NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT CHIẾT TÁCH TỪ LÁ ĐU ĐỦ (Carica papaya Linn)

Header Page of 148 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Hồ Thị Hà NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT CHIẾT TÁCH TỪ LÁ ĐU ĐỦ (Carica papaya Linn) Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 62420201 TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CƠNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội - 2014 Footer Page of 148 Header Page of 148 Cơng trình hồn thành tại: Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Đỗ Thị Hoa Viên TS Lê Quang Hịa Phản biện 1: PGS.TS Nguyễn Thị Hồng Anh Phản biện 2: PGS.TS Vũ Đình Hồng Phản biện 3: PGS.TS Hà Huy Kế Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp Trường họp Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Vào hồi …… giờ, ngày … tháng … năm ……… Có thể tìm hiểu luận án thư viện: Thư viện Tạ Quang Bửu - Trường ĐHBK Hà Nội Thư viện Quốc gia Footer Page of 148 Header Page of 148 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ Do Thi Hoa Vien, Ho Thi Ha (2013) Research on anti-cancer activity of some extracts from Vietnamese carica papaya leaves Proceeding of the 7th SEATUC Symposium, 4-6 March 2013, Bangdung, Indonesia, ISSN 2186 – 7631, OS4-4 Hồ Thị Hà, Lê Quang Hòa, Phạm Văn Cường, Đoàn Thị Mai Hương, Nguyễn Thùy Linh, Châu Văn Minh, Đỗ Thị Hoa Viên (2013) Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học đu đủ carica papaya họ đu đủ (caricaceae) Tạp chí hóa học, T 51 (6ABC), ISSN 0866 - 7144, pp 59 – 63 Hồ Thị Hà, Đỗ Thị Hoa Viên, Lê Quang Hòa (2014) Nghiên cứu hoạt tính sinh học số hợp chất chiết tách từ đu đủ (Carica papaya L.) Tạp chí khoa học cơng nghệ Việt Nam, Khoa học Công nghệ, số 2+3, ISSN 1859 – 4794, pp 119-122 Hồ Thị Hà, Đỗ Thị Hoa Viên, Lê Quang Hịa, Phạm Văn Cường, Đồn Thị Mai Hương, Nguyễn Thùy Linh, Châu Văn Minh (2014) Carpainone: alkaloid từ đu đủ Tạp chí khoa học công nghệ, viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, tập 52, số 5, ISSN 0866708X, pp593 - 598 Footer Page of 148 Header Page of 148 ĐẶT VẤN ĐỀ Tính cấp thiết đề tài Cây đu đủ (Carica papaya Linn) loại ăn trồng nước vùng nhiệt đới Ở Việt Nam, đu đủ trồng hầu hết tỉnh miền Bắc miền Nam Lá đu đủ chứng minh có khả chống oxy hóa mạnh, có hoạt tính kháng khuẩn tốt Ngồi ra, đu đủ cịn có khả kháng viêm, giảm đau Đã có thơng báo dịch chiết nước đu đủ có tác dụng ức chế số dòng tế bào ung thư người ung thư dày, ung thư phổi, ung thư máu Ngoài ra, nước đu đủ cịn có tác dụng điều hịa miễn dịch Tuy nhiên, cơng bố sơ lược dạng dịch chiết chưa xác định thành phần hoạt chất Vì vậy, việc chứng minh thành phần hoạt chất cụ thể đu đủ việc làm cần thiết, tạo sở khoa học cho việc ứng dụng nguồn nguyên liệu sẵn có Việt Nam làm thuốc điều trị bệnh ung thư Do đó, tơi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu hoạt tính sinh học số hợp chất chiết tách từ đu đủ (Carica papaya Linn” Mục tiêu đề tài - Phân lập xác định cấu trúc số hợp chất có hoạt tính sinh học hợp chất có đu đủ - Đánh giá hoạt tính sinh học hợp chất phân lập làm sở khoa học chứng minh cho việc người dân số nước giới sử dụng đu đủ chữa trị số loại bệnh có bệnh ung thư Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu phân lập số hợp chất có đu đủ - Xác định cấu trúc số hợp chất phân lập - Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư phân đoạn cặn chiết từ đu đủ - Đánh giá khả gây độc tế bào hợp chất phân lập Footer Page of 148 Header Page of 148 - Đánh giá khả kích hoạt enzyme caspase 3/7 hợp chất carpaine pseudocarpaine dòng tế bào ung thư phổi LU-1 - Đánh giá khả chống oxy hóa hợp chất phân lập từ đu đủ phương pháp: loại bỏ gốc tự 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), thử nghiệm malonyl dialdehyd (MDA), chống oxy hóa in vitro tế bào gan chuột phân lập - Đánh giá khả kháng vi khuẩn nấm hợp chất phân lập từ đu đủ - Đánh giá khả kích thích miễn dịch hợp chất phân lập từ đu đủ Tính đề tài Phân lập xác định cấu trúc hợp chất từ đu đủ (Carica papaya Linn) đặt tên carpainone Đã xác định hoạt tính gây độc lên số dòng tế bào ung thư hợp chất phân lập từ đu đủ, hợp chất carpaine pseudocarpaine thể hoạt tính gây độc tế bào ung thư rõ rệt Lần xác định khả kích hoạt enzyme caspase 3/7 hợp chất carpaine pseudocarpaine tế bào ung thư phổi LU-1 Đánh giá khả chống oxy hóa, kháng vi khuẩn, kháng nấm khả kích thích miễn dịch số hợp chất phân lập từ đu đủ Bố cục luận án Luận án gồm 113 trang: Đặt vấn đề (3 trang), chương 1: tổng quan (29 trang) Chương 2: vật liệu phương pháp nghiên cứu (12 trang) Chương 3: kết thảo luận (56 trang với bảng 54 hình) Kết luận kiến nghị (2 trang) Danh mục cơng trình cơng bố (1 trang) Tài liệu tham khảo (10 trang gồm 20 tài liệu tiếng Việt, 86 tài liệu tiếng Anh) Footer Page of 148 Header Page of 148 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu đu đủ Họ đu đủ (Caricaceae) giới gồm có chi 45 loài, phân bố vùng nhiệt đới cận nhiệt đới Ở nước ta có chi loài Một số giống đu đủ trồng Việt Nam bao gồm: giống đu đủ ta, đu đủ Mêhico, đu đủ So Lo, đu đủ Trung Quốc, đu đủ Thái Lan, đu đủ Đài Loan Tại Hà Nội, có giống đu đủ Đài Loan trồng huyện: Gia Lâm, Đơng Anh, Sóc Sơn, Thạch Thất,… 1.2 Nghiên cứu thành phần hóa học đu đủ Trong đu đủ có chất: tannin, alkaloid, saponin, glycosis, phytosterol, phenol, flavonoid, steroid, terpenoid,… Alkaloid có khung piperidin, chủ yếu carpaine, pseudocarpaine, dehydrocarpaine I, dehydrocarpaine II, choline, … Ngoài cịn có vitamin C, E, ngun tố khống Ca, K, Mg, Zn, Mn, Fe, H H (C H 2)7 N C H 2C CH2 C O O C H CH2 N H H Carpaine (C H 2)7 C H C O C=O H C CH2 C CH2 CH3 C=O O H N C H 2C C=O C CH3 CH3 (C H 2)7 C C=O H H H CH3 C H CH2 N CH2 C (C H 2)7 H H Pseudocarpaine 1.3 Nghiên cứu hoạt tính sinh học đu đủ Một số nhóm chất đu đủ có hoạt tính chống ung thư Ví dụ: nhóm glucosise bao gồm chất benzyl glucosinolate, benzyl isothiocyanate có hoạt tính chống nhiều dịng tế bào ung thư khác Nhóm chất phenol bao gồm chất: 5,7-dimethoxy coumarin, axi protocatechui, axit ρcoumaric, axit caffeic, kaempferol, quercetin Nhóm chất chứng minh có hoạt tính: ưc chế tăng sinh tế bào, tăng cường chức miễn dịch, ức chế enzyme pha I II chu kỳ phân bào, ức chế kết dính tế bào xâm lấn, cảm ứng q trình tự chết Nhóm chất carotenoid chất: β-carotene, lycopene, β-cryptoxanthin Nhóm chất có tác Footer Page of 148 Header Page of 148 dụng phòng ung thư phổi, ung thư tiền liệt tuyến, ung thư vú, ung thư dày, ung thư gan,… Trong đu đủ có chứa protein bất hoạt ribosome (RIPs) RIPs có khả gây độc tế bào ung thư vú T47D với IC50 = 2,8 μg/ml Chất chiết nước từ phần khác đu đủ có tác dụng ngăn ngừa, tiêu diệt ức chế nhiều loại tế bào ung thư như: dày, phổi, tuyến tụy, gan, máu, lymphoma, bệnh bạch cầu, Dịch chiết đu đủ nước (nồng độ 0,625-20 µg/ml) có tác dụng ức chế nhiều dịng tế bào ung thư khác Tác giả chứng minh dịch chiết từ đu đủ cịn có tác dụng hỗ trợ hệ miễn dịch để công vào tế bào ung thư Bằng cách thúc đẩy gia tăng sản phẩm cytokine dạng Th1 IL-12p40, IL-12p70, INF-γ TNF-α, cytokine có khả chống lại khối u Sau tác giả sử dụng màng lọc để tách thành phần có trọng lượng phân tử khác Các chất có hoạt tính ức chế tế bào ung thư điều hòa miễn dịch xác định nằm phần có trọng lượng phân tử nhỏ 1000 Chất chiết đu đủ có hoạt tính chống oxy hóa Các giống đu đủ khác có tổng hàm lượng phenol khác hoạt tính chống oxy hóa khác Điều chứng tỏ chất phenol gây hoạt tính chống oxy hoá Các phận khác đu đủ có hoạt tính chống oxy hóa giảm dần theo thứ tự: non → xanh → chín → hạt Tuy nhiên, hoạt chất có tác dụng chống oxy hóa cịn chưa phân lập Dịch chiết đu đủ có khả ức chế nhiều loại vi khuẩn nấm Cao đu đủ có tác dụng kháng khuẩn Typhimurium mentagrophytes, T rubrum Staphylococcus aureus Ngồi ra, dịch chiết đu đủ cịn có khả kháng viêm, kháng virut sốt xuất huyết,… Footer Page of 148 Header Page of 148 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Mẫu thực vật Giống đu đủ Đài Loan (Carica papaya L.) trồng Nam Hồng – Đông Anh – Hà Nội Thu hái đu đủ cái, dạng bánh tẻ, không bị sâu bệnh, không bị dập nát Lá thu hái vào tháng 10 năm 2012 Lá đu đủ thu hái sấy nhiệt độ 40 - 500C khô nghiền thành bột 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Các phương pháp phân lập xác định cấu trúc hợp chất: dùng phương pháp chiết ngâm, chiết sóng siêu âm để thu cặn chiết từ đu đủ Sử dụng sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng để phân lập chất tinh khiết Sử dụng phổ hồng ngoại, phổ khối lượng, phổ cộng hưởng từ hạt nhân để xác định cấu trúc hợp chất phân lập 2.2.2 Các phương pháp thử hoạt tính sinh học 2.2.2.1 Phương pháp thử độ độc tế bào (cytotoxic assay): Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD – Optical Density) đo thành phần protein tế bào nhuộm Sulforhodamine B (SRB) Giá trị OD máy đo tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, lượng tế bào nhiều (lượng protein nhiều) giá trị OD lớn Phép thử thực điều kiện cụ thể sau: - Chất thử (10 l) pha DMSO 10% đưa vào giếng khay 96 giếng để có nồng độ 100 g/ml; 20g/ml; g/ml; 0,8 g/ml - Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào, thêm lượng tế bào phù hợp để chúng phát triển vòng từ 3-5 ngày - Một khay 96 giếng khác khơng có chất thử có tế bào ung thư sử dụng làm đối chứng ngày - Sau giai đoạn phát triển tủ ấm CO2, tế bào cố định vào đáy giếng axit trichloracetic 30 phút, nhuộm SRB 37 0C Footer Page of 148 Header Page of 148 - Cuối cùng, sử dụng 10 mM unbuffered Tris base để hòa tan lượng SRB bám nhuộm phân tử protein, đưa lên máy lắc đĩa lắc nhẹ 10 phút sử dụng máy ELISA Plate Reader để đọc kết hàm lượng màu chất nhuộm SRB qua phổ hấp phụ bước sóng 515 nm - Ellipticine ln sử dụng chất đối chứng dương - DMSO10% sử dụng đối chứng âm Chất thử có IC50 < 20 g/ml (với chất chiết thô, với phân đoạn hóa học) IC50  g/ml (với hoạt chất tinh khiết) xem có hoạt tính gây độc tế bào có khả ức chế phát triển diệt tế bào ung thư 2.2.2.2 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme caspase / 7: Được thực dựa kit Apo-ONE® Homogeneous Caspase-3/7 Assay (Promega) theo hướng dẫn nhà sản xuất 2.2.2.3 Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa loại bỏ gốc tự DPPH Nguyên tắc: 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) gốc tự dùng để sàng lọc tác dụng chống oxy hóa chất nghiên cứu Hoạt tính chống oxy hóa thể qua việc làm giảm màu DPPH chất thử, xác định phép đo độ hấp thụ bước sóng 517 nm máy quang phổ 2.2.2.4 Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hố in vitro thử nghiệm malonyl dialdehyd (MDA test) Xác định khả ức chế peroxy hố lipid thơng qua việc xác định hàm lượng MDA theo phương pháp Stroev E A, Makarova V G (1989), Viện Dược liệu - Bộ Y Tế (2006) Khi cho phản ứng với axit thiobarbituric, phân tử MDA phản ứng với hai phân tử axit thiobarbituric tạo phức màu hồng hấp thu cực đại bước sóng 532 nm Phản ứng thực môi trường pH - 3, nhiệt độ 90 - 100 0C vòng 10 - 15 phút Đo cường độ màu phức suy lượng MDA có mẫu 2.2.2.5 Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hố in vitro tế bào gan chuột Footer Page of 148 Header Page 10 of 148 Chuột BALB/c khoẻ mạnh sử dụng để tách tế bào tế bào gan Tế bào gan sau phân lập nuôi ổn định 1-2 ngày Thêm hoạt chất nghiên cứu cucurmin (đối chứng dương) Thêm 100 µM H2O2 vào giếng, ủ Cho 50 µl/giếng MTT nồng độ 1mg/ml, ủ Loại bỏ dịch nổi, thêm vào giếng 100 µl DMSO 100% Đo mật độ quang học (OD) bước sóng 492 nm 2.2.2.6 Phương pháp thử hoạt tính kháng vi khuẩn nấm Hoạt tính kháng vi khuẩn nấm thực dựa phương pháp pha loãng đa nồng độ (Multimicrodilution assay) 2.2.2.7 Phương pháp thử hoạt tính kích thích miễn dịch Động vật thí nghiệm: Thỏ tháng tuổi khỏe mạnh, nuôi chuồng nuôi viện Công nghệ sinh học Hoạt tính kích thích miễn dịch mẫu xác định theo phương pháp MTT (Mosmann (1983)) Tế bào lympho đưa vào giếng đĩa 96 giếng với nồng độ 2x106 tế bào/ml Bổ sung chất thử pha DMSO 10% Concavalin A sử dụng làm đối chứng Mẫu ủ thời gian 48h 37 oC, 5% CO2 Sau giai đoạn phát triển tủ ấm CO2, thêm vào giếng 50µl MTT 1mg/ml Sau ủ đĩa tế bào 37o C 4h, loại bỏ môi trường thêm vào giếng 100 µl DMSO Đĩa tế bào đưa lên máy lắc đĩa lắc nhẹ 10 phút sử dụng máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad) để đọc kết hàm lượng màu qua phổ hấp phụ bước sóng 490nm Footer Page 10 of 148 Header Page 13 of 148 O HO 2' OCH3 1' 3' 6' 4' 5' OH OCH3 Hình 3.1: Cấu trúc hóa học hợp chất danielone (hình 3.3 luận văn) 3.3.2 Hợp chất CP2 Chất rắn màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 135 - 1370C ESI-MS: m/z 274 [M+Na]+ HR-ESI-MS (+) m/z: 274,1411 H-NMR (500 MHz, CD3OD): δ (ppm): 1,37 (6H, m, CH2-4’+ CH2-5’+ CH2- 6’); 1,06 (2H, quint, J= 7,5 Hz, CH2-7’); 1,69 (2H, quint, J= 7,5 Hz, CH2-3’); 2,28 (2H, t, J= 7,5 Hz, CH2-8’); 2,30 (3H, s, CH3); 2,71 (2H, t, J= 7,5 Hz, CH2-2’); 5,97 (1H, d, J= 3,5 Hz, H-4); 6,92 (1H, d, J= 3,5 Hz, H-5) 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ (ppm) 12,8 (CH3); 26,1 (C-7’); 27,1 (C-3’); 30,1 (C-6’); 30,2 (C-5’); 30,3 (C-4’); 35,1 (C-8’); 38,4 (C-2’); 110,3 (C-4); 119,7 (C-5); 132,2 (C-2); 138,6 (C-3); 177,0 (C-9’); 192,1 (C-1’) Hình 3.2: Phổ HR-ESI-MS (+) hợp chất CP2 (hình 3.4 luận văn) Hình 3.3: Phổ 13C-NMR hợp chất CP2 (hình 3.6 luận văn) 10 Footer Page 13 of 148 Header Page 14 of 148 Hình 3.4: Phổ 1H-NMR hợp chất CP2 (hình 3.7 luận văn) Hình 3.5: Phổ COSY hợp chất CP2 (hình 3.9 luận văn) Hình 3.6: Phổ HMBC hợp chất CP2 (hình 3.10 luận văn) 11 Footer Page 14 of 148 Header Page 15 of 148 Hình 3.7: Phổ HSQC hợp chất CP2 (hình 3.11 luận văn) Phân tích liệu phổ 1H-NMR, 13 C-NMR, COSY, HSQC, HMBC xác định chất CP2 axit 9’-(3-methyl-pyrrol-2-yl)-9’oxononanoic Đây hợp chất đặt tên carpainone Trên giới Việt Nam chưa có cơng bố hợp chất đu đủ loại thực vật khác 2' N 4' 8' 6' 1' 3' 5' COOH 9' O H 7' Hình 3.8: Cấu trúc hóa học hợp chất carpainone (hình 3.12 luận văn) 3.3.3 Hợp chất CP3 Chất rắn màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 192 – 1930C ESI-MS: m/z 167 [MH]- H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm) 3,91 (3H, s, OCH3), 6,83 (1H, d, J= 8,0 Hz, H-6), 7,55 (1H, dd, J = 1,5; 8,0 Hz, H-5), 7,58 (1H, dd, J = 1,5 Hz, H-3) Sau so sánh số liệu phổ chất CP3 với tài liệu tham khảo đến kết luận chất CP3 axit pluchoic C OOH OCH OH 12 Footer Page 15 of 148 Header Page 16 of 148 Hình 3.9: Cấu trúc hóa học hợp chất axit pluchoic (hình 3.15 luận văn) 3.3.4 Hợp chất CP4 Chất rắn màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 100 - 1040C [α]25D +288 (c=0,25 g/100ml MeOH) H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm) 0,97 (3H, s, CH3-12), 1,01 (3H, s, CH3- 13), 1,26 (3H, d, J = 6,5 Hz, CH3-10), 2,10 (1H, d, J = 17,0 Hz, H-2a), 2,38 (1H, d, J = 17,0 Hz, H-2b), 2,56 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-6), 4,11 (1H, dd, J = 1,5; 17,0 Hz, H-11a), 4,20 (1H, dd, J = 1,5; 17,0 Hz, H-11b), 4,20 (1H, quint, J = 6,0 Hz, H-9), 5,57 (dd, J = 8,5; 15,5 Hz, H-7), 5,66 (1H, dd, J = 5,5; 15,5 Hz, H-8), 6,17 (1H, s, H-4) 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ (ppm) 23,5 (CH3-10), 27,0 (CH3-12), 27,7 (CH3-13), 36,2 (C-1), 48,1 (C-2), 50,8 (C-6), 63,8 (C-11), 68,0 (C-9), 122,3 (C-4), 126,3 (C-8), 138,6 (C-7), 165,9 (C-5), 199,6 (C=O) Phân tích chi tiết phổ 1H-NMR, 13C-NMR DEPT COSY, HSQC, HMBC so sánh với tài liệu tham khảo, xác định chất CP4 Apocynol A Hợp chất lần tách từ đu đủ OH O 10 OH Hình 3.10: Cấu trúc hóa học hợp chất Apocynol A (hình 3.19 luận văn) 3.3.5 Hợp chất CP5 Chất rắn màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 118 – 1200C ESI-MS: m/z 479 [M+H]+, 240 [M/2+H]+ H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm) 1,05 (3H, d, J = 7,0 Hz, CH3-2), 1,19 (1H, m, H-5a), 1,32 (9H, m, CH2-8+ CH2-9 + CH2-10 + CH2-11 + H-7a), 1,47 (2H, m, H-7b + H-5b), 1,65 (3H, m, CH2-12 + H-4a), 2,01 (1H, m, H-4b), 2,32 (1H, m, H-13a), 2,42 (1H, m, H-13b), 2,59 (1H, m, H-6), 2,87 (1H, dq, J=1,0, 7,0 Hz, H-2), 4,77 (1H, br, s, H-3) 13 Footer Page 16 of 148 Header Page 17 of 148 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ (ppm) 18,6 (CH3-2), 25,4 (C-12), 25,4 (C- 8), 26,2 (C-5), 28,7 (C-11), 29,1 (C-4), 29,7 (C-9), 29,7 (C-10), 34,6 (C-13), 37,2 (C-7), 53,6 (C-2), 50,6 (C-6), 70,3 (C-3), 173,5 (C=O) Từ liệu phổ 1D, 2D-NMR, MS so sánh với tài liệu tham khảo cho phép xác định alkaloid có cấu trúc đối xứng hai bên có tên carpaine H H N 6' (C H 2)7 2' CH 3' 5' O 4' C=O C O O H 3C H N (C H 2)7 H Hình 3.11: Cấu trúc hóa học hợp chất carpaine (hình 3.24 luận văn) 3.3.6 Hợp chất CP6 Chất rắn màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 72 – 730C ESI-MS: m/z 479 [M+H]+, 240 [M/2+H]+ H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm) 1,02 (3H, d, J = 6,5 Hz, CH3), 1,06 (3H, d, J = 6,5 Hz, CH3), 2,50 (2H, m, H-6 + H-6’), 2,69 (1H, m, H-2a), 2,86 (1H, dq, J=1,5, 6,5 Hz, H-2’), 4,33 (1H, m, H-3), 4,83 (1H, br s, H-3’), 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ (ppm) 18,5 (CH3), 19,1 (CH3), 24,7 (CH2), 24,9 (CH2), 25,1 (CH2), 25,4 (CH2), 26,7 (CH2), 27,8 (CH2), 28,0 (CH2), 28,1 (CH2), 28,4 (CH2), 28,5 (CH2), 28,8 (CH2), 29,1 (CH2), 29,5 (CH2), 30,6 (CH2), 30,9 (CH2), 34,5 (CH2), 34,8 (CH2), 35,4 (CH2), 37,3 (CH2), 53,8 (CH), 54,9 (CH), 55,7 (CH), 56,6 (CH), 70,1 (CH), 75,8 (CH), 173,3 (C=O), 173,7 (C=O) Kết hợp liệu phổ so sánh với tài liệu tham khảo cho phép xác định chất CP6 đồng phân chất CP5, khác nhóm CH3 C-2 dạng axial Hợp chất có tên pseudocarpaine phân lập từ đu đủ 14 Footer Page 17 of 148 Header Page 18 of 148 H CH N 6' (C H 2)7 2' H 3' 5' O 4' C=O C O O H 3C H N (C H 2)7 H Hình 3.12: Cấu trúc hóa học hợp chất pseudocarpaine (hình 3.28 luận văn) Kết luận: Từ cặn chiết CH2Cl2 đu đủ, tách chiết hợp chất Trong đó, hợp chất danielone (CP1) tách từ phân đoạn F5 cặn chiết Hợp chất carpainone (CP2) tách từ phân đoạn F8 cặn chiết, Hợp chất axit pluchoic (CP3), apocynol A (CP4) tách từ phân đoạn F9 cặn chiết Hợp chất carpaine (CP5), pseudocarpaine (CP6) tách từ phân đoạn F11 cặn chiết 3.4 Đánh giá tác dụng gây độc tế bào ung thư cặn chiết từ đu đủ Cặn chiết phân đoạn đem thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư: ung thư biểu mô người KB, ung thư phổi người LU-1, ung thư vú người MCF-7 Kết thu hình 3.13: Trong phân đoạn cặn chiết loại cặn chiết (Hx, EtOAc, BuOH cặn nước lại) khơng có hoạt tính gây độc tế bào ung thư KB, LU-1, MCF7 (với IC50>100 μg/ml) Chỉ có cặn chiết CH2Cl2 có hoạt tính gây độc tế bào dòng tế bào ung thư thử nghiệm: KB, LU-1, MCF-7 với giá trị IC50 (μg/ml) là: 18,44; 18,21; 19,16 Hình 3.13: Tổng hợp kết thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư cặn chiết từ đu đủ (Hình 3.32 luận văn) 15 Footer Page 18 of 148 Header Page 19 of 148 3.5 Đánh giá tác dụng gây độc tế bào ung thư biểu mô KB phân đoạn phân lập từ cặn chiết CH2Cl2 từ đu đủ Sau phân lập cặn CH2Cl2 sắc ký cột silica gel thu 13 phân đoạn F1- F13 Các phân đoạn F1- F13 đem thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư biểu mơ KB, kết sau: Hình 3.14: Kết gây độc tế bào dòng tế bào ung thư biểu mô KB phân đoạn cặn chiết CH2Cl2 từ đu đủ (Hình 3.33 luận văn) Kết cho thấy: Các phân đoạn F8, F9, F10, F11 hoạt tính gây độc tế bào ung thư biểu mô KB với IC50 từ 15,41 đến 6,86 g/ml Đặc biệt phân đoạn F10, F11 thể hoạt tính gây độc tế bào ung thư biểu mơ KB mạnh (IC50 tương ứng 7,17 6,86 g/ml) Các phân đoạn cịn lại khơng có có hoạt tính ức chế tế bào ung thư biểu mơ KB yếu (IC50 từ 23,93 đến >100 g/ml) Đối chứng dương ellipticine hoạt động ổn định 3.6 Đánh giá tác dụng gây độc tế bào ung thư hợp chất phân lập từ đu đủ Chúng tiến hành xác định khả diệt kìm hãm phát triển tế bào ung thư hợp chất phân lập từ đu đủ bốn dịng tế bào ung thư khác Ngồi ra, mẫu nghiên cứu thử nghiệm tế bào thường NH3T3 người xem dòng tế bào đối chứng để kiểm tra khả gây độc tế bào với tế bào bình thường Kết cụ thể sau: 16 Footer Page 19 of 148 Header Page 20 of 148 Hình 3.15: Tổng hợp kết thử hoạt tính gây độc tế bào hợp chất phân lập từ đu đủ (hình 3.49 luận văn) Bốn hợp chất (danielone, carpainone, axit pluchoic, apocynol A) khơng có hoạt tính gây độc tế bào 04 dòng tế bào ung thư dòng tế bào thường thử nghiệm Hai hợp chất carpaine pseudocarpaine thể hoạt tính tốt dòng tế bào ung thư nghiên cứu (ung thư biểu mô KB, ung thư máu LH60, ung thư phổi LU-1, ung thư vú MCF-7) với giá trị IC50 từ 1,13 đến 3,49 µg/ml 3.7 Đánh giá khả kích hoạt enzyme caspase 3/7 số hợp chất lên tế bào ung thư phổi LU-1 Xác định khả kích hoạt enzyme caspase 3/7 hợp chất (carpaine pseudocarpaine) tách chiết từ đu đủ dòng tế bào ung thư phổi LU-1 Kết cụ thể sau: 3.7.1 Đánh giá khả kích hoạt enzyme caspase 3/7 hợp chất carpaine lên tế bào ung thư phổi LU-1 Hợp chất carpaine tách chiết từ đu đủ đánh giá khả kích hoạt enzyme caspase 3/7 dịng tế bào ung thư phổi LU-1 Hình 3.16: Kết kích hoạt enzyme caspase 3/7 hợp chất carpaine lên tế bào ung thư phổi LU-1(hình 3.50 luận văn) 17 Footer Page 20 of 148 Header Page 21 of 148 Hợp chất carpaine thể khả kích hoạt enzyme caspase 3/7 nồng độ thử cao (20 µg/ml) 386,5 RFU Chất đối chứng dương tamoxifen hoạt động ổn định thí nghiệm với hoạt tính caspase nồng độ 20 µg/ml 3100 RFU Thơng qua thí nghiệm xác định độ độc hoạt chất lên dòng tế bào nuôi cấy phương pháp nhuộm SRB, kết tỉ lệ tế bào sống sót so với đối chứng hoạt chất nồng độ thử nghiệm nằm khoảng 84,67 đến 90,44% cho thấy hợp chất carpaine không gây chết tế bào diện rộng có tác động định lên tế bào 3.7.2 Đánh giá khả kích hoạt enzyme caspase 3/7 hợp chất psuedocarpaine lên tế bào ung thư phổi LU-1 Hợp chất pseudocarpaine tách chiết từ đu đủ đánh giá khả kích hoạt enzyme caspase 3/7 dịng tế bào ung thư phổi LU-1 Hình 3.17: Kết kích hoạt enzyme caspase 3/7 hợp chất pseudocarpaine lên tế bào ung thư phổi LU-1(hình 3.51 luận văn) Kết cho thấy hợp chất pseudocarpaine thể khả kích hoạt enzyme caspase 3/7 nồng độ thử cao (30µg/ml) 778 RFU Chất đối chứng dương tamoxifen hoạt động ổn định thí nghiệm với hoạt tính caspase nồng độ 20 µg/ml 3100 RFU Thơng qua thí nghiệm xác định độ độc hoạt chất lên dịng tế bào ni cấy phương pháp nhuộm SRB, kết tỉ lệ tế bào sống sót so với đối chứng hoạt chất nồng độ thử nghiệm nằm khoảng 89 đến 96 18 Footer Page 21 of 148 Header Page 22 of 148 % cho thấy hợp chất pseudocarpaine không gây chết tế bào diện rộng có tác động định lên tế bào 3.8 Đánh giá khả chống oxy hóa hợp chất phân lập từ đu đủ 3.8.1 Kết chống oxy hóa in vitro phương pháp loại bỏ gốc tự DPPH hợp chất phân lập từ đu đủ Xác định khả chống oxy hóa hợp chất tách chiết từ đu đủ phương pháp thử DPPH Hình 3.18: Kết thử hoạt tính chống oxy hóa DPPH hợp chất chiết tách từ đu đủ (hình 3.52 luận văn) Kết cho thấy: hợp chất thử nghiệm có EC50 > 128 µg/ml, lớn nồng độ cao phép thử Chất tham khảo resveratrol có EC50 8,3 µg/ml Kết chứng tỏ, hợp chất tách chiết từ đu đủ chưa thể hoạt tính chống oxy hóa nồng độ thử nghiệm 3.8.2 Kết chống oxy hóa in vitro thử nghiệm MDA hợp chất phân lập từ đu đủ Xác định khả chống oxy hóa hợp chất tách chiết từ đu đủ phương pháp thử nghiệm MDA 19 Footer Page 22 of 148 Header Page 23 of 148 Hình 3.19: Kết thử hoạt tính chống oxy hóa phép thử MDA hợp chất chiết tách từ đu đủ (hình 3.53 luận văn) Bằng thử nghiệm MDA để kiểm tra khả chống oxy hóa in vitro hợp chất: danilone, carpainone, axit pluchoic, apocynol A, carpaine, pseudocarpaine nhận thấy có hợp chất pseudocarpaine nồng độ thử nghiệm cao 100 µg/ml có hoạt tính chống oxi hố khoảng 33,59%, cho thấy có hoạt tính yếu Các hợp chất cịn lại bao gồm: danilone, carpainone, axit pluchoic, apocynol A carpaine hoạt tính chống oxi hóa thử nghiệm MDA nồng độ nghiên cứu 3.8.3 Kết chống oxy hóa in vitro tế bào gan chuột hợp chất phân lập từ đu đủ Xác định khả chống oxy hóa hợp chất tách chiết từ đu đủ tế bào gan chuột Hình 3.20: Kết xác định hoạt tính chống oxi hóa tế bào gan chuột hợp chất chiết tách từ đu đủ (hình 3.54 luận văn) 20 Footer Page 23 of 148 Header Page 24 of 148 Qua trình nghiên cứu khả chống oxy hóa in vitro tế bào gan phân lập hoạt chất cho thấy chất khơng thể hoạt tính nồng độ nghiên cứu Cucurmin hoạt động ổn định thí nghiệm 3.9 Đánh giá khả kháng vi khuẩn nấm hợp chất phân lập Bảng 3.2: Kết thử hoạt tính kháng vi khuẩn nấm hợp chất phân từ đu đủ (bảng 3.5 luận văn) Nồng độ ức chế 50% phát triển vi khuẩn Chất thử nấm - IC50 (g/ml) Vi khuẩn gram dương Vi khuẩn gram âm Nấm Danielone >128 >128 >128 >128 >128 >128 >128 Carpainone >128 >128 >128 >128 >128 >128 >128 Axit pluchoic >128 >128 >128 >128 >128 >128 >128 Apocynol A >128 >128 >128 >128 >128 >128 >128 Carpaine >128 >128 >128 >128 >128 >128 >128 Pseudocarpaine 80 >128 >128 >128 >128 >128 >128 Ampicilin 1,0 1,05 1,02 - 1,2 - - Stretomycin - - - 1,25 - 12 - Amphotericin B - - - - - - 0,8 Kí hiệu: 1: Staphylococcus aureus, 2: Bacillus subtilis, 3: Lactobacillus fermentum, 4: Salmonella enterica, 5: Escherichia coli, 6: Pseudomonas aeruginosa, 7: Candida albican,(-): không thử Qua số liệu bảng 3.2 thấy rằng, có tổng số hợp chất thử nghiệm khơng có khả kháng chủng vi khuẩn gram dương, gram âm nấm nồng độ chất thử cao 128 µg/ml 21 Footer Page 24 of 148 Header Page 25 of 148 Riêng hợp chất pseudocarpaine thể hoạt tính kháng vi khuẩn gram dương Staphylococcus aureus yếu với IC50 80 µg/ml Cịn chủng vi khuẩn nấm cịn lại có IC50 > 128 µg/ml 3.10 Đánh giá khả kích thích tế bào lympho hợp chất phân lập từ đu đủ Tiến hành đánh giá khả kích thích tế bào lympho sáu hợp chất phân lập từ đu đủ Kết thu sau: Bảng 3.3: Kết kích thích tế bào lympho hợp chất phân lập từ đu đủ (bảng 3.6 luận văn) Nồng độ SI (chỉ số kích thích tế bào lympho (µg/ml) phát triển so với đối chứng âm) Chất thử 100 20 0,8 Danielone 1,15 1,04 1,05 1,01 Carpainone 0,95 0,93 0,93 0,92 pluchoic 0,98 1,00 1,03 1,00 Apocynol A 1,11 1,05 1,03 0,99 Carpaine 0,95 1,08 1,11 1,05 Pseudocarpa 1,04 0,99 0,98 1,00 1,44 1,15 1,04 1,01 (1 (0,5 (0,25 (0,125 µg/ml) µg/ml) µg/ml) µg/ml) Axit ine Concavalin A Kết cho thấy hoạt chất nghiên cứu hoạt tính kích thích tế bào lympho Concavalin A có cho thấy khả kích thích tế bào lympho tăng sinh Do vậy, không xác định giá trị SD50 tất mẫu nghiên cứu 22 Footer Page 25 of 148 Header Page 26 of 148 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Chiết phân đoạn dịch chiết MeOH từ đu đủ dung mơi có độ phân cực tăng dần (n-hexan, CH2Cl2, EtOAc, buthanol) Từ cặn chiết CH2Cl2 phân lập hợp chất kí hiệu từ CP1 đến CP6 xác định cấu trúc sau: danielone (CP1), carpainone (CP2), axit pluchoic (CP3), apocynol A (CP4), carpaine (CP5), pseudocarpaine (CP6) Trong carpainone hợp chất Hai hợp chất danielone apocynol A lần tách từ đu đủ Đã xác định phân đoạn cặn chiết CH2Cl2 đu đủ có khả gây độc tế bào ung thư biểu mô KB (IC50 = 18,44 µg/ml), ung thư phổi LU-1 (IC50 = 18,21 µg/ml) ung thư vú MCF-7 (IC50 = 19,16 µg/ml) Hai hợp chất carpaine pseudocarpaine phân lập từ cặn CH2Cl2 đu đủ lần chứng minh có hoạt tính gây độc mạnh bốn dòng tế bào ung thư người: ung thư biểu mô KB, ung thư máu HL-60, ung thư phổi LU-1, ung thư vú MCF-7 (IC50 từ 1,13 đến 3,49 µg/ml) Đồng thời hai hợp chất gây độc với tế bào thường người (tế bào NIH 3T3) (IC50 từ 1,40 đến 1,88 µg/ml) Các hợp chất lại (danielone, carpainone, axit pluchoic apocynol A) khả gây độc tế bào dòng tế bào ung thư dòng tế bào thường (IC50 >100 µg/ml) Hai hợp chất carpaine pseudocarpaine lần chứng minh khả kích hoạt enzyme caspase 3/7 (tương ứng 386,5 778 RFU) nồng độ thử nghiệm cao (tương ứng 20 30 µg/ml) khơng mạnh so với chất đối chứng tamoxifen (là 3100 RFU nồng độ thử 20 µg/ml) Các hợp chất phân lập từ đu đủ khả chống oxy hóa nồng độ nghiên cứu thử nghiệm DPPH (EC50 > 128 23 Footer Page 26 of 148 Header Page 27 of 148 µg/ml), MDA (ED50 > 100 µg/ml) tế bào gan chuột phân lập (ED50 > 100 µg/ml) Hợp chất pseudocarpaine cho thấy khả kháng vi khuẩn gram dương Staphylococcus aureus với IC50 = 80 µg/ml, khơng thể hoạt tính kháng chủng vi khuẩn gram dương, gram âm nấm khác nồng độ chất thử cao 128 µg/ml (với IC50 > 128 µg/ml) Các hợp chất lại (danielone, carpainone, axit pluchoic, apocynol A carpaine) khả kháng vi khuẩn nấm nồng độ thử nghiệm (với IC50 > 128 µg/ml) Các hợp chất phân lập từ đu đủ chưa cho thấy khả kích thích tế bào lympho nồng độ thử nghiệm Không xác định giá trị SD50 hợp chất nồng độ thử nghiệm từ 0,8 đến 100 µg/ml Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu số hoạt tính sinh học hợp chất carpaine pseudocarpaine như: khả hạn chế di khối u, khả hạn chế hình thành mạch máu khối u,… Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình để chiết tách carpaine pseudocarpaine từ đu đủ Carica papaya Linn 24 Footer Page 27 of 148 ... đề tài: ? ?Nghiên cứu hoạt tính sinh học số hợp chất chiết tách từ đu đủ (Carica papaya Linn” Mục tiêu đề tài - Phân lập xác định cấu trúc số hợp chất có hoạt tính sinh học hợp chất có đu đủ - Đánh... chuột hợp chất phân lập từ đu đủ Xác định khả chống oxy hóa hợp chất tách chiết từ đu đủ tế bào gan chuột Hình 3.20: Kết xác định hoạt tính chống oxi hóa tế bào gan chuột hợp chất chiết tách từ đu. .. kháng vi khuẩn nấm hợp chất phân lập từ đu đủ - Đánh giá khả kích thích miễn dịch hợp chất phân lập từ đu đủ Tính đề tài Phân lập xác định cấu trúc hợp chất từ đu đủ (Carica papaya Linn) đặt tên carpainone