Mục tiêu của đề tài - Phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất có hoạt tính sinh học và hợp chất mới có trong lá đu đủ.. - Đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập là
Trang 1ĐẶT VẤN ĐỀ
1 Tính cấp thiết của đề tài
Cây đu đủ (Carica papaya Linn) là một loại cây ăn quả được trồng ở các nước vùng
nhiệt đới Ở Việt Nam, cây đu đủ được trồng hầu hết ở các tỉnh miền Bắc và miền Nam Lá đu đủ được chứng minh là có khả năng chống oxy hóa rất mạnh, có hoạt tính kháng khuẩn tốt Ngoài ra, lá đu đủ còn có khả năng kháng viêm, giảm đau Đã có thông báo dịch chiết nước lá cây đu đủ có tác dụng ức chế một số dòng tế bào ung thư người như ung thư dạ dày, ung thư phổi, ung thư máu Ngoài ra, nước lá cây đu đủ còn
có tác dụng điều hòa miễn dịch Tuy nhiên, những công bố đều chỉ sơ lược ở dạng dịch chiết và chưa xác định được thành phần nào là hoạt chất Vì vậy, việc chứng minh được thành phần hoạt chất cụ thể của lá đu đủ là một việc làm hết sức cần thiết, tạo cơ
sở khoa học cho việc ứng dụng nguồn nguyên liệu sẵn có ở Việt Nam làm thuốc điều
trị bệnh ung thư Do đó, tôi đã lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu hoạt tính sinh học của
một số hợp chất chiết tách từ lá đu đủ (Carica papaya Linn”
2 Mục tiêu của đề tài
- Phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất có hoạt tính sinh học và hợp chất mới
có trong lá đu đủ
- Đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập làm cơ sở khoa học chứng minh cho việc người dân ở một số nước trên thế giới sử dụng lá đu đủ chữa trị một số loại bệnh trong đó có bệnh ung thư
3 Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu phân lập một số hợp chất có trong lá đu đủ
- Xác định cấu trúc của một số hợp chất phân lập được
- Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các phân đoạn cặn chiết từ lá đu đủ
- Đánh giá khả năng gây độc tế bào của các hợp chất phân lập được
- Đánh giá khả năng kích hoạt enzyme caspase 3/7 của hợp chất carpaine và pseudocarpaine trên dòng tế bào ung thư phổi LU-1
- Đánh giá khả năng chống oxy hóa của các hợp chất phân lập từ lá đu đủ bằng các phương pháp: loại bỏ gốc tự do 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), thử nghiệm
malonyl dialdehyd (MDA), chống oxy hóa in vitro trên tế bào gan chuột phân lập
- Đánh giá khả năng kháng vi khuẩn và nấm của các hợp chất phân lập từ lá đu đủ
Trang 2- Đánh giá khả năng kích thích miễn dịch của các hợp chất phân lập từ lá đu đủ
4 Tính mới của đề tài
Phân lập và xác định cấu trúc của một hợp chất mới từ lá đu đủ (Carica papaya Linn)
được đặt tên là carpainone
Đã xác định hoạt tính gây độc lên một số dòng tế bào ung thư của các hợp chất phân lập từ lá đu đủ, trong đó hợp chất carpaine và pseudocarpaine thể hiện hoạt tính gây độc tế bào ung thư rõ rệt
Lần đầu tiên xác định được khả năng kích hoạt enzyme caspase 3/7 của hợp chất carpaine và pseudocarpaine trên tế bào ung thư phổi LU-1
Đánh giá được khả năng chống oxy hóa, kháng vi khuẩn, kháng nấm và khả năng kích thích miễn dịch của một số hợp chất phân lập từ lá đu đủ
5 Bố cục của luận án
Luận án gồm 113 trang: Đặt vấn đề (3 trang), chương 1: tổng quan (29 trang) Chương 2: vật liệu và phương pháp nghiên cứu (12 trang) Chương 3: kết quả và thảo luận (56 trang với 6 bảng và 54 hình) Kết luận và kiến nghị (2 trang) Danh mục các công trình công bố (1 trang) Tài liệu tham khảo (10 trang gồm 20 tài liệu tiếng Việt, 86 tài liệu tiếng Anh)
Trang 3CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về cây đu đủ
Họ đu đủ (Caricaceae) trên thế giới gồm có 4 chi và 45 loài, phân bố ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Ở nước ta có 1 chi và một loài Một số giống đu đủ hiện nay đang được trồng ở Việt Nam bao gồm: giống đu đủ ta, đu đủ Mêhico, đu đủ So Lo, đu đủ Trung Quốc, đu đủ Thái Lan, đu đủ Đài Loan Tại Hà Nội, chỉ có duy nhất giống đu
đủ Đài Loan được trồng ở các huyện: Gia Lâm, Đông Anh, Sóc Sơn, Thạch Thất,…
1.2 Nghiên cứu về thành phần hóa học của lá đu đủ
Trong lá đu đủ có các chất: tannin, alkaloid, saponin, glycosis, phytosterol, phenol, flavonoid, steroid, terpenoid,… Alkaloid có khung piperidin, chủ yếu là carpaine, pseudocarpaine, dehydrocarpaine I, dehydrocarpaine II, choline, … Ngoài ra còn có vitamin C, E, nguyên tố khoáng Ca, K, Mg, Zn, Mn, Fe,
H 2 C
C H 2 C C
H H ( C H 2 ) 7
O
C = O
N C
Carpaine Pseudocarpaine
1.3 Nghiên cứu về hoạt tính sinh học của lá đu đủ
Một số nhóm chất trong lá đu đủ có hoạt tính chống ung thư Ví dụ: nhóm glucosise bao gồm các chất benzyl glucosinolate, benzyl isothiocyanate có hoạt tính chống nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau Nhóm các chất phenol bao gồm các chất: 5,7-dimethoxy coumarin, axi protocatechui, axit ρ-coumaric, axit caffeic, kaempferol, quercetin Nhóm các chất này đã được chứng minh là có hoạt tính: ưc chế sự tăng sinh
tế bào, tăng cường chức năng miễn dịch, ức chế enzyme ở pha I và II trong chu kỳ phân bào, ức chế sự kết dính tế bào và xâm lấn, cảm ứng quá trình tự chết Nhóm các chất carotenoid các chất: β-carotene, lycopene, β-cryptoxanthin Nhóm các chất này có tác dụng phòng ung thư phổi, ung thư tiền liệt tuyến, ung thư vú, ung thư dạ dày, ung thư gan,…
Trong lá đu đủ có chứa protein bất hoạt ribosome (RIPs) RIPs có khả năng gây độc tế bào ung thư vú T47D với IC50 = 2,8 μg/ml Chất chiết bằng nước từ các phần khác nhau của đu đủ có tác dụng ngăn ngừa, tiêu diệt hoặc ức chế nhiều loại tế bào ung thư
Trang 4như: dạ dày, phổi, tuyến tụy, gan, máu, lymphoma, bệnh bạch cầu, Dịch chiết lá đu đủ bằng nước (nồng độ 0,625-20 µg/ml) có tác dụng ức chế nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau Tác giả đã chứng minh dịch chiết từ lá đu đủ còn có tác dụng hỗ trợ hệ miễn dịch để tấn công vào các tế bào ung thư Bằng cách thúc đẩy sự gia tăng các sản phẩm cytokine dạng Th1 như là IL-12p40, IL-12p70, INF-γ và TNF-α, các cytokine này có khả năng chống lại khối u Sau đó tác giả sử dụng màng lọc để tách thành 2 phần có trọng lượng phân tử khác nhau Các chất có hoạt tính ức chế tế bào ung thư và điều hòa miễn dịch được xác định là nằm ở phần có trọng lượng phân tử nhỏ hơn
1000
Chất chiết lá đu đủ có hoạt tính chống oxy hóa Các giống đu đủ khác nhau có tổng hàm lượng phenol khác nhau và hoạt tính chống oxy hóa cũng khác nhau Điều đó chứng tỏ rằng các chất phenol gây ra hoạt tính chống oxy hoá Các bộ phận khác nhau của cây đu đủ có hoạt tính chống oxy hóa giảm dần theo thứ tự: lá non → quả xanh → quả chín → hạt Tuy nhiên, các hoạt chất có tác dụng chống oxy hóa còn chưa được phân lập
Dịch chiết lá đu đủ có khả năng ức chế nhiều loại vi khuẩn và nấm Cao lá đu đủ có tác
dụng kháng khuẩn đối với Typhimurium mentagrophytes, T rubrum và
Staphylococcus aureus Ngoài ra, dịch chiết lá đu đủ còn có khả năng kháng viêm,
kháng virut sốt xuất huyết,…
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Mẫu thực vật
Đu đủ Đài Loan (Carica papaya L.) được trồng tại Nam Hồng – Đông Anh – Hà Nội
Thu hái lá trên cây đu đủ cái, dạng lá bánh tẻ, không bị sâu bệnh, không bị dập nát Lá thu hái vào tháng 10 năm 2012 Lá cây đu đủ Đài Loan thu hái về được sấy ở nhiệt độ
40 – 500C cho đến khô rồi nghiền thành bột
Trang 5
2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Các phương pháp phân lập và xác định cấu trúc hợp chất: dùng phương pháp
chiết ngâm, chiết bằng sóng siêu âm để thu cặn chiết từ lá đu đủ Sử dụng sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng để phân lập các chất tinh khiết Sử dụng phổ hồng ngoại, phổ khối lượng, phổ cộng hưởng từ hạt nhân để xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được
2.2.2 Các phương pháp thử hoạt tính sinh học
2.2.2.1 Phương pháp thử độ độc tế bào (cytotoxic assay): Phép thử tiến hành xác định
hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD – Optical Density)
đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB) Giá trị OD máy đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do
đó lượng tế bào càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn Phép thử được thực hiện trong điều kiện cụ thể như sau:
- Chất thử (10 l) pha trong DMSO 10% được đưa vào các giếng của khay 96 giếng để có nồng độ 100 g/ml; 20g/ml; 4 g/ml; 0,8 g/ml
- Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào, thêm lượng tế bào phù hợp và
để chúng phát triển trong vòng từ 3-5 ngày
- Một khay 96 giếng khác không có chất thử nhưng có tế bào ung thư sẽ được sử dụng làm đối chứng ngày 0
- Sau giai đoạn phát triển trong tủ ấm CO2, tế bào được cố định vào đáy giếng bằng axit trichloracetic trong 30 phút, được nhuộm bằng SRB trong 1 giờ ở 37 0C
- Cuối cùng, sử dụng 10 mM unbuffered Tris base để hòa tan lượng SRB đã bám
và nhuộm các phân tử protein, đưa lên máy lắc đĩa lắc nhẹ trong 10 phút và sử dụng máy ELISA Plate Reader để đọc kết quả về hàm lượng màu của chất nhuộm SRB qua phổ hấp phụ ở bước sóng 515 nm
- Ellipticine luôn được sử dụng như là chất đối chứng dương
- DMSO10% luôn được sử dụng như đối chứng âm Chất thử nào có IC50 < 20
g/ml (với chất chiết thô, hoặc với phân đoạn hóa học) hoặc IC50 4 g/ml (với hoạt chất tinh khiết) sẽ được xem là có hoạt tính gây độc tế bào và có khả năng ức chế sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư
Trang 62.2.2.2 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme caspase 3 / 7: Được thực hiện dựa
trên bộ kit Apo-ONE® Homogeneous Caspase-3/7 Assay (Promega) theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất
2.2.2.3 Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa bằng loại bỏ gốc tự do DPPH
Nguyên tắc: 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) là gốc tự do được dùng để sàng lọc tác dụng chống oxy hóa của các chất nghiên cứu Hoạt tính chống oxy hóa thể hiện qua việc làm giảm màu DPPH của chất thử, được xác định bằng phép đo độ hấp thụ ở bước sóng 517 nm trên máy quang phổ
2.2.2.4 Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hoá in vitro bằng thử nghiệm malonyl dialdehyd (MDA test)
Xác định khả năng ức chế peroxy hoá lipid thông qua việc xác định hàm lượng MDA theo phương pháp của Stroev E A, Makarova V G (1989), Viện Dược liệu - Bộ Y Tế (2006) Khi cho phản ứng với axit thiobarbituric, một phân tử MDA phản ứng với hai phân tử axit thiobarbituric tạo phức màu hồng hấp thu cực đại ở bước sóng 532 nm Phản ứng thực hiện ở môi trường pH 2 - 3, ở nhiệt độ 90 - 100 0C trong vòng 10 - 15 phút Đo cường độ màu của phức suy ra lượng MDA có trong mẫu
2.2.2.5 Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hoá in vitro trên tế bào gan chuột
Chuột BALB/c khoẻ mạnh được sử dụng để tách tế bào tế bào gan Tế bào gan sau phân lập được nuôi ổn định 1-2 ngày Thêm hoạt chất nghiên cứu hoặc cucurmin (đối chứng dương) Thêm 100 µM H2O2 vào mỗi giếng, ủ trong 2 giờ Cho 50 µl/giếng MTT nồng độ 1mg/ml, ủ trong 4 giờ Loại bỏ dịch nổi, thêm vào mỗi giếng 100 µl DMSO 100% Đo mật độ quang học (OD) ở bước sóng 492 nm
2.2.2.6 Phương pháp thử hoạt tính kháng vi khuẩn và nấm
Hoạt tính kháng vi khuẩn và nấm được thực hiện dựa trên phương pháp pha loãng đa
nồng độ (Multimicrodilution assay)
2.2.2.7 Phương pháp thử hoạt tính kích thích miễn dịch
Động vật thí nghiệm: Thỏ 3 tháng tuổi khỏe mạnh, được nuôi tại chuồng nuôi của viện Công nghệ sinh học
Hoạt tính kích thích miễn dịch của các mẫu được xác định theo phương pháp MTT (Mosmann (1983))
Tế bào lympho được đưa vào các giếng của đĩa 96 giếng với nồng độ 2x106 tế bào/ml Bổ sung chất thử pha trong DMSO 10% Concavalin A được sử dụng làm đối
Trang 7chứng Mẫu được ủ trong thời gian 48h ở 37 oC, 5% CO2 Sau giai đoạn phát triển trong tủ ấm CO2, thêm vào mỗi giếng 50µl MTT 1mg/ml Sau khi ủ đĩa tế bào ở 37o C trong 4h, loại bỏ môi trường và thêm vào mỗi giếng 100 µl DMSO Đĩa tế bào được đưa lên máy lắc đĩa lắc nhẹ trong 10 phút và sử dụng máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad) để đọc kết quả về hàm lượng màu qua phổ hấp phụ ở bước sóng 490nm
Trang 8CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập cặn chiết phân đoạn CH 2 Cl 2
Từ 101,90 gam cặn chiết CH2Cl2, tiến hành sắc ký cột silica gel với hệ dung môi
CH2Cl2/MeOH gradient (bắt đầu từ 0% MeOH đến 50% MeOH) Cuối cùng dùng dung môi MeOH 100% để dội cột nhằm rửa toàn bộ các chất còn bị giữ lại trên cột sắc
ký
Sử dụng sắc ký lớp mỏng để kiểm tra các phân đoạn, soi UV ở bước sóng 254
nm và 365 nm, hiện màu bản mỏng bằng thuốc thử Ce(SO4)2 và vanilin Kết quả, thu được 13 phân đoạn chính như sau:
Bảng 3.1: Khối lượng các phân đoạn từ cặn chiết CH 2 Cl 2 của lá đu đủ (bảng 3.2 của luận văn)
TT Kí hiệu phân đoạn Khối lượng (g)
3.2 Phân lập các hợp chất từ một số phân đoạn
Từ phân đoạn F5, sau khi tinh chế bằng cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2/MeOH gradient, thu được 6 phân đoạn nhỏ kí hiệu F5.1-F5.6 Phân đoạn F5.2 được tinh chế
bằng cột sephadex với dung môi MeOH thu được chất sạch CP1 (139,6 mg)
Từ phân đoạn F8, sau khi tinh chế bằng cột silica gel với hệ dung môi Hx/EtOAc gradient thu được 5 phân đoạn nhỏ kí hiệu F8.1-F8.5 Phân đoạn F8.3 được tinh chế
Trang 9bằng cột sephadex với dung môi MeOH và cột silica gel hệ dung môi Hx/EtOAc xuất hiện tinh thể Lọc rửa bằng Hx/CH2Cl2 thu được chất sạch CP2 (6,7 mg)
Từ phân đoạn F9.I, sau khi chạy cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2/EtOAc gradient
và HCOOH (1%) thu được 11 phân đoạn nhỏ kí hiệu F9.I.1-F9.I.11 Phân đoạn F9.I.3 được tinh chế bằng cột sephadex với dung môi EtOH và cột silica gel với hệ dung môi
CH2Cl2/EtOAc gradient thu được chất sạch CP3 (6 mg) Phân đoạn F9.I.11 được tinh
chế bằng cột sephadex với dung môi MeOH và cột silica gel với hệ dung môi
CH2Cl2/axeton geadient thu được chất sạch CP4 (16,4 mg)
Từ phân đoạn F11.II, sau khi chạy cột silica gel với hệ dung môi
CH2Cl2/EtOAc/NH4OH và CH2Cl2/MeOH/NH4OH thu được 7 phân đoạn nhỏ kí hiệu F11.II.1- F11.II.7 Kết tinh phân đoạn F11.II.4 bằng hệ dung môi Hx/CH2Cl2 thu được
chất sạch CP5 (210,1 mg) Dịch cái tiếp tục được tinh chế bằng sắc kí cột silica gel với
hệ dung môi CH2Cl2/EtOAc/NH4OH và sắc ký cột sephadex với dung môi MeOH thu
C-Phân tích chi tiết các phổ 1H-NMR, 13C-NMR và DEPT và so sánh với tài liệu tham
khảo cho phép xác định chất CP1 là danielone Hợp chất này lần đầu tiên được tách ra
từ lá đu đủ
OCH3
OH OCH3
Trang 10HR-1H-NMR (500 MHz, CD3OD): δ (ppm): 1,37 (6H, m, CH2-4’+ CH2-5’+ CH2-6’); 1,06
(2H, quint, J= 7,5 Hz, CH2-7’); 1,69 (2H, quint, J= 7,5 Hz, CH2-3’); 2,28 (2H, t, J=
7,5 Hz, CH2-8’); 2,30 (3H, s, CH3); 2,71 (2H, t, J= 7,5 Hz, CH2-2’); 5,97 (1H, d, J= 3,5 Hz, H-4); 6,92 (1H, d, J= 3,5 Hz, H-5)
13C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ (ppm) 12,8 (CH3); 26,1 7’); 27,1 3’); 30,1 6’); 30,2 (C-5’); 30,3 (C-4’); 35,1 (C-8’); 38,4 (C-2’); 110,3 (C-4); 119,7 (C-5); 132,2 (C-2); 138,6 (C-3); 177,0 (C-9’); 192,1 (C-1’)
(C-
Hình 3.2: Phổ HR-ESI-MS (+) của hợp chất CP2 (hình 3.4 của luận văn)
Hình 3.3: Phổ 13 C-NMR của hợp chất CP2 (hình 3.6 của luận văn)
Trang 11Hình 3.4: Phổ 1 H-NMR của hợp chất CP2 (hình 3.7 của luận văn)
Hình 3.5: Phổ COSY của hợp chất CP2 (hình 3.9 của luận văn)
Trang 12Hình 3.6: Phổ HMBC của hợp chất CP2 (hình 3.10 của luận văn)
Hình 3.7: Phổ HSQC của hợp chất CP2 (hình 3.11 của luận văn)
Phân tích dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR, COSY, HSQC, HMBC chúng tôi xác định
được chất CP2 là axit 9 ’ -(3-methyl-pyrrol-2-yl)-9 ’ -oxononanoic Đây là một hợp chất mới được đặt tên là carpainone Trên thế giới và ở Việt Nam chưa có công bố
về hợp chất này trong lá đu đủ cũng như ở các loại thực vật khác
N
H
COOH O
1'
2'
3'
4' 5'
6' 7'
8' 2