Nghiên cứu độc tính tế bào

6. Thực nghiệm

6.3 Nghiên cứu độc tính tế bào

6.3.1 Phƣơng pháp nghiên cứu sự phát triển tế bào

Dòng tế bào DLD-1 sử dụng cho thực nghiệm đƣợc cho vào từng giếng của đĩa 24 giếng với mật độ khoảng 3.0 x 104 tế bào/giếng và đƣợc ủ qua đêm trong môi trƣờng CO2 5% tại 37oC để đảm bảo tế bào kết dính vào đáy giếng và sau đó tế bào đã sẵn sàng cho thí nghiệm.

Chuẩn bị các dung dịch các chất cần kiểm tra độc tính RES (0-60µM), PI (0-60µM), PTS (0-60µM), ITR (0-300µM), SSR (0-300µM) trong môi trƣờng nuôi cấy tế bào (Fetal serum), trƣớc khi xử lý tế bào với các dung dịch trên, môi trƣờng tế bào cũ cần đƣợc rửa sạch bằng cách sử dụng 1ml PBS, sau đó đem ủ cho khảo sát ở 24, 48 và 72 giờ trong môi trƣờng CO2 5% tại 37oC.

57 Sau khi đƣợc ủ tới thời gian cần khảo sát, tế bào đƣợc chụp ảnh sử dụng hệ thống kính hiển vi tƣơng phản pha Leica DMIRB (Leica Microsystem A/S) với độ phóng đại 200 lần. Sau đó, tế bào đƣợc rửa sạch bằng PBS (1ml/giếng), thêm trysine (0.2ml/giếng) để thực hiện quá trình trypsin hóa tách tế bào ra khỏi đáy giếng, tiếp tục thêm PBS (0.8ml/giếng), sau đó sử dụng pipet hút và xả ở lực mạnh cho tế bào tách khỏi nhau.

Dùng micropipet hút chính xác 800µl dung dịch tế bào đã chuẩn bị ở trên cho vào cốc đo có chứa 10ml NaCl 0.9%, sau đó thực hiện bƣớc đếm tế bào sử dụng máy đếm Coulter Z2, Beckman Coulter cho tế bào có kích thƣớc lớn hơn 11µm.

Quá trình phát triển của tế bào đƣợc thể hiện trên số tế bào và phần trăm tế bào đã đƣợc xử lý với chất cần khảo sát so với mẫu control (tế bào trong môi trƣờng nuôi cấy với DMSO).

6.3.2 Phƣơng pháp SRB

Sulforhodamine B (SRB) 0.2% đƣợc chuẩn bị bằng cách hòa tan 0.1g SRB vào 50ml axit acetic 1% và lắc đều, thuốc thử đƣợc chứa trong lọ sẫm màu và giữ lạnh cho đến khi sử dụng.

Trichloroacetic acid (TCA) 50% đƣợc chuẩn bị bằng cách thêm 50g tinh thể TCA vào 100mml nƣớc cất khử ion, đƣợc lƣu trong lọ thủy tinh và giữ lạnh cho đến khi sử dụng.

Chuẩn bị dung dịch đệm Tris[hydroxymethyl]aminomethane 10mM bằng cách hòa tan 0.605g Tris-base vào 500 ml nƣớc và đƣợc giữ lạnh đến khi sử dụng.

Quy trình phƣơng pháp SRB:

1. Cho 100 μL tế bào vào đĩa 96 giếng sao cho lƣợng tế bào khoảng 10.000 tế bào/giếng sau đó ủ qua đêm trong môi trƣờng CO2 5% tại 37oC.

58 2. Kiểm soát sự phát triển, sự phân bố của tế bào trong giếng và mật độ tế bào trong các giếng khác nhau sử dụng kính hiển vi tƣơng phản pha.

3. Thêm 100 μL/giếng môi trƣờng nuôi cấy không có chứa chất khảo sát vào các giếng blank và control.

4. Thêm 100 μL/giếng môi trƣờng nuôi cấy có chứa chất khảo sát ở các nồng độ khác nhau vào đĩa 96 giếng theo thiết kế thí nghiệm.

5. Ủ tế bào trong môi trƣờng CO2 5% tại 37oC đến các thời gian cần khảo sát sự phát triển tế bào phụ thuộc vào thời gian phơi nhiễm các chất (24, 48, 72 giờ). 6. Sau 24 giờ, dừng tiến hành quá trình nuôi cấy cho đĩa khảo sát quá trình phát triển tế bào ở 24 giờ để tiến hành đo mật độ quang của tế bào theo các bƣớc sau. 7. Cố định lƣợng protein trong tế bào sử dụng 100 μL TCA 10% (4°C)/giếng, sau đó giữ lạnh đĩa ở 4°C ít nhất 1 giờ bằng cách đặt đĩa trong tủ lạnh trƣớc khi phân tích bằng phƣơng pháp SRB.

8. Sử dụng nƣớc cất khử ion (200 μL/giếng) để loại và rửa sạch TCA khoảng 5 lần và để khô tự nhiên trong không khí.

9. Dùng pipet lấy 100 μL dung dịch SRB cho vào mỗi giếng và nhuộm màu trong vòng 30 phút.

10. Sử dụng miro-pipet điện tử 8 kênh để loại SRB ra khỏi giếng và dùng acit acetic 1% để rửa sạch SRB, sau đó để khô tự nhiên trong không khí.

11. Để khô đĩa tự nhiên trong không khí cho đến khi không còn thấy ẩm bên trong giếng.

12. Hòa tan protein đã nhuộm màu bằng 100 μL Tris base 10 mM trên mỗi giếng. Lắc đĩa nhẹ trong vòng 10 phút để hòa tan và đồng nhất hóa chất nhuộm trong giếng.

13. Tiến hành đo mật độ quang sử dụng máy đọc ELISA ở bƣớc sóng 492 nm và sử dụng bƣớc sóng 620 nm làm so sánh.

59 14. Mật độ quang của mỗi giếng tỷ lệ trực tiếp với số tế bào, do đó có thể vẽ đồ thị biễu diễn sự phụ thuộc giá trị mật độ quang theo nồng độ chất khảo sát và tính toán giá trị IC50.

60 Trong đề tài này chúng tôi đã nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa và độc tính tế bào của một số chất thộc họ lignan và stilbene, kết quả cho thấy:

Hai lignan, SSR và ITR, có hoạt tính chống oxi hóa tƣơng đối mạnh thông qua việc ức chế gốc tự do DPPH và NO, giá trị IC50 lần lƣợt là 9.2 và 7.1 M đối với gốc DPPH và 61.9 và 36.2 M đối với gốc NO, nhƣng lại không có tác dụng ức chế sự phát triển của dòng tế bào DLD-1. Điều này cho thấy hạn chế của việc ứng dụng hai hợp chất này vào các loại dƣợc phẩm điều trị các bệnh liên quan đến dòng tế bào DLD-1. Tuy nhiên, có thể phát triển hƣớng nghiên cứu tiếp theo cho các dòng tế bào khác để chứng minh khả năng chống oxy hóa rất mạnh của hai hợp chất này.

Ba hợp chất stilbene, RES, PTS và PI có hoạt tính chống oxi hóa trung bình nhƣng lại có tác dụng ức chế sự phát triển của dòng tế bào DLD-1 mạnh, giá trị IC50 lần lƣợt là 30.8, 32.8 và 64.3M theo phƣơng pháp đếm tế bào và 76.3, 44.6 và 117.9M theo phƣơng pháp SRB. Kết quả nghiên cứu đã chứng minh rằng, các hoạt tính sinh học nhƣ chống ung thƣ, tiểu đƣờng, tim mạch của các hợp chất thuộc họ stilbene này do hoạt tính chống oxy hóa của chúng. Bên cạnh đó, độc tính tế bào của các hợp chất này cho thấy khả năng ứng dụng của chúng.

Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của RES lên dạng hình học của tế bào cũng phù hợp với các nghiên cứu trƣớc đây trên dòng tế bào HeLa 4. Điều này khẳng định ảnh hƣởng mạnh của RES lên dòng tế bào DLD-1.

Trong số các hợp chất nghiên cứu cho thấy chỉ có PI thể hiện tất cả các hoạt tính nhƣ ức chế NO, ức chế DPPH và ức chế enzyme XO, độc tính tế bào đối với dòng tế bào DLD-1, vì vậy cần có những nghiên cứu sâu hơn nhƣ là khảo sát khả năng chống peroxy hóa lipid màng tế bào theo phƣơng pháp xác định hàm lƣợng MDA, nghiên cứu về chu kỳ tế bào theo phƣơng pháp flow cytometry, nghiên cứu chu trình chết (apotosis) trên các dòng tế bào khác nhau, từ đó đánh giá thêm các hoạt tính sinh học khác của PI để có thể sử dụng chất

63