6. Thực nghiệm
6.2 Nghiên cứu khả năng chống oxy hóa
6.2.1 Phƣơng pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH 6.2.1.1 Nguyên tắc 6.2.1.1 Nguyên tắc
DPPH là một gốc tự do bền, dung dịch có màu tím, bƣớc sóng cực đại hấp thu tại 517 nm. Các chất có khả năng kháng oxi hóa sẽ trung hòa gốc DPPH bằng cách cho hydrogen, làm giảm độ hấp thu tại bƣớc sóng cực đại và màu của dung dịch phản ứng sẽ nhạt dần, chuyển từ tím sang vàng nhạt.
6.2.1.2 Quy trình thử hoạt tính bắt gốc tự do DPPH
Quy trình thử hoạt tính DPPH đƣợc tóm tắt bằng sơ đồ 1 dƣới đây:
-1500l DPPH (100M) trong etanol -Ủ 30 phút trong bóng tối 1500l Dung dịch mẫu V1 µl mẫu V2 µl etanol Dung dịch sau ủ Đo quang (=517nm)
50 Sơ đồ 1. Quy trình thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH.
6.2.1.3 Chuẩn bị hóa chất
Dung dịch DPPH: cân 3.94mg DPPH định mức bằng ethanol 99.7% thành 1000µl đƣợc dung dịch trữ DPPH 10.000µM. Lấy 500µl dung dịch trữ định mức thành 50ml đƣợc dung dịch DPPH 100 µM (dung dịch làm việc).
Dung dịch làm việc của mẫu có nồng độ 500µM.
Mẫu thử và mẫu control đƣợc pha theo bảng 14 sau:
C (μM) Control 100 50 25 10
V1(mẫu) μl 0 600 300 150 60
V2(etanol) μl 1500 900 1200 1350 1440
V(DPPH) μl 1500
Bảng 14.Cách pha dung dịch thử hoạt tính DPPH có nồng độ từ 10 đến 100 μM
Tƣơng ứng với mỗi nồng độ mẫu thử ta làm một mẫu trắng (blank), mẫu trắng tƣơng tự nhƣ mẫu thử nhƣng thay VDPPH bằng Vethanol.
Đối với những mẫu có hoạt tính mạnh (IC50 < 10μM), phải tiến hành thử mẫu ở các nồng độ 10, 5, 2, 1 μM, khi đó sử dụng mẫu làm việc có nồng độ 100M và mẫu thử sẽ đƣợc pha theo bảng 15 sau:
51
C (μM) 10 5 2 1
V1(mẫu) μl 300 150 60 30
V2(etanol) μl 1200 1350 1440 1470
V(DPPH) μl 1500
Bảng 15. Cách pha dung dịch thử hoạt tính DPPH có nồng độ từ 1 đến 10 μM. Để có cơ sở đánh giá hoạt tính của những mẫu chất khảo sát, chúng tôi sử dụng quercetin làm chất đối chứng dƣơng, vì đây là chất có hoạt tính mạnh đối với gốc tự do đƣợc sử dụng làm chất chuẩn trong các tài liệu tham khảo.
Hình 14. Công thức cấu tạo của Quercetin
6.2.2 Phƣơng pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do NO 6.2.2.1 Nguyên tắc
Natri nitroprusside dƣới ánh sáng sẽ phân hủy sinh ra gốc tự do NO, gốc này sẽ phản ứng với O2 tạo thành sản phẩm bền vững là NO2 và NO3. Nếu trong mẫu có hoạt tính ức chế gố tự do NO thì hoạt chất sẽ phản ứng cạnh tranh với oxy, kết quả làm giảm nồng độ NO2 trong dung dịch. Dựa trên sự giảm hàm lƣợng nitrite tạo thành của mẫu có hoạt tính ức chế NO so với mẫu không có hoạt
O HO OH OH OH OH O
52 chất ức chế NO (mẫu control), ta tính đƣợc khả năng ức chế gốc tự do NO của hoạt chất.
Hàm lƣợng nitrite tạo thành trong dung dịch nƣớc đƣợc xác định bằng phƣơng pháp trắc quang, sử dụng thuốc thử Greiss để lên màu phản ứng. Phức màu diazo thu đƣợc hấp thu ở bƣớc sóng cực đại 540 nm.
6.2.2.2 Chuẩn bị hóa chất
Dung dịch natri nitroprusside 10mM: Cân chính xác khoảng 0.14898 g natri nitroprussid, sau đó hòa tan trong đệm phosphat pH=7.4 sử dụng bình định mức 50 mL. Dung dịch này đƣợc pha ngay trƣớc khi tiến hành phản ứng, đựng cẩn thận trong chai tối màu và giữ trong chỗ tối trƣớc khi tiến hành thí nghiệm.
Thuốc thử Greiss (Merck): Thuốc thử Greiss bao gồm hai dung dịch A và B:
o Dung dịch A: Sulfanilamid 2% trong acid H3PO4 4%: Cân khoảng 2g sulfanilamide hòa tan thành 100 mL dung dịch bằng dung dịch acid H3PO4 4%.
o Dung dịch B: N-1-napthylethylene diamine 0.2%: Cân khoảng 0.2g N-1-napthylethylene diamine hòa tan thành 100 mL bằng nƣớc cất
hai lần.
o Cả hai dung dịch A và B đều đƣợc đựng trong chai tối màu và bảo quản trong tủ lạnh. Dung dịch A đƣợc trộn chung với dung dịch B với cùng tỉ lệ thể tích trƣớc khi tiến hành thí nghiệm.
Dung dịch đệm phosphate pH = 7.4: Hòa tan bằng muối NaH2PO4.2H2O và muối Na2HPO4.12H2O trong 1000 mL nƣớc cất hai lần. Dùng NaOH và H3PO4 chỉnh đến pH = 7.4 bằng máy pH.
Mẫu thử: pha dung dịch mẫu làm việc có nồng độ 500M.