xúc tác cho phản ứng oxy hóa xanthine tạo thành acid uric, đồng thời hình thành gốc tự do O2● Acid uric

có bước sóng cực đại hấp thu tại 290 nm Nếu mẫu thử có khả năng kháng

O

S

N

NNN

O

OH

HH

OSHNN

NNO

OSNN

NNO

OH

HH

HO , He

MoOHS

OSS

+

HNNH

NHN

O

O

OH

HNNH

NHNH

O

O

OXanthine

5 6 7

8 9

enzyme XO càng cao sẽ càng hạn chế sự hình thành acid uric, do đó sẽ làm giảm giá trị mật độ quang

Hình 5 Phản ứng tạo acid uricCác phương pháp thử hoạt tính chống oxy hóa trên ngày càng được sử dụng nhiều nhằm tìm ra những hợp chất có khả năng ức chế gốc tự do cũng như kháng các quá trình sinh ra nó, những hợp chất này được gọi là các chất kháng oxy hóa Chúng có thể được sinh ra từ cơ thể như hệ thống kháng oxy hóa có bản chất enzyme bao gồm enzyme SOD, CAT, GSH peroxidase đóng vai trò thiết yếu nhằm chống lại các gốc tự do độc hại sản sinh liên tục trong cơ thể, và những chất kháng oxy hóa có phân tử lượng thấp như glutathinon, vitamin E, vitamin C hoặc cũng có thể là những hợp chất có trong thực phẩm, rau quả như các hợp chất thuộc họ phenolic: flavonoid, stilbene, lignan, tannin 3,9

3 Giới thiệu phương pháp nghiên cứu độc tính tế bào

3.1 Nuôi cấy tế bào

Dòng tế bào ung thư ruột kết người DLD-1 được thu từ bộ sưu tập tế bào American Type và được nuôi cấy trong môi trường McCoy’5A có bổ sung các thành phần dinh dưỡng FBS 10%, gentamicin 0.1%, và ủ trong môi trường CO2

5% tại 37oC Tế bào phục vụ cho thí nghiệm được rửa bằng PBS và tách khỏi chai nuôi cấy tế bào bằng dung dịch trypsin 2%

HN

O

NH N

+ H2O + 2 O2 XO HN

NH NH O

O+ 2O2 + 2 H

enzyme XO càng cao sẽ càng hạn chế sự hình thành acid uric, do đó sẽ làm giảm giá trị mật độ quang

Hình 5 Phản ứng tạo acid uricCác phương pháp thử hoạt tính chống oxy hóa trên ngày càng được sử dụng nhiều nhằm tìm ra những hợp chất có khả năng ức chế gốc tự do cũng như kháng các quá trình sinh ra nó, những hợp chất này được gọi là các chất kháng oxy hóa Chúng có thể được sinh ra từ cơ thể như hệ thống kháng oxy hóa có bản chất enzyme bao gồm enzyme SOD, CAT, GSH peroxidase đóng vai trò thiết yếu nhằm chống lại các gốc tự do độc hại sản sinh liên tục trong cơ thể, và những chất kháng oxy hóa có phân tử lượng thấp như glutathinon, vitamin E, vitamin C hoặc cũng có thể là những hợp chất có trong thực phẩm, rau quả như các hợp chất thuộc họ phenolic: flavonoid, stilbene, lignan, tannin 3,9

3 Giới thiệu phương pháp nghiên cứu độc tính tế bào

3.1 Nuôi cấy tế bào

Dòng tế bào ung thư ruột kết người DLD-1 được thu từ bộ sưu tập tế bào American Type và được nuôi cấy trong môi trường McCoy’5A có bổ sung các thành phần dinh dưỡng FBS 10%, gentamicin 0.1%, và ủ trong môi trường CO2

5% tại 37oC Tế bào phục vụ cho thí nghiệm được rửa bằng PBS và tách khỏi chai nuôi cấy tế bào bằng dung dịch trypsin 2%

HN

O

NH N

+ H2O + 2 O2 XO HN

NH NH O

O+ 2O2 + 2 H

3.2 Các phương pháp nghiên cứu độc tính tế bào

3.2.1 Phương pháp nghiên cứu sự phát triển tế bào

Nghiên cứu sự phát triển của tế bào dựa trên phương pháp đếm tế bào sinh

ra hoặc tế bào phát triển theo thời gian Phương pháp đếm tế bào và xác định kích thước dựa trên sự phát hiện và sự đo lường sự thay đổi điện trở được sinh ra bởi các hạt hoặc tế bào hiện diện lơ lửng trong dung dịch dẫn điện (nước muối 0.9%) chạy vào lỗ có kích thước nhỏ theo phương ngang 37

Tế bào được pha loãng vào dung dịch dẫn điện, chúng đóng vai trò như các hạt cách điện riêng lẻ Khi dung dịch pha loãng của tế bào được hút thông qua một lỗ nhỏ hình trụ, mỗi một hạt hoặc một tế bào riêng lẽ vượt qua lỗ ngay lập tức điều biến dòng điện giữa hai điện cực đặt chìm trong dung dịch ở mỗi bên của lỗ nhỏ Trong khi đó, số xung hiển thị số hạt hoặc số tế bào đi qua lỗ, và biên

độ của xung điện phụ thuộc vào thể tích của hạt hoặc tế bào Điện trở có hiệu quả giữa hai điện cực là do trở kháng của dung dịch dẫn điện (nước muối) trong khoảng ranh giới của lỗ nhỏ Sự hiện diện các hạt hoặc tế bào bên trong ranh giới của lỗ nhỏ làm tăng trở kháng của đường dẫn và độ lớn của trở kháng phụ thuộc vào thể tích của hạt hoặc tế bào 44

Phân tích lý thuyết và thực tế về khả năng đáp ứng khác nhau của các hạt bên trong lỗ nhỏ cho thấy độ cao của xung điện là đặc trưng chủ yếu tỷ lệ với thể tích của tế bào, phương pháp này cho phép lựa chọn đếm các hạt hoặc tế bào trong khoảng phân bố kích thước rất hẹp bằng cách lựa chọn xung điện tử 44

Dưới các điều kiện môi trường axit nhẹ, SRB liên kết với các dư lượng amino acid trên các protein của các tế bào đã được cố định bằng trichloroacetic

acid (TCA) và sử dụng bazơ yếu như Tris-base để hòa tan và đo mật độ quang của dịch chiết từ tế bào một cách định lượng 22,31,40,57

4 Tổng quan các chất nghiên cứu thuộc họ lignan và stilbene

4.1 Lignan

Lignan đã được phát hiện bởi R.D Haworth vào năm 1936 Một loại dẫn xuất của phenylpropan có cấu tạo gồm hai đơn vị phenylpropan (C6-C3) liên kết với nhau tại vị trí β-β/ của C355

Hình 6 Khung sườn cấu trúc Lignan

Chúng có vai trò hỗ trợ trong cấu tạo của lignins, những polyphenol khu trú ở các vách tế bào thực vật, có vai trò cùng với cellulose làm cho thân và cành trở nên cứng cáp và là chất đặc trưng cho các cây thân gỗ 25,53,55

Lignan là những phytoestrogen, vai trò của phytoestrogen trong thực vật chưa được xác định một cách rõ ràng, nhưng có bằng chứng cho thấy hợp chất này có chức năng chống nấm hay nhuộm cây 25,12,17

Một số nghiên cứu gần đây cho thấy nó gián tiếp có nhiều hoạt tính sinh học như ngăn ngừa vi khuẩn, trị nấm, kháng virus, chống ung thư, chống viêm khớp và hoạt tính chống oxy hóa mạnh, … 11,12,16,19,24,25,56

acid (TCA) và sử dụng bazơ yếu như Tris-base để hòa tan và đo mật độ quang của dịch chiết từ tế bào một cách định lượng 22,31,40,57

4 Tổng quan các chất nghiên cứu thuộc họ lignan và stilbene

4.1 Lignan

Lignan đã được phát hiện bởi R.D Haworth vào năm 1936 Một loại dẫn xuất của phenylpropan có cấu tạo gồm hai đơn vị phenylpropan (C6-C3) liên kết với nhau tại vị trí β-β/ của C355

Hình 6 Khung sườn cấu trúc Lignan

Chúng có vai trò hỗ trợ trong cấu tạo của lignins, những polyphenol khu trú ở các vách tế bào thực vật, có vai trò cùng với cellulose làm cho thân và cành trở nên cứng cáp và là chất đặc trưng cho các cây thân gỗ 25,53,55

Lignan là những phytoestrogen, vai trò của phytoestrogen trong thực vật chưa được xác định một cách rõ ràng, nhưng có bằng chứng cho thấy hợp chất này có chức năng chống nấm hay nhuộm cây 25,12,17

Một số nghiên cứu gần đây cho thấy nó gián tiếp có nhiều hoạt tính sinh học như ngăn ngừa vi khuẩn, trị nấm, kháng virus, chống ung thư, chống viêm khớp và hoạt tính chống oxy hóa mạnh, … 11,12,16,19,24,25,56

4.1.1 Isotaxiresinol (ITR)

Isotaxiresinol, một dạng aryltetralin, là chất bột màu trắng, không tan trong nước, tan tốt trong dung môi hữu cơ (DMSO, ethanol, methanol…) Nó

được tìm thấy nhiều trong 1 vài loài Taxus như: T baccata, T brevifolia, T

cuspidata, T floridana, T mairei, và T yunnanensis… 11,12,25,55

 Công thức phân tử : C19H22O6

 Khối lượng phân tử : 346.37

 Công thức cấu tạo :

Hình 7 Công thức cấu tạo của Isotaxiresinol

Cũng như các hợp chất khác của lignan, isotaxiresinol được cho là một hợp chất có khả năng kháng ung thư, chống oxy hóa….Chính vì thế mà hợp chất này ngày càng được chú ý đến nhiều hơn 24,55

4.1.2 Secoisolariciresinol (SSR)

Secoisolariciresinol thuộc nhóm dibenzylbutan của họ lignan, ở dạng bột, màu trắng, tan tốt trong các dung môi hữu cơ

OHOH

OH

MeO

HO

OH

Hợp chất secoisolariciresinol được tìm thấy trong một vài loài Taxus như

T baccata, T brevifolia, T floridana, T mairei….11,12,24,25,55,35

 Công thức phân tử: C20H26O6

 Khối lượng phân tử: 362.41

 Công thức cấu tạo:

Hình 8 Công thức cấu tạo của Secoisolariciresinol

Secoisolariciresinol là hợp chất quan trọng trong họ lignan, có rất nhiều hoạt tính sinh học như hoạt tính kích thích miễn dịch (immunostimulatory

activity), chống oxy hoá, chống lại dòng tế bào Caco-2 (colon

adenocarcinoma),… 11,12,17,25

4.2 Stilbene

Stilbene có cấu trúc C6-C2-C6 Stilbene là những bồ thể thực vật (phytoalexin), có tác dụng phản ứng lại sự tấn công của nấm, vi khuẩn và mầm bệnh do virus Khung sườn cấu trúc của phân tử gồm có 2 vòng thơm nối lại với nhau bởi liên kết đôi styrene Do sự hiện diện của nối đôi nên stilbene luôn có

đồng phân dạng cis- và trans- Dạng trans – có hình dạng được ưu tiên hơn trong

hình học và tương đối ổn định với ánh sáng đồng thời chịu được pH cao nên chiếm ưu thế hơn trong tự nhiên 55

OHOH

MeO

HO

OMeOH

OH

OH E

Hình 9 Khung sườn trans-stilbene Hình 10 Khung sườn cis-stilbene

4.2.1 Resveratrol (RES)

Resveratrol (3, 5, 4/-trihydroxy-trans-stilbene) là một bồ thể thực vật và là

một hợp chất phenol xuất hiện trong thiên nhiên thuộc họ stilbene tìm thấy trong hơn 70 loài thực vật như: nho, mận, đậu phộng,… Hàm lượng tương đối cao trong vỏ nho chứa từ 50-100mg.g-1, và trong rượu chứa từ 0.2 -7.7 mg.l-1

4,15,16,30,47

 Tên quốc tế : trans-3, 4’, 5-trihydroxystilbene

 Tên thông thường : trans-resveratrol

 Khối lượng phân tử : 228.25

 Công thức phân tử : C14H12O3

 Công thức hóa học :

vì gốc tự do là trung gian của quá trình peroxy hóa màng lipid và oxy hóa DNA (gây ra nhiều chứng bệnh cho con người) 4,13,16,26,58

4.2.2 Pterostilbene (PTS)

Pterostilbene là một dạng methoxy của resveratrol, ở dạng tinh thể rắn, hầu như không tan trong nước, tan trong dung môi hữu cơ 43,55

 Tên khoa học : trans-3,5-Dimethoxy-4′-hydroxystilbene

 Tên thông thường : Pterostilbene

 Khối lượng phân tử : 256.3

 Công thức phân tử : C16H16O3

 Công thức cấu tạo :

Hình 12 Công thức cấu tạo của Pterostilbene

Pterostilbene có nhiều đặc tính như kháng oxy hóa, giảm glucose trong máu, tăng cường trí nhớ, hoạt tính ức chế COX-1 và COX-2 ( IC50= 19.8M và 83.9M) và gây ra bệnh thiếu dinh dưỡng trong tế bào HL60 (IC50= 70M) 41

4.2.3 Piceatannol (PI)

 Tên khoa học : 3,4,3',5'-tetrahydroxy-trans-stilbene

 Công thức phân tử : C14H12O4

 Khối lượng phân tử : 224.24

 Công thức cấu tạo :

Hình 13 Công thức cấu tạo của Piceatannol

Piceatannol là một dạng đặc biệt của resveratrol, được tìm thấy trong nho

và rượu vang đỏ nhưng với hàm lượng thấp hơn so với resveratrol 4,16,47

Tuy nhiên piceatannol có hoạt tính mạnh hơn cả resveratrol ở một số dòng tế bào đã nghiên cứu, và có thể có tác dụng ngăn ngừa nhiều bệnh khác nhau, điển hình là nhiều nghiên cứu cho thấy piceatannol đóng một vai trò quan trọng trong hoạt tính chống ung thư, làm trì hoãn sự tấn công của các khối u

13,36,46,50

Hiện nay trong số các chất thuộc họ phenol, các nhà khoa học rất quan tâm đến hoạt tính sinh học của nhóm lignan cũng như nhóm stilbene Một số công bố cho thấy các lignan có hoạt tính ngăn ngừa vi khuẩn, kháng virus, ức chế các tế bào gây viêm gan, làm giảm bệnh tiểu đường… trong khi các stilbene có khả năng chống oxy hóa tốt, cải thiện trí nhớ, tăng tuổi thọ, ngăn ngừa sự di căn của tế bào ung thư Trong một nghiên cứu trước đây của TS Nguyễn Trung Nhân, bộ môn hóa hữu cơ, trường ĐH KHTN TPHCM đã cô lập được hai lignan

HO

OH

OH

OH E

tài này, chúng tôi mong muốn tìm hiểu hoạt tính chống oxy hóa của nhóm lignan nhƣ: secoisolariciresinol, isotaxiresinol và nhóm stilbene nhƣ: resveratrol, pterostilbene và piacetannol để cung cấp thêm những bằng chứng cho các hoạt tính sinh học khác của chúng

5 Kết quả và thảo luận

5.1 Kết quả nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa

5.1.1 Kết quả thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH

Khi tiến hành thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH trên ba chất PI, RES

và PTS chúng tôi thu đƣợc kết quả tóm tắt ở bảng 1 nhƣ sau:

IC 50 (μM)

PI 81.1 ± 1.3 72.9 ± 2.1 69.8 ± 2.8 30.5 ± 0.8 17.4 RES 73.5 ± 2.1 57.6 ± 0.7 40.6 ± 2.5 21.9 ± 0.2 38.9 PTS 63.2 ± 0.9 46.9 ± 0.4 29.2 ± 1.5 13.8 ± 0.6 59.5

Bảng 1 Tóm tắt kết quả thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH của PI, RES và

PTS

Ba chất quercetin, isotaxiresinol và secoisolariciresinol do có IC50 < 10

μM nên tiếp tục đƣợc thử hoạt tính ở các nồng độ 10, 5, 2, 1μM.Và thu đƣợc kết quả ở bảng 2 nhƣ sau:

ITR 68.6 ± 1.6 36.3 ± 0.7 15.7 ± 1.5 9.9 ± 1.8 7.1 SSR 52.5 ± 0.5 34.6 ± 2.5 12.9 ± 0.5 6.3 ± 0.4 9.3 Quercetin 81.3 ± 0.1 53.8 ± 0.2 14.2 ± 2.0 6.9 ± 0.8 4.7

Bảng 2 Tóm tắt kết quả thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH

Kết quả cho thấy cả 5 chất khảo sát đều có khả năng ức chế gốc tự do DPPH Trong đó, ITR và SSR có hoạt tính mạnh với IC50 < 10μM (giá trị IC50

lần lƣợt là 7.1 μM và 9.3 μM) và kế đến là PI với IC50 = 17.4 μM, RES có IC50 =

38.9 μM Hoạt tính ức chế gốc tự do yếu nhất trong 5 chất chính là PTS với giá trị IC50 = 59.5 μM

Thứ tự giảm dần khả năng ức chế gốc tự do DPPH được thể hiện trên đồ thị 1 như sau: ITR > SSR > PI > RES > PTS

Tuy nhiên, kết quả cho thấy vị trí của nhóm hydroxyl (-OH) quan trọng hơn so với số nhóm hydroxyl có trong hợp chất

Theo các nghiên cứu trước đây, cơ chế kháng gốc tự do của hợp chất phenol đều do khả năng cho hydrogen của nhóm hydroxyl (-OH) gắn trên vòng thơm quyết định Nhưng khả năng cho hydrogen của nhóm hydroxyl (-OH) ưu

tiên hơn tại vị trí –orto và –para, nhóm –OH tại vị trí –meta thì hầu như không

có khả năng kháng gốc tự do 20,36,43

Lý thuyết này đúng cho trường hợp của RES, nhiều tài liệu công bố cho thấy rằng phần tử quyết định chủ yếu hoạt tính chống oxy hóa của RES là do

nhóm –OH trên vòng B (nhóm –OH tại vị trí –para trên vòng) quyết định 27,30,43

Khi so sánh RES và PTS, 2 hợp chất có cấu trúc tương tự nhau, có cùng một nhóm –OH trên vòng B ta thấy: hoạt tính chống oxy hóa của PTS yếu hơn so với RES điều này là do sự thay thế 2 nhóm –OH trên vòng A của RES thành 2 nhóm –OMe trên vòng A của PTS

Hoạt tính kháng oxy hóa của PI mạnh hơn RES và PTS là do PI có 2 nhóm –OH kế cận nhau trên vòng B (tạo thành cấu trúc diol)

A

PTS

Đối với nhóm lignan, cả 2 hợp chất khảo sát đều có hoạt tính ức chế gốc

tự do cao (ITR; IC50 = 7.1 M và SSR; IC50 = 9.2 M), cao hơn cả nhóm stilbene

là do cấu trúc lignan có 2 nhóm –OH tại vị trí –para trong khi nhóm stilbene chỉ

chứa 1 nhóm –OH tại vị trí –para Ngoài lý do trên thì hoạt tính chống oxy hóa

cao của lignan còn do sự kết hợp của nhóm -OH tại vị trí –para với nhóm –OH

hay nhóm methoxy (-OMe) tại vị trí –meta gây ra 19,20,36,43,56

Quan sát 2 hợp chất của lignan ta thấy, khi thay thế 1 nhóm –OH trong

cấu trúc diol bằng 1 nhóm -OMe thì khả năng ức chế gốc tự do sẽ yếu hơn: ITR

(IC50 = 7.1 M) > SSR (IC50 = 9.2M)

OHOH

MeO

HO

OMeOH

SSR

OHOH

PI

Bảng 3 Tóm tắt kết quả thử hoạt tính ức chế gốc tự do NO

Trong 5 chất khảo sát chỉ có 3 chất có hoạt tính ức chế gốc tự do NO Trong đó ITR có hoạt tính mạnh nhất với IC50 = 36.2 M, PI có hoạt tính vừa phải IC50 = 47.4 M, tiếp đến SSR có hoạt tính hơi yếu với IC50 = 61.9M

Tuy nhiên, có một sự thay đổi nhỏ giữa thứ tự của SSR và PI là trong phương pháp thử hoạt tính ức chế DPPH, SSR mạnh hơn PI với giá trị IC50

lần lượt là 9.2 μM và 17.4 μM, còn trong phương pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do NO thì PI có khả năng ức chế gốc NO tốt hơn SSR Sự thay đổi này

là do cấu trúc diol trong hai chất PI và SSR 33,39

5.1.3 Kết quả thử hoạt tính ức chế enzyme XO

Kết quả thử hoạt tính ức chế enzyme XO của các mẫu được thể hiện trong bảng 4 và đồ thị 3

99.5  3.2 95.38  1.4 < 10

Bảng 4 Tóm tắt kết quả thử hoạt tính ức chế gốc enzyme XO

Do allopurinol có hoạt tính ức chế XO rất mạnh, nên tiếp tục được thử ở các nồng độ nhỏ hơn kết quả thử hoạt tính của allopurinol được cho trong bảng 5 dưới đây

74.8  1.8