6. Thực nghiệm
6.2.3 Phƣơng pháp ức chế enzyme XO
6.2.3.1 Nguyên tắc
Xanthine oxidase là một enzyme thân oxy hóa, xúc tác phản ứng oxy hóa xanthine tạo acid uric, đồng thời hình thành gốc tự do O2●. Để thử hoạt tính ức chế XO ngƣời ta sử dụng phƣơng pháp trắc quang để đo mật độ quang của acid uric hình thành khi có và không có mẫu thử. Acid uric có bƣớc sóng cực đại hấp thu tại 290 nm. Chất có khả năng kháng enzyme XO càng cao sẽ càng hạn chế sự hình thành acid uric, do đó mật độ quang của acid uric sẽ giảm.
6.2.3.2 Chuẩn bị hóa chất
Đệm phosphate 70 mM, pH = 7.5: cân 3.702 g NaH2PO4.2H2O và 16.57 g Na2HPO4.12H2O định mức thành 1000ml bằng nƣớc cất 2 lần. Dùng NaOH và H3PO4 điều chỉnh pH đến 7.5 bằng máy pH.
Xanthine oxidase 0.05 U/ml: pha từ XO 25 U/ml theo nguyên tắc pha loãng (Một unit (U) của XO đƣợc định nghĩa là một lƣợng enzyme cần thiết để tạo ra 1 µmol của acid uric trong 1 phút ở 250C).
Xanthine 150 µM: cân chính xác 1.14 mg xanthine, pha trong bình định mức 50ml bằng đệm phosphate 70 mM pH=7.5.
HCl 1N: rút 16.7 ml HCl đậm đặc (37 %) thêm nƣớc cất 2 lần thành 200ml.
Dung dịch mẫu làm việc có nồng độ 500μM.
6.2.3.3 Quy trình thử hoạt tính ức chế enzyme XO
Quy trình thử hoạt tính ức chế enzyme XO đƣợc tóm tắt bằng sơ đồ 3 dƣới đây:
55 Sơ đồ 3. Quy trình thử hoạt tính ức chế enzyme XO.
- 100l XO (0.05U/ml) - Ủ 15 phút ở nhiệt độ phòng V1l mẫu (500M) V2 µl đệm pH 7.5 Dung dịch sau ủ - 900l Xanthine 150M - Ủ lần 2 (30 phút) Dung dịch sau ủ lần 2 - 200l HCl 1N Đo tại = 293nm
56 Mẫu thử và mẫu control đƣợc pha theo bảng 17 sau:
C (μM) control 100 50 25 10 V1 mẫu(μl) 0 600 300 150 60 V2 đệm(μl) 1800 1200 1500 1650 1740 VXO (μl) 100 Vxanthine(μl) 900 VHCl 1N(μl) 200
Bảng 17. Cách pha dung dịch thử hoạt tính ức chế enzyme XO có nồng độ từ 10 đến 100 μM.
Tƣơng ứng với mỗi nồng độ mẫu thử ta làm một mẫu trắng (blank), mẫu trắng tƣơng tự nhƣ mẫu thử nhƣng thay 100μl XO bằng 100μl đệm.
Để có cơ sở đánh giá hoạt tính của những mẫu chất khảo sát đối với enzyme XO, chúng tôi sử dụng allopurinol làm chất đối chứng dƣơng, đây là một hợp chất ức chế enzyme XO rất mạnh, đã đƣợc sử dụng làm thuốc để chữa trị bệnh gút.
6.3 Nghiên cứu độc tính tế bào
6.3.1 Phƣơng pháp nghiên cứu sự phát triển tế bào
Dòng tế bào DLD-1 sử dụng cho thực nghiệm đƣợc cho vào từng giếng của đĩa 24 giếng với mật độ khoảng 3.0 x 104 tế bào/giếng và đƣợc ủ qua đêm trong môi trƣờng CO2 5% tại 37oC để đảm bảo tế bào kết dính vào đáy giếng và sau đó tế bào đã sẵn sàng cho thí nghiệm.
Chuẩn bị các dung dịch các chất cần kiểm tra độc tính RES (0-60µM), PI (0-60µM), PTS (0-60µM), ITR (0-300µM), SSR (0-300µM) trong môi trƣờng nuôi cấy tế bào (Fetal serum), trƣớc khi xử lý tế bào với các dung dịch trên, môi trƣờng tế bào cũ cần đƣợc rửa sạch bằng cách sử dụng 1ml PBS, sau đó đem ủ cho khảo sát ở 24, 48 và 72 giờ trong môi trƣờng CO2 5% tại 37oC.
57 Sau khi đƣợc ủ tới thời gian cần khảo sát, tế bào đƣợc chụp ảnh sử dụng hệ thống kính hiển vi tƣơng phản pha Leica DMIRB (Leica Microsystem A/S) với độ phóng đại 200 lần. Sau đó, tế bào đƣợc rửa sạch bằng PBS (1ml/giếng), thêm trysine (0.2ml/giếng) để thực hiện quá trình trypsin hóa tách tế bào ra khỏi đáy giếng, tiếp tục thêm PBS (0.8ml/giếng), sau đó sử dụng pipet hút và xả ở lực mạnh cho tế bào tách khỏi nhau.
Dùng micropipet hút chính xác 800µl dung dịch tế bào đã chuẩn bị ở trên cho vào cốc đo có chứa 10ml NaCl 0.9%, sau đó thực hiện bƣớc đếm tế bào sử dụng máy đếm Coulter Z2, Beckman Coulter cho tế bào có kích thƣớc lớn hơn 11µm.
Quá trình phát triển của tế bào đƣợc thể hiện trên số tế bào và phần trăm tế bào đã đƣợc xử lý với chất cần khảo sát so với mẫu control (tế bào trong môi trƣờng nuôi cấy với DMSO).
6.3.2 Phƣơng pháp SRB
Sulforhodamine B (SRB) 0.2% đƣợc chuẩn bị bằng cách hòa tan 0.1g SRB vào 50ml axit acetic 1% và lắc đều, thuốc thử đƣợc chứa trong lọ sẫm màu và giữ lạnh cho đến khi sử dụng.
Trichloroacetic acid (TCA) 50% đƣợc chuẩn bị bằng cách thêm 50g tinh thể TCA vào 100mml nƣớc cất khử ion, đƣợc lƣu trong lọ thủy tinh và giữ lạnh cho đến khi sử dụng.
Chuẩn bị dung dịch đệm Tris[hydroxymethyl]aminomethane 10mM bằng cách hòa tan 0.605g Tris-base vào 500 ml nƣớc và đƣợc giữ lạnh đến khi sử dụng.
Quy trình phƣơng pháp SRB:
1. Cho 100 μL tế bào vào đĩa 96 giếng sao cho lƣợng tế bào khoảng 10.000 tế bào/giếng sau đó ủ qua đêm trong môi trƣờng CO2 5% tại 37oC.
58 2. Kiểm soát sự phát triển, sự phân bố của tế bào trong giếng và mật độ tế bào trong các giếng khác nhau sử dụng kính hiển vi tƣơng phản pha.
3. Thêm 100 μL/giếng môi trƣờng nuôi cấy không có chứa chất khảo sát vào các giếng blank và control.
4. Thêm 100 μL/giếng môi trƣờng nuôi cấy có chứa chất khảo sát ở các nồng độ khác nhau vào đĩa 96 giếng theo thiết kế thí nghiệm.
5. Ủ tế bào trong môi trƣờng CO2 5% tại 37oC đến các thời gian cần khảo sát sự phát triển tế bào phụ thuộc vào thời gian phơi nhiễm các chất (24, 48, 72 giờ). 6. Sau 24 giờ, dừng tiến hành quá trình nuôi cấy cho đĩa khảo sát quá trình phát triển tế bào ở 24 giờ để tiến hành đo mật độ quang của tế bào theo các bƣớc sau. 7. Cố định lƣợng protein trong tế bào sử dụng 100 μL TCA 10% (4°C)/giếng, sau đó giữ lạnh đĩa ở 4°C ít nhất 1 giờ bằng cách đặt đĩa trong tủ lạnh trƣớc khi phân tích bằng phƣơng pháp SRB.
8. Sử dụng nƣớc cất khử ion (200 μL/giếng) để loại và rửa sạch TCA khoảng 5 lần và để khô tự nhiên trong không khí.
9. Dùng pipet lấy 100 μL dung dịch SRB cho vào mỗi giếng và nhuộm màu trong vòng 30 phút.
10. Sử dụng miro-pipet điện tử 8 kênh để loại SRB ra khỏi giếng và dùng acit acetic 1% để rửa sạch SRB, sau đó để khô tự nhiên trong không khí.
11. Để khô đĩa tự nhiên trong không khí cho đến khi không còn thấy ẩm bên trong giếng.
12. Hòa tan protein đã nhuộm màu bằng 100 μL Tris base 10 mM trên mỗi giếng. Lắc đĩa nhẹ trong vòng 10 phút để hòa tan và đồng nhất hóa chất nhuộm trong giếng.
13. Tiến hành đo mật độ quang sử dụng máy đọc ELISA ở bƣớc sóng 492 nm và sử dụng bƣớc sóng 620 nm làm so sánh.
59 14. Mật độ quang của mỗi giếng tỷ lệ trực tiếp với số tế bào, do đó có thể vẽ đồ thị biễu diễn sự phụ thuộc giá trị mật độ quang theo nồng độ chất khảo sát và tính toán giá trị IC50.
60 Trong đề tài này chúng tôi đã nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa và độc tính tế bào của một số chất thộc họ lignan và stilbene, kết quả cho thấy:
Hai lignan, SSR và ITR, có hoạt tính chống oxi hóa tƣơng đối mạnh thông qua việc ức chế gốc tự do DPPH và NO, giá trị IC50 lần lƣợt là 9.2 và 7.1 M đối với gốc DPPH và 61.9 và 36.2 M đối với gốc NO, nhƣng lại không có tác dụng ức chế sự phát triển của dòng tế bào DLD-1. Điều này cho thấy hạn chế của việc ứng dụng hai hợp chất này vào các loại dƣợc phẩm điều trị các bệnh liên quan đến dòng tế bào DLD-1. Tuy nhiên, có thể phát triển hƣớng nghiên cứu tiếp theo cho các dòng tế bào khác để chứng minh khả năng chống oxy hóa rất mạnh của hai hợp chất này.
Ba hợp chất stilbene, RES, PTS và PI có hoạt tính chống oxi hóa trung bình nhƣng lại có tác dụng ức chế sự phát triển của dòng tế bào DLD-1 mạnh, giá trị IC50 lần lƣợt là 30.8, 32.8 và 64.3M theo phƣơng pháp đếm tế bào và 76.3, 44.6 và 117.9M theo phƣơng pháp SRB. Kết quả nghiên cứu đã chứng minh rằng, các hoạt tính sinh học nhƣ chống ung thƣ, tiểu đƣờng, tim mạch của các hợp chất thuộc họ stilbene này do hoạt tính chống oxy hóa của chúng. Bên cạnh đó, độc tính tế bào của các hợp chất này cho thấy khả năng ứng dụng của chúng.
Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của RES lên dạng hình học của tế bào cũng phù hợp với các nghiên cứu trƣớc đây trên dòng tế bào HeLa 4. Điều này khẳng định ảnh hƣởng mạnh của RES lên dòng tế bào DLD-1.
Trong số các hợp chất nghiên cứu cho thấy chỉ có PI thể hiện tất cả các hoạt tính nhƣ ức chế NO, ức chế DPPH và ức chế enzyme XO, độc tính tế bào đối với dòng tế bào DLD-1, vì vậy cần có những nghiên cứu sâu hơn nhƣ là khảo sát khả năng chống peroxy hóa lipid màng tế bào theo phƣơng pháp xác định hàm lƣợng MDA, nghiên cứu về chu kỳ tế bào theo phƣơng pháp flow cytometry, nghiên cứu chu trình chết (apotosis) trên các dòng tế bào khác nhau, từ đó đánh giá thêm các hoạt tính sinh học khác của PI để có thể sử dụng chất
63
7. Tài Liệu Tham Khảo
1. HTTP://en.wikipedia.org/wiki/Free-radical_theory. 2. HTTP://en.wikipedia.org/wiki/Reactive_oxygen_species.
3. HỒ HUỲNH THÙY DƢƠNG, Nghiên cứu tác động kháng ung thƣ, chống oxi hóa của cây thuốc Việt Nam bằng các phƣơng pháp sinh học phân tử, Tuyển tập các báo cáo NCCB trong KHTN, 2005.
4. NGUYỄN THÚY VY, Effects of resveratrol on human cancer cell adhesion, DANIDA project work, 2007.
5. VIỆN DƢỢC LIỆU, Phƣơng pháp nghiên cứu tác dụng dƣợc lý của thuốc từ dƣợc thảo, NXB Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội, 2006, 279-292.
6. CROZIER.A, CLIFFORD.M.N, ASHIHARA.H, Plant Secondary Metabolites Occurrence, Structure and Role in the Human Diet, Blackwell Publishing, 2006, 12-19.
7. RICE-EVANS. C.A, DIPLOCK.A. T, SYMONS. M. C. R, Techniques In Free Radical Research, Elsevier Sci.BV, 1991, 22, 146-150.
8. RAUSHANARA AKTER, S. M. RAQUIBUL HASAN, MD. MOKARRAM HOSSAIN, MARIAM JAMILA, MD. EHSANUL HOQUE MAZUMDER, SHAFIQUR RAHMAN, In Vitro Antioxidant and In Vivo Antidiarrhoeal Activity of Hydromethanolic Extract of
Xanthium Indicum Koenig Leaves, Eur.J.Sci.Res, 2009, 33, 305-312. 9. DONALD ARMSTRONG, Oxidants and Antioxidants, Ultrastructure and
Molecular Biology Protocols, Humana Press, 2002, Volume 196, 3-12. 10. HALLIWELL. B, Reactive oxygen species in living systems, Am.J.Med,
11. ARJUN H. BANSKOTA, NHAN TRUNG NGUYEN, YASUHIRO TEZUKA, QUAN LE TRAN, TAKAHIRO NOBUKAWA, YOUICHI KURASHIGE, MASAKIYO SASAHARA AND SHIGETOSHI KADOTA, Secoisolariciresinol And Isotaxiresinol Inhibit Tumor Necrosis Factor-Α-Dependent Hepatic Apoptosis In Mice, Life.Sci, 2004, 22, 2781- 2792.
12. A.H. BANSKOTAA, N.T. NGUYEN, Y. TEZUKA, T. NOBUKAWAB, S. KADOTA, Hypoglycemic effects of the wood of Taxus yunnanensis on Streptozotocin-induced diabetic rats and its active components,
Int.J.Phytother.Phytopharm, 2006, 13, 109 -114.
13. BLASE BILLACK, VIJAYALAXMI RADKAR AND CHRISTELLE ADIABOUAH, In Vitro Evaluation Of The Cytotoxic And Antiproliferative Properties Of Resveratrol And Several Of Its Analogs,
Cell.Mol.Biol.Letters, 2008, 13, 553-569.
14. R. D. BLUMENTHAL, Methods in Molecular Medicine, Humana Press Inc , 2005, 39-48.
15. JENNIFER BURNS, TAKAO YOKOTA, HIROSHI ASHIHARA, MICHAEL E. J. LEAN, AND ALAN CROZIER, Plant Foods and Herbal Sources of Resveratrol, J. Agric. Food Chem, 2002,50,3337-3340.
16. AEDIN CASSIDY, BRYAN HANLEY AND ROSA M LAMUELA- RAVENTOS, Isoflavones, lignans and stilbenes – origins, metabolism and potential importance to human health, J. Sci .Food .Agric, 2000, 80, 1044- 1062.
17. SUNIL K. CHATTOPADHYAY, T. R. SANTHA KUMAR, PRAKAS R.
MAULIK, SACHIN SRIVASTAVA, ANKUR GARG, A
ASHOKESHARON, ARVIND S. NEGIA AND SUMAN PREET S. KHANUJAA, Absolute Configuration and Anticancer Activity of
Taxiresinol and Related Lignans of Taxus wallichiana, Bioor.Med.Chem,
2003, 11, 4945–4948.
18. KNOX VAN DYKE, CHRISTOPHER VAN DYKE, KAREN WOODFORK, Luminescence Biotechnology: Instruments and Applications, CRC Press, 1994, section 5, 379-459.
19. PATRIK C. EKLUND, OTTO K. L˚ANGVIK, JOHAN P. W¨ARN˚A. TAPIO O. SALMI. STEFAN M. WILLF¨OR AND RAINER E. SJ¨OHOLM, Chemical studies on antioxidant mechanisms and free radical scavenging properties of lignans, Org. Biomol. Chem, 2005, (3), 3336- 3347.
20. JIAN-GUO FANG, BO ZHOU, Structure-Activity Relationship and Mechanism of the Tocopherol-Regenerating Activity of Resveratrol and Its Analogues, J. Agric. Food Chem, 2008, 56, (23), 11458-11463.
21. RUSS HILLE, HOWARD SPRECHER, On the Mechanism of Action of Xanthine Oxidase, J. Biol. Chem, 1987, 262, 23, 10914-10917.
22. PETER HOUGHTON, RUI FANG, ISARIYA TECHATANAWAT, GLYN STEVENTON, PETER J. HYLANDS, C.C. LEE, The sulforhodamine (SRB) assay and other approaches to testing plant extracts and derived compounds for activities related to reputed anticancer activity,
Methods, 2007, 42, 377–387.
23. P. IONITA, Is DPPH Stable Free Radical a Good Scavenger for Oxygen Active Species, Chem.Pap, 2005, 59, 11-16.
24. YIN. J, TEZUKA. Y, SUBEHAN, SHI. L, NOBUKAWAB. M, NOBUKAWAC. T, KADOTAA. S, In vivo anti-osteoporotic activity of isotaxiresinol, a lignan from wood of Taxus yunnanensis,
25. SHIEGETOSHI KADOTA, TAKAHIRO NOBUKAWA, US Patent Application, US2008/ 0146659 A1, 2008.
26. ROBERT E. KING, JOSHUA A. BOMSER, AND DAVID B. MIN, Bioactivity of Resveratrol, Comp.Reviews in Food Sci. Food Saf, 2006, 5. 27. KUO-LUNG KU, PING-SHUN CHANG, YA-CHIN CHENG, AND
CHING-YI LIEN, Production of Stilbenoids from the Callus of Arachis hypogaea: a Novel Source of the Anticancer Compound Piceatannol, J. Agric. Food Chem, 2005, 53, 3877-3881.
28. YU-LING LEE, SHAO-YU JIAN, PEI-YING LIAN AND JENG-LEUN MAU, Antioxidant properties of extracts from a white mutant of the mushroom Hypsizigus marmoreus, J.Food Com.Anal, 2008, 21, 2, 116- 124.
29. XIAO TIAN LIANG, WEI SHUO FANG, Medicinal Chemistry of Bioactive Natural Products, John Willey & Son, 2006.
30. DEˆNIS PIRES DE LIMA, RODRIGO ROTTA, ADILSON BEATRIZ, MARIA RITA MARQUES, RAQUEL C. MONTENEGRO, MARNE C. VASCONCELLOS, CLA´UDIA PESSOA, MANOEL O. DE MORAES, LETI´CIA V. COSTA-LOTUFO, ALEXANDRA CHRISTINE HELENA FRANKLAND SAWAYA, MARCOS NOGUEIRA EBERLIN. Synthesis and biological evaluation of cytotoxic properties of stilbene-based resveratrol analogs, Eur.J.Med.Chem, 2008, 1-7.
31. ZHI XIU LIN, J.R.S. HOULT, AMALA RAMAN, Sulforhodamine B assay for measuring proliferation of a pigmented melanocyte cell line and its application to the evaluation of crude drugs used in the treatment of vitiligo, J. Ethnophar, 1999, 66, 141–150.
32. YINRONG LU, YEAP FOO.L, Antioxidant activities of polyphenols from
33. MARIA DE LUCIA, LUCIA PANZELLA, ORLANDO CRESCENZI, ALESSANDRA NAPOLITANO, VINCENZO BARONE AND MARCO D’ISCHIA, The catecholic antioxidant piceatannol is an effective nitrosation inhibitor via an unusual double bond nitration,
Bioor.Med.Chem.Letters 16, 2006, 2238–2242.
34. MARK S. MESKIN, WAYNE R. BIDLACK, R. KEITH RANDOLPH, Phytochemicals: Nutrient–Gene Interactions, CRC Press, 2006, 41-81.
35. MARCO MILANESIO, DAVIDE VITERBO, SUNIL
K.CHATTOPADHYAY, MANISH KULSHRESTHA AND GIOVANNI APPENDINO, Crystal and Molecular Structure of Secoisolariciresinol,
Croat. Chem. Acta, 1999, 72, (2–3), 351-363.
36. MAREK MURIASA, WALTER JA¨GERA, NORBERT HANDLERA,
THOMAS ERKERA, ZSUZSANNA HORVATHB, THOMAS
SZEKERESB, HANS NOHLC, LARS GILLEC, Antioxidant, prooxidant and cytotoxic activity of hydroxylated resveratrol analogues: structure activity relationship, Biochem. Pharm. 2005, 69, 903–912.
37. ZDENKA OVESNÁ, KATARÍNA KOZICS, YVONNE BADER, PHILIPP SAIKO, NORBERT HANDLER, THOMAS ERKER AND THOMAS SZEKERES, Antioxidant activity of resveratrol, piceatannol and 3,3',4,4',5,5'- hexahydroxy-trans-stilbene in three leukemia cell lines,
Oncol.Reports, 2006, 16, 617-624.
38. LESTER PACKER, Methods in enzymology, Academic Press, 1999, volume 310, 489-503.
39. LUCIA PANZELLA, MARIA DE LUCIA, CARMINE AMALFITANO, ALESSANDRO PEZZELLA,ANTONIO EVIDENTE, ALESSANDRA NAPOLITANO, AND MARCO D’ISCHIA, Acid-Promoted Reaction of the Stilbene Antioxidant Resveratrol with Nitrite Ions: Mild Phenolic Oxidation at the 4/-Hydroxystiryl Sector Triggering Nitration,
Dimerization, and Aldehyde-Forming Routes, J. Org.Chem, 2006, 71, 4246-4254.
40. K.T. PAPAZISIS, G.D. GEROMICHALOS, K.A. DIMITRIADIS, A.H. KORTSARIS, Optimization of the sulforhodamine B colorimetric assay,
J. Immunol. Methods, 1997, 208, 151–158.
41. ZHIBY PAUL, NANJOO SUH, XINGPEI HAO, BARBARA SIMI, HANG XIAO, AGNESM. RIMANDO, AND BANDARU S.
Pterostilbene, an Active Constituent of Blueberries, Suppresses Aberrant Crypt Foci Formation in the Azoxymethane-Induced Colon Carcinogenesis Model in Rats, Cancer Res., 2007, 13, (1), 350-355.
42. JAN POKORNY, Application of phenolic antioxidants in food products,
EJEAFChe, 2008, 7, 3320-3324.
43. V. PONT AND R. PEZET, Relation Between the Chemical Structure and the Biological Activity of Hydroxystilbenes Against Botrytis cinerea, J. phytopath, 1990, 130, 1-8.
44. RALF PÖRTNER, Ani.Cell Biotech: Methods and Protocols, Second Edition, 2007, 222-239.
45. SOARES.R, COSTA.C, Oxidative Stress, Inflammation and Angiogenesis in the Metabolic Syndrome, Springer Sci, 2009, 21-55.
46. VIJAYALAXMI RADKAR, DIANE HARDEJ, CESAR LAU-CAM, AND BLASE BILLACK, Evaluation of resveratrol and piceatannol Cytotoxicity in macrophages, T cells, and Skin cells, Arh Hig Rada Toksikol,2007, 58, 293-304.
47. AGNES M. RIMANDO, WILHELMINA KALT, JAMES B. MAGEE, JIM DEWEY, JAMES R. BALLINGTON, Resveratrol, Pterostilbene, and