Kết quả nghiên cứu độc tính tế bào

5. Kết quả và thảo luận

5.2 Kết quả nghiên cứu độc tính tế bào

5.2.1 Isotaxiresinol

Kết quả thứ độc tính tế bào của ITR đƣợc khảo sát sử dụng phƣơng pháp đếm (đồ thị 4) và phƣơng pháp SRB (đồ thị 5). Kết quả phƣơng pháp đếm cho thấy không có sự thay đổi tế bào giữa giếng control và giếng có chứa ITR ở các nồng độ khác nhau. Điều này có nghĩa là ITR hầu nhƣ không ảnh hƣởng đến tế bào đến khoảng nồng độ 150 µM ở thời gian khảo sát là 24 và 48 giờ.

Trong khi đó, ở nồng độ 300 µM cho thấy ảnh hƣởng rất rõ nét và số tế bào đếm đƣợc sau 24 giờ tƣơng đƣơng số tế bào đã cho vào giếng ban đầu, hình bên dƣới có thể chứng tỏ rằng hầu hết tất cả tế bào đã bị chết sau 24 giờ phơi nhiễm ITR. Số tế bào đếm đƣợc trong trƣờng hợp này có thể là tế bào chết hoặc các mảnh vỡ của tế bào, IC50 ở 48 giờ bằng phƣơng pháp đếm là 204.7 µM (bảng 7).

32 Đồ thị 5. Sự phụ thuộc nồng độ ITR trên sự phát triển tế bào theo SRB.

Kết quả hiển thị trong phân tích SRB (hình 5) cho thấy ảnh hƣởng của ITR trên dòng tế bào DLD-1 là không đáng kể cho đến nồng độ khoảng 150 µM, và ảnh hƣởng rất mạnh ở nồng độ 300 µM, điều này phù hợp với kết quả trong phƣơng pháp đếm. IC50 tính toán từ phƣơng pháp SRB là 225.4 µM (đồ thị 5).

Hình ảnh tế bào chụp đƣợc thông qua hệ thống kính hiển vi tƣơng phản pha cho thấy hình dạng tế bào cũng không có sự thay đổi giữa giếng control và giếng có chứa chất khảo sát ở các nồng độ đến 150 µM, tuy nhiên hình dạng tế bào bị thay đổi thành các dạng cầu ở nồng độ ITR 300 µM. Kết quả đƣợc tóm tắt ở bảng 7, bảng 8 và đồ thị 6 có thể chứng tỏ rằng tất cả các tế bào đã bị chết ở nồng độ ITR 300 µM. Tuy nhiên, đƣờng kính của tế bào lại hầu nhƣ không có sự thay đổi nào ở tất cả các nồng độ.

33

0 giờ 24 giờ 48 giờ

ITR 300µM

Bảng 7. Kết quả ảnh hƣởng của ITR 300µM lên hình dạng tế bào.

DMSO ITR 150µM

48 giờ

Diện tích (µm)2 462 ± 71 465 ± 59

34 Đồ thị 6. Biễu diễn ảnh hƣởng của ITR lên đƣờng kính tế bào.

5.2.2 Secoisolariciresinol

Kết quả phƣơng pháp đếm tế bào cho thấy SSR không có ảnh hƣởng đến dòng tế bào DLD-1 cho tới nồng độ 160 µM (đồ thị 7), tƣơng tự với phƣơng pháp SRB (đồ thị 8), cũng không quan sát thấy ảnh hƣởng của SSR lên dòng tế bào này. Và qua hình ảnh đã chụp đƣợc bằng kính hiển vi cũng cho thấy không có sự ảnh hƣởng của SSR lên dạng hình học của tế bào, diện tích và đƣờng kính tế bào không bị thay đổi đƣợc thể hiện ở đồ thị 7, 8, 9 và bảng 9.

35 Đồ thị 8. Sự phụ thuộc nồng độ SSR trên số tế bào theo SRB.

DMSO SSR 160 µM

48 giờ

Diện tích (µm)2 473 ± 66 586 ± 75

36 Đồ thị 9. Ảnh hƣởng của SSR lên đƣờng kính của dòng tế bào.

37

5.2.3 Resveratrol, Pterostilbene và Piceatannol

Ảnh hƣởng của các stilbene lên độc tính tế bào cũng đƣợc khảo sát bằng hai phƣơng pháp đếm (đồ thị 10) và SRB (đồ thị 11), kết quả cho thấy ảnh hƣởng mạnh của các chất RES và PTS lên dòng tế bào DLD-1, ngƣợc lại PI cho ảnh hƣởng rõ nét khi nồng độ lên tới 60 µM.

Kết quả phân tích bằng phƣơng pháp đếm cho thấy ảnh hƣởng đáng kể của RES 120 µM, PTS 60 µM, và PI 120 µM ở thời gian khảo sát là 24 giờ. Kéo dài thời gian ủ tới 48 giờ, RES 30 µM, PTS 15 µM, PI 60 µM thể hiện ảnh hƣởng đáng kể tới dòng tế bào DLD-1 (kết quả thể hiện ở hình 11).

Thứ tự kết quả trên cũng phù hợp với phƣơng pháp SRB, giá trị IC50 ở 48 giờ của RES, PTS, và PI đƣợc xác định bằng phƣơng pháp đếm lần lƣợt là 30.8 µM, 29.0 µM, và 64.3µM. Và kết quả này hơi khác so với phƣơng pháp SRB có IC50 lần lƣợt là 76.3 µM, 44.6 µM, và 117.9 µM.

38 Đồ thị 10. Sự phụ thuộc thời gian vào số tế bào phát triển dƣới sự phơi nhiễm các

39 Đồ thị 11. Sự phụ thuộc nồng độ của các chất phơi nhiễm RES, PTS và PI vào số

40 Khảo sát ảnh hƣởng của các chất lên dạng hình học của tế bào, kết quả bảng 10 và đồ thị 12 cho thấy ảnh hƣởng rõ nét của RES lên đƣờng kính tế bào. Hình dạng tế bào bị dãn rộng ra, nên diện tích tế bào cũng tăng lên.

48 giờ DMSO RES 30 µM

Diện tích (µm)2 468 ± 46 1070 ± 93

Bảng 10. Ảnh hƣởng của RES lên dạng hình học của tế bào.

41 Trong khi đó, PTS cho thấy sự ảnh hƣởng lên hình dạng tế bào, làm tăng kích thƣớc tế bào, tuy nhiên đƣờng kính không có sự thay đổi đáng kể đƣợc thể hiện qua bảng kết quả 11 và đồ thị 13 bên dƣới.

48 giờ DMSO PTS 30 µM

Diện tích (µm)2 433 ± 32 718 ± 28

Bảng 11. Ảnh hƣởng của PTS lên dạng hình học của tế bào.

Đồ thị 13. Ảnh hƣởng của PTS lên đƣờng kính của tế bào.

Ngƣợc lại, PI cho thấy có ít ảnh hƣởng lên hình dạng và kích thƣớc tế bào ở bảng 12 và đồ thị 14.

42

48 hr DMSO PI 60 µM

Area(µm)2 513 ± 33 604 ± 74

Bảng 12. Ảnh hƣởng của PI lên dạng hình học của tế bào.

Đồ thị 14. Ảnh hƣởng của PI lên đƣờng kính của tế bào.

5.2.4 Tóm tắt kết quả nghiên cứu độc tính tế bào

Kết quả nghiên cứu độc tính tế bào trên 2 phƣơng pháp CC và SRB đƣợc tóm tắt ở bảng 13 sau:

43 Chất Cấu trúc hóa học CC IC50 (µM) SRB IC50 (µM) Isotaxiresinol CTPT: C19H2206 KLPT: 346.37 OMe HO HO OH OH OH R S R 204.7 225.4 Secoisolariciresinol CTPT: C20H2606 KLPT: 362.42 OMe OMe OH HO OH HO R R KPH KPH Resveratrol CTPT: C14H1203 KLPT: 228.24 OH HO OH E 30.8 76.3±2.6 Pterostilbene CTPT: C16H1603 KLPT: 256.30 OMe MeO OH E 32.8±4.3 44.6±1.9

44 Piceatannol CTPT: C19H2206 KLPT: 346.37 OH OH OH HO E 64.3 117.9±7.9

Bảng 13. Tóm tắt kết quả nghiên cứu độc tính tế bào theo phƣơng pháp CC và SRB.

Nhận xét:

 Độc tính tế bào của các chất ITR, SSR, RES, PTS, PI đƣợc liệt kê ở bảng tóm tắt kết quả nghiên cứu độc tính tế bào. Trong hai hợp chất lignan nghiên cứu, chỉ có ITR ảnh hƣởng lên sự phát triển của tế bào nhƣng ở nồng độ khá lớn. Do đó, ảnh hƣởng này đƣợc xem xét là không đáng kể. Bên cạnh đó, SSR cũng không cho thấy sự ảnh hƣởng lên quá trình phát triển của tế nào.

 Cả ba stilbene khảo sát trong nghiên cứu này đều có cấu trúc mang nhóm hydroxyl ở vị trí 4’ trên vòng B, do đó có thể khẳng định nhóm có vai trò quan trọng đối với hoạt tính sinh học của các chất này. Bên cạnh đó, hoạt tính của PTS mạnh hơn RES là do sự methyl hóa các nhóm hydroxyl ở các vị trí 3,5 trên vòng A. Các nhóm này có thể đóng góp chủ yếu cho hoạt tính tiền chu trình chết của tế bào. Hai nhóm thế dimethoxy này làm giảm khả năng phân cực của PTS so với RES. Điều này có thể đƣợc chứng minh qua giá trị hệ số phân bố octanol-nƣớc (Log P) cho PS (LogP = 4.23) cao hơn RES (LogP = 4.01). Do đó, độ không phân cực của PTS càng lớn thì có thể dễ dàng thẩm thấu qua màng tế bào hơn so với RES, điều này liên quan tới khả năng gây độc đối với tế bào. Kết quả này cũng phù hợp với các nghiên cứu trƣớc đây, và chứng tỏ rằng cấu trúc dimethoxy làm tăng đáng kể khả năng gây độc cho tế bào trong cấu trúc stilbene.

45

6. Thực nghiệm

6.1 Hóa chất và dụng cụ 6.1.1 Hóa chất 6.1.1 Hóa chất

- Isotaxirecinol (ITR) Cô lập từ gỗ thông đỏ T.wallichiana

- Secoisolaricirecinol (SSR) Cô lập từ gỗ thông đỏ T.wallichiana

- Resveratrol (RES) Sigma Aldrich

- Pterostilbene (PTS) Sigma Aldrich

- Piceatannol (PIC) Sigma Aldrich

- Natri nitroprussid Trung Quốc

- N-1-napthylethylendiamindihydrochlorid Merck

- Sulfanilamid Trung Quốc

- HNO3 Trung Quốc

- H3PO4 Trung Quốc

- NaOH Trung Quốc

- Na2HPO4.12H2O Trung Quốc

- NaH2PO4.2H2O Trung Quốc

- DPPH Merck

- Ethanol (99,7%) Trung Quốc

- HCl Trung Quốc

- Bovine milk xanthine oxidase Sigma Aldrich

- Xanthine Kanto chemical

- Allopurinol Sigma Aldrich

- Quercetin Sigma Aldrich

- Trypsin Lonza

- Versene Gibco

- Acetic acid Merck

- McCoy’s 5A Gibco

- Gentamicin Gibco

46

- Dimethylsulfoxide (DMSO) Sigma Aldrich

- Dòng tế bào DLD-1 American Type

6.1.2 Dụng cụ thí nghiệm - Ống nghiệm 10 mL có nắp đậy. - Típ nhựa 2ml. - Pipet 10 mL, 5 mL, 2 mL, 1 mL. - Micropipet. - Becher 1000 mL,100 mL, 50 mL. - Bình định mức 100 mL, 50 mL. - Đũa thủy tinh.

- Máy chỉnh pH.

- Máy quang phổ UV-VIS Shimadzu 1800 với phần mềm điều khiển UV-Winlab.

- Cân phân tích.

- Cuvet thủy tinh và cuvet thạch anh. - Multichanel pipet.

- Máy quang phổ UV-VIS cho đọc đĩa 96 giếng Synergy Biotek với phần mềm điều khiển KC4.

- Máy lắc đĩa. - Tủ ủ CO2.

- Kính hiển vi hình ảnh với giá đỡ cho chụp hình đĩa 24 hoặc 96 giếng Leica DM IRB kết hợp với phần mềm i-View 32.

- Đĩa 96 giếng đáy phẳng Nunc. - Đĩa 24 giếng đáy phẳng Nunc.

- Máy đếm tế bào RAMCOM A/S Z2 Beckman Coulter Counter với phần mềm điều khiển Multi32.

- Phần mềm xử lý hình ảnh ImageJ và Linear 10 micrometer 20X cho tính toán diện tích chạy trên nền Java.

- Chƣơng trình FilterBJ ứng dụng cho xử lý lại dữ liệu từ phần mềm Multi32 để xác định đƣờng kính và số tế bào.

47 - Chƣơng trình Coulter Accucomp Import Master chạy trên nền

Microsoft Excel hỗ trợ cho việc xuất dữ liệu từ chƣơng trình FilterBJ.

6.1.3 Chuẩn bị mẫu

Mẫu khảo sát gồm 2 hợp chất của họ lignan (isotaxiresinol và secoisolariciresinol), đƣợc cô lập từ gỗ cây thông đỏ T.wallichiana với độ tinh khiết ít nhất 99.9% (kiểm tra bằng HPLC, GC và NMR) và 3 hợp chất thuộc họ stilbene (resveratrol > 99%, pterostilbene > 97%, piceatannol > 99%) mua từ hãng SigmaAldrich.

Mẫu khảo sát đƣợc cân và tùy quy trình thử hoạt tính mà đƣợc hòa tan vào hệ dung môi thích hợp. Với quy trình thử hoạt tính bằng DPPH mẫu đƣợc hòa tan hoàn toàn trong etanol 99.7%. Còn với hai quy trình thử hoạt tính bằng NO và XO mẫu sẽ đƣợc hòa tan trong hỗn hợp dung dịch đệm phosphate – ethanol (nồng độ ethanol phải ≤ 2% , đây là tỉ lệ đƣợc khảo sát bảo đảm hòa tan hoàn toàn mẫu mà không ảnh hƣởng đến kết quả phân tích).

Với quy trình thử độc tính tế bào, chuẩn bị dung dịch gốc ITR, SSR, RES, PTS, PIC 60µM trong DMSO 100% và đƣợc giữ ở -20oC cho đến khi sử dụng, sau đó pha loãng thành các nồng độ cần thiết cho nghiên cứu.

Fetal serum cho quá trình nuôi cấy và khảo sát độc tính tế bào đƣợc chuẩn bị từ McCoy’s 5A, FBS và gentamicin sau đó đƣợc giữ lạnh đến -20oC cho đến khi sử dụng.

Dung dịch cho quá trình trypsin hóa đƣợc chuẩn bị từ trypsin và versene sau đó đƣợc giữ lạnh đến -20oC cho đến khi sử dụng.

Khả năng chống oxi hóa và độc tính tế bào của các hợp chất đƣợc tính dựa trên phần trăm ức chế (I%). Phần trăm ức chế (I%) đƣợc xác định theo công thức:

I(%) = Ac - AsAc *100% Với :

Ac: Giá trị mật độ quang hoặc số tế bào của dung dịch không có mẫu thử (control).

48

As: Giá trị mật độ quang hoặc số tế bào của dung dịch có chứa mẫu thử (sample).

Cách pha mẫu thử, mẫu control và blank sẽ đƣợc trình bày cụ thể ở từng quy trình.

Đối với quy trình thử hoạt tính chống oxy hóa, mỗi mẫu ban đầu đƣợc thử ở 4 nồng độ khác nhau: 100, 50, 25, 10 µM. Mỗi nồng độ đƣợc tiến hành 3 lần, ứng với mỗi nồng độ ta tính đƣợc 3 giá trị % ức chế (I%). Lấy trung bình 3 giá trị I% từ đó ta sẽ xác định đƣợc giá trị phần trăm ức chế ứng với từng nồng độ khảo sát, nếu hoạt tính của mẫu thử khá mạnh sẽ đƣợc thử tiếp ở các nồng độ 10, 5, 2, 1 µM để tìm ra giá trị IC50.

Đối với quy trình thử độc tính tế bào, mẫu ban đầu đƣợc thử các nồng độ 120, 60, 30, 15 µM và sau đó tính toán giá trị IC50 sau 48 giờ, nếu giá trị IC50

không thu đƣợc từ khoảng nồng độ trên thì tiếp tục thay đổi nồng độ đến mức tối đa 300 µM cho nghiên cứu.

6.1.4 IC50 và cách xác định 6.1.4.1 Định nghĩa

IC50 là một giá trị dùng để đánh giá khả năng ức chế mạnh hoặc yếu của mẫu khảo sát. IC50 đƣợc định nghĩa là nồng độ của mẫu mà tại đó nó có thể ức chế 50 % gốc tự do, hoặc tế bào, hoặc enzyme, mẫu có hoạt tính càng cao thì giá trị IC50 sẽ càng thấp.

6.1.4.2 Cách xác định IC50

- Tiến hành khảo sát hoạt tính của mẫu ở nhiều nồng độ khác nhau.

- Với những mẫu có hoạt tính biến thiên tuyến tính với nồng độ, chúng ta vẽ một đƣờng thẳng y = ax+b qua tất cả các điểm (với y là % ức chế và x là nồng độ).

- Với những mẫu có hoạt tính không biến thiên tuyến tính với nồng độ, một cách gần đúng, chúng ta chọn 2 nồng độ ức chế trên và dƣới 50% và cũng tiến hành vẽ đƣờng thẳng y = ax + b. Ta sẽ thu đƣợc phƣơng trình y = ax + b với 2 hệ số a, b đã biết.

49 - Thay y = 50 % vào phƣơng trình ta sẽ thu đƣợc giá trị x, đó chính là nồng

độ ức chế đƣợc 50 % gốc tự do (IC50).

6.2 Nghiên cứu khả năng chống oxy hóa

6.2.1 Phƣơng pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH 6.2.1.1 Nguyên tắc 6.2.1.1 Nguyên tắc

DPPH là một gốc tự do bền, dung dịch có màu tím, bƣớc sóng cực đại hấp thu tại 517 nm. Các chất có khả năng kháng oxi hóa sẽ trung hòa gốc DPPH bằng cách cho hydrogen, làm giảm độ hấp thu tại bƣớc sóng cực đại và màu của dung dịch phản ứng sẽ nhạt dần, chuyển từ tím sang vàng nhạt.

6.2.1.2 Quy trình thử hoạt tính bắt gốc tự do DPPH

Quy trình thử hoạt tính DPPH đƣợc tóm tắt bằng sơ đồ 1 dƣới đây:

-1500l DPPH (100M) trong etanol -Ủ 30 phút trong bóng tối 1500l Dung dịch mẫu V1 µl mẫu V2 µl etanol Dung dịch sau ủ Đo quang (=517nm)

50 Sơ đồ 1. Quy trình thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH.

6.2.1.3 Chuẩn bị hóa chất

 Dung dịch DPPH: cân 3.94mg DPPH định mức bằng ethanol 99.7% thành 1000µl đƣợc dung dịch trữ DPPH 10.000µM. Lấy 500µl dung dịch trữ định mức thành 50ml đƣợc dung dịch DPPH 100 µM (dung dịch làm việc).

 Dung dịch làm việc của mẫu có nồng độ 500µM.

Mẫu thử và mẫu control đƣợc pha theo bảng 14 sau:

C (μM) Control 100 50 25 10

V1(mẫu) μl 0 600 300 150 60

V2(etanol) μl 1500 900 1200 1350 1440

V(DPPH) μl 1500

Bảng 14.Cách pha dung dịch thử hoạt tính DPPH có nồng độ từ 10 đến 100 μM

Tƣơng ứng với mỗi nồng độ mẫu thử ta làm một mẫu trắng (blank), mẫu trắng tƣơng tự nhƣ mẫu thử nhƣng thay VDPPH bằng Vethanol.

Đối với những mẫu có hoạt tính mạnh (IC50 < 10μM), phải tiến hành thử mẫu ở các nồng độ 10, 5, 2, 1 μM, khi đó sử dụng mẫu làm việc có nồng độ 100M và mẫu thử sẽ đƣợc pha theo bảng 15 sau: