NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ LOÀI THUỘC CHI UVARIA L. - HỌ NA (ANNONACEAE)

Header Page of 148 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ …………***………… HỒ VIỆT ĐỨC NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ LOÀI THUỘC CHI UVARIA L - HỌ NA (ANNONACEAE) Chuyên ngành: Hóa học hữu Mã số: 62.44.01.14 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC HÀ NỘI - 2015 Footer Page of 148 Header Page of 148 Công trình đƣợc hoàn thành tại: Viện Hoá sinh biển Viện Hàn lâm Khoa học Công Nghệ Việt Nam Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS TS Phan Văn Kiệm Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam PGS TS Nguyễn Thị Hoài Khoa Dược - Trường Đại học Y Dược Huế - Đại học Huế Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Viện họp tại: Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam - Số 18 Hoàng Quốc Việt - Cầu Giấy - Hà Nội Vào hồi ngày tháng năm Có thể tìm hiểu Luận án tại: Footer Page of 148 Header Page of 148 I GIỚI THIỆU LUẬN ÁN Đặt vấn đề Sự tác động người vào tự nhiên trình sinh sống phát triển kinh tế làm cho môi trường ngày suy thoái, ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe phát triển bền vững nhân loại Cùng với thiên tai, tình trạng bệnh tật diễn biến ngày phức tạp khó lường Gần giới phải đối mặt với bệnh nguy hiểm có khả lan rộng thành đại dịch quy mô toàn cầu Có thể lấy số ví dụ điển HIV/AIDS, ung thư, viêm đường hô hấp cấp SARS, cúm gia cầm H5N1, cúm lợn H1N1, dịch Ebola Thực tế thúc đẩy phải tìm kiếm thuốc chữa bệnh mới, có hiệu cao hơn, tác dụng chọn lọc giá thành rẻ Một đường hữu hiệu để tìm chất có hoạt tính tiềm năng, phát triển thành thuốc chữa bệnh từ hợp chất có nguồn gốc thiên nhiên Các hợp chất thường phù hợp với thể sống, độc thân thiện với môi trường nên sử dụng trực tiếp để làm thuốc, làm mô hình để nghiên cứu tổng hợp thuốc Nhiều hợp chất có nguồn gốc tự nhiên phát triển thành loại thuốc chữa bệnh có hiệu cao taxol, taxotere từ Thông đỏ (Taxus brevifolia); vinblastine, vincristine từ Dừa cạn (Catharanthus roseus); shikimic acid từ Đại hồi (Illicium verum); artemisinin từ Thanh hao hoa vàng (Artemisia annua) Có hai hướng việc tìm kiếm hoạt chất có hoạt tính sinh học từ đường sàng lọc tự nhiên từ kinh nghiệm sử dụng thuốc người dân địa phương Tri thức địa đóng vai trò quan trọng tìm kiếm thuốc với việc giảm thiểu chi phí sàng lọc ban đầu tác dụng định hướng trình nghiên cứu chứng minh kinh nghiệm sử dụng người dân Quá trình điều tra tìm hiểu kinh nghiệm chữa bệnh đồng bào dân tộc Pako, Vân Kiều cho thấy số loài thuộc chi Uvaria gồm Uvaria grandiflora Roxb ex Hornem, Uvaria cordata (Dun.) Wall ex Alston Uvaria fauveliana (Fin & Gagnep.) Ast sử dụng thuốc chữa bệnh liên quan đến khối u địa phương Các nghiên cứu ban đầu cho thấy cao chiết methanol từ loài thể hoạt tính gây độc tế bào in vitro dòng tế bào ung thư thử nghiệm, bao gồm LU-1 (ung thư phổi), KB (ung thư biểu mô), Footer Page of 148 Header Page of 148 MDA-MB-231 (ung thư vú), Hep-G2 (ung thư gan), SW-480 (ung thư ruột kết) MKN-7 (ung thư dày) Hơn nữa, loài Uvaria grandiflora, Uvaria cordata Uvaria fauveliana nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học nước giới Từ lí trên, đề xuất đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học số loài thuộc chi Uvaria L - họ Na (Annonaceae)” Đối tƣợng nghiên cứu nội dung luận án - Đối tượng nghiên cứu luận án loài thuộc chi Uvaria gồm Uvaria grandiflora Roxb ex Hornem, Uvaria cordata (Dun.) Wall ex Alston Uvaria fauveliana (Fin & Gagnep.) Ast - Nội dung luận án là: Nghiên cứu để làm rõ thành phần hóa học loài U grandiflora, U cordata U fauveliana Thử nghiệm hoạt tính sinh học phân đoạn hợp chất tách từ loài để tìm kiếm hoạt chất phục vụ sống Những đóng góp luận án 3.1 Đã phân lập xác định cấu trúc hợp chất [()-3-Odebenzoylzeylenone, grandionoside A, cordauvarin A, ufaside] 21 hợp chất biết từ loài Uvaria nghiên cứu Trong đó, hợp chất [(Z)-3-hexenyl-1-O-β-Dglucopyranoside, sakurasosaponin, ardisiacrispin B, cyathoviridine, ()spathulenol, 5β,6β-epoxyalnusane-3α-ol (22E,24R)-ergosta-4,6,8(14),22tetraen-3-one] phân lập lần từ chi Uvaria 3.2 Đã phát cao chiết MeOH từ phần mặt đất loài U grandiflora U cordata thể hoạt tính ức chế in vitro dòng tế bào ung thư thử nghiệm (Hep-G2, KB, LU-1, MKN-7, MDA-MB-231, SW-480) với giá trị IC50 0,62–7,51, 15,63–18,51 µg/mL 3.3 Đã phát cao chiết phân đoạn (n-hexane, CHCl3, EtOAc, n-BuOH) từ phần mặt đất loài U grandiflora có tác dụng ức chế dòng tế bào MDA-MB-231 (IC50: 0,97–22,72 µg/mL) MKN-7 (IC50: 1,31–18,77 µg/mL) phân đoạn CHCl3 n-hexane thể hoạt tính mạnh nhất; cao chiết phân đoạn tương tự từ U cordata thể hoạt tính mạnh dòng tế bào LU-1 MKN-7 (IC50: 0,13–1,09 µg/mL) Footer Page of 148 Header Page of 148 3.4 Đã đánh giá hoạt tính gây độc tế bào in vitro hợp chất phân lập được, hợp chất ()-3-O-debenzoylzeylenone có khả gây độc mạnh 10 dòng tế bào gồm LU-1, KB, Hep-G2, MKN-7, SW-480, HL-60, SKMel-2, HeLa, PANC-1, PSN-1 (IC50: 1,01–3,71 µg/mL), gây độc mức trung bình dòng tế bào khác gồm MDA-MB-231, LNCaP, A549 (IC50: 9,92– 17,81 µg/mL); hợp chất ardisiacrispin B thể hoạt tính gây độc mạnh dòng tế bào gồm LU-1, KB, Hep-G2, MKN-7, SW-480 (IC50: 1,33–1,72 µg/mL), thể hoạt tính trung bình dòng tế bào MDA-MB-231 (IC50 = 12,64 µg/mL) LNCaP (IC50 = 10,43 µg/mL) hợp chất gồm velutinam, (22E,24R)-ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-one, oxoanolobine thể hoạt tính ức chế dòng tế bào LU-1 với giá trị IC50 16,66, 10,21 9,22 µg/mL Bố cục luận án Luận án gồm 157 trang với 40 biểu bảng, 107 hình, 194 tài liệu tham khảo Bố cục luận án gồm: Mở đầu (2 trang), Chương 1: Tổng quan tài liệu (30 trang), Chương 2: Đối tượng phương pháp nghiên cứu (5 trang), Chương 3: Thực nghiệm kết (11 trang), Chương 4: Kết thảo luận (89 trang), Kết luận (2 trang) Kiến nghị (1 trang), Danh mục công trình công bố (1 trang), Tài liệu tham khảo (16 trang) Phụ lục (123 trang) II NỘI DUNG LUẬN ÁN MỞ ĐẦU Phần mở đầu đề cập đến ý nghĩa khoa học, tính cấp thiết thực tiễn, đối tượng, mục tiêu nhiệm vụ nghiên cứu luận án Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu sơ lƣợc họ Na (Annonaceae) 1.2 Giới thiệu chi Bù dẻ (Uvaria) 1.2.1 Đặc điểm thực vật, phân bố công dụng 1.2.2 Các nghiên cứu thành phần hóa học 1.2.3 Các nghiên cứu hoạt tính sinh học 1.3 Giới thiệu sơ lƣợc loài Bù dẻ tía, Bù dẻ lớn Bù dẻ râu Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu Phần mặt đất loài U grandiflora, U cordata U fauveliana 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Phƣơng pháp phân lập, tinh chế hợp chất Footer Page of 148 Header Page of 148 Phối hợp phương pháp sắc ký: Sắc ký mỏng (TLC), sắc ký cột (CC) loại pha tĩnh khác Silica gel pha thường, pha đảo, Sephadex LH-20, nhựa trao đổi ion Diaion HP-20 2.2.2 Phƣơng pháp xác định cấu trúc hóa học hợp chất Cấu trúc hóa học hợp chất thiết lập dựa vào số vật lý (mp, [α]D), kiện phổ (IR, UV, CD, MS, 1D-, 2D-NMR, XRD), chuyển hóa hóa học với việc phân tích, so sánh với tài liệu tham khảo 2.2.3 Phƣơng pháp đánh giá hoạt tính sinh học Hoạt tính gây độc tế bào in vitro thử nghiệm 10 dòng tế bào: HepG2, HL-60, KB, LNCaP, LU-1, MKN-7, MDA-MB-231, SK-Mel-2, SW-480 3T3 theo phương pháp SRB Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Ngoài ra, hoạt tính thử nghiệm dòng tế bào khác gồm A549, HeLa, PANC-1, PSN-1 TIG-3 theo phương pháp WST-8 Viện Y học tự nhiên, Đại học Toyama, Nhật Bản Chƣơng THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1 Xử lý mẫu chuẩn bị cao chiết 3.2 Phân lập hợp chất từ loài Bù dẻ tía Hình 3.2 Sơ đồ phân lập chất từ phân đoạn chloroform phân đoạn nước loài Bù dẻ tía Footer Page of 148 Header Page of 148 3.3 Phân lập hợp chất từ loài Bù dẻ lớn Hình 3.3 Sơ đồ phân lập chất từ phân đoạn chloroform phân đoạn ethyl acetate loài Bù dẻ lớn 3.4 Phân lập hợp chất từ loài Bù dẻ râu Hình 3.4 Sơ đồ phân lập chất từ phân đoạn chloroform phân đoạn ethyl acetate loài Bù dẻ râu Footer Page of 148 Header Page of 148 Ghi chú: Hợp chất UGLE1 phân lập từ phân đoạn ethyl acetate loài Bù dẻ tía 3.5 Tính chất vật lý kiện phổ hợp chất phân lập 3.5.1 Hợp chất UGLE1: ()-3-O-Debenzoylzeylenone (chất mới) Tinh thể không màu; mp 123–124 oC; [ ]D -13,8 (c 0,4, CHCl3); UV (MeOH) λmax 20 (nm): 235, 268; HR-ESI-MS: m/z 301,0679 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho công thức C14H14O6Na 301,0688), 579,1470 [2M+Na] + (tính toán lý thuyết cho công thức C28H28O12Na 579,1478); CTPT C14H14O6; M = 278; 1H-NMR 13C-NMR: xem Bảng 4.2 3.5.2 Hợp chất UGC4: Pipoxide chlorohydrin Chất bột màu trắng; mp 207–208 oC; [ ]D +91,5 (c 0,1, CHCl3); UV (MeOH) λmax 20 (nm): 242, 275; CTPT C21H19ClO6; M = 402,5; 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δH (ppm): 4,35 (d, J = 7,5 Hz, H-2), 5,80 (br.d, J = 7,5 Hz, H-3), 5,88 (dd, J = 10,0, 2,5 Hz, H-4), 6,04 (ddd, J = 10,0, 5,0, 2,0 Hz, H-5), 4,82 (br.d, J = 5,0, H-6), 4,73 (H-7), 8,06 (m, H2′/6′), 7,50 (m, H-3′/5′), 7,61 (m, H-4′), 8,06 (m, H-2″/6″), 7,50 (m, H-3″/5″), 7,61 (m, H4″), 4,59 (br.s, 1-OH); 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δC (ppm): 76,6 (C-1), 70,7 (C-2), 75,3 (C-3), 128,5 (C-4), 129,6 (C-5), 58,6 (C-6), 69,0 (C-7), 131,3 (C-1′), 130,6 (C-2′/6′), 129,5 (C-3′/5′), 134,3 (C-4′), 167,9 (C-7′), 131,3 (C-1″), 130,7 (C-2″/6″), 129,6 (C-3″/5″), 134,3 (C-4″), 168,0 (C-7″) 3.5.3 Hợp chất UGC5: ()-Zeylenone Chất bột màu trắng; mp 156–159 oC; [ ]D -122,2 (c 0,24, CHCl3); UV (MeOH) λmax 20 (nm): 232, 274; ESI-MS: m/z 417,5 [M-H+2H2O]-; CTPT C21H18O7; M = 382; 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δH (ppm): 4,26 (dd, J = 8,5, 6,5 Hz, H-2), 5,98 (ddd, J = 8,5, 2,5, 2,0 Hz, H-3), 7,07 (dd, J = 10,5, 2,0 Hz, H-4), 6,17 (dd, J = 10,5, 2,5 Hz, H-5), 4,36 (d, J = 10,0 Hz, H-7a), 4,57 (d, J = 10,0 Hz, H-7b), 7,91 (dd, J = 8,5, 1,0 Hz, H-2′/6′), 7,54 (m, H-3′/5′), 7,67 (m, H-4′), 8,08 (dd, J = 8,5, 1,0 Hz, H-2″/6″), 7,54 (m, H-3″/5″), 7,67 (m, H4″), 6,33 (s, 1-OH), 6,03 (d, J = 6,5 Hz, 2-OH); 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) δC (ppm): 76,1 (C-1), 71,3 (C-2), 72,3 (C-3), 147,4 (C-4), 127,9 (C-5), 195,1 (C-6), 61,4 (C7), 129,4 (C-1′), 129,1 (C-2′/6′), 128,7 (C-3′/5′), 133,4 (C-4′), 165,0 (C-7′), 129,4 (C-1″), 129,5 (C-2″/6″), 128,7 (C-3″/5″), 133,5 (C-4″), 165,6 (C-7″) 3.5.4 Hợp chất UGC6: ()-Zeylenol Chất bột màu trắng; mp 145–146 oC; [ ]D -117,1 (c 0,05, CHCl3); UV (MeOH) λmax 20 (nm): 232, 273; ESI-MS: m/z 419,4 [M-H+2H2O]-; CTPT C21H20O7; M = 384; 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δH (ppm): 4,26 (d, J = 6,5 Hz, H-2), 5,72 (br.d, J = 6,5 Hz, H-3), 5,84 (dd, J = 10,5, 2,5 Hz, H-4), 5,98 (ddd, J = 10,5, 4,5, 2,0 Hz, H-5), 4,38 (d, J = 4,5 Hz, H6), 4,63 (d, J = 11,5 Hz, H-7a), 4,71 (d, J = 11,5 Hz, H-7b), 8,05 (dd, J = 8,0, 1,0 Hz, H2′/6′), 7,44 (m, H-3′/5′), 7,58 (m, H-4′), 8,02 (dd, J = 8,0, 1,0 Hz, H-2″/6″), 7,44 (m, H3″/5″), 7,58 (m, H-4″); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δC (ppm): 75,9 (C-1), 70,9 (C-2), 74,2 (C-3), 126,8 (C-4), 129,8 (C-5), 68,8 (C-6), 66,7 (C-7), 129,5 (C-1′), 129,8 (C-2′/6′), Footer Page of 148 Header Page of 148 128,4 (C-3′/5′), 133,4 (C-4′), 167,8 (C-7′), 129,3 (C-1″), 129,8 (C-2″/6″), 128,4 (C-3″/5″), 133,4 (C-4″), 167,1 (C-7″) 3.5.5 Hợp chất UGC8: ()-Pipoxide Chất bột màu trắng; mp 155–157 oC; [ ]D +55,7 (c 0,1, CHCl3); UV (MeOH) λmax (nm): 233, 270; CTPT C21H18O6; M = 366; 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δH (ppm): 4,34 (d, J = 8,0 Hz, H-2), 5,63 (ddd, J = 8,0, 2,5, 1,5 Hz, H-3), 5,91 (dt, J = 10,0, 1,5 Hz, H-4), 6,14 (ddd, J = 10,0, 4,0, 2,5 Hz, H-5), 3,66 (dd, J = 4,0, 1,5 Hz, H-6), 4,57 (d, J = 12,0 Hz, H-7a), 4,91 (d, J = 12,0, H-7b), 8,09 (m, H-2′/6′), 7,52 (m, H-3′/5′), 7,64 (m, H-4′), 8,09 (m, H-2″/6″), 7,52 (m, H-3″/5″), 7,64 (m, H-4″); 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δC (ppm): 61,0 (C-1), 71,1 (C-2), 75,8 (C-3), 134,7 (C-4), 125,8(C-5), 55,1 (C-6), 63,7 (C-7), 131,4 (C-1′), 130,7 (C-2′/6′), 129,7 (C-3′/5′), 134,5 (C-4′), 167,7 (C-7′), 131,0 (C-1″), 130,7 (C2″/6″), 129,6 (C-3″/5″), 134,4 (C-4″), 167,5 (C-7″) 20 3.5.6 Hợp chất UGC9: Lupeol Chất bột màu trắng; mp 214–217 oC; [ ]D +28,7 (c 0,1, CHCl3); APCI-MS: m/z 20 409,1 [M+H-H2O]+; CTPT C30H50O; M = 426; 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δH (ppm): 3,18 (dd, J = 11,5, 5,0 Hz, H-3), 0,68 (m, H-5), 2,37 (m, H-19), 0,96 (s, H-23), 0,76 (s, H24), 0,83 (s, H-25), 1,03 (s, H-26), 0,94 (s, H-27), 0,79 (s, H-28), 4,56 (br.s, H-29a), 4,68 (br.s, H-29b), 1,68 (s, H-30); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δC (ppm): 38,7 (C-1), 27,4 (C2), 78,9 (C-3), 38,8 (C-4), 55,3 (C-5), 18,3 (C-6), 34,3 (C-7), 40,8 (C-8), 50,4 (C-9), 37,2 (C-10), 20,9 (C-11), 25,1 (C-12), 38,1 (C-13), 42,8 (C-14), 27,4 (C-15), 35,6 (C-16), 43,0 (C-17), 48,3 (C-18), 48,0 (C-19), 150,9 (C-20), 29,8 (C-21), 40,0 (C-22), 28,0 (C-23), 15,4 (C-24), 16,1 (C-25), 16,0 (C-26), 14,5 (C-27), 18,0 (C-28), 109,3 (C-29), 19,3 (C-30) 3.5.7 Hợp chất UGW1: Sakurasosaponin Chất bột màu trắng; mp 267–269 oC; [ ]D -35,8 (c 0,19, CH3OH); CTPT C60H98O27; 20 M = 1250; 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δH (ppm): 0,99 (H-1a), 1,78 (H-1b), 1,76 (m, H2a), 1,91 (m, H-2b), 3,22 (dd, J = 12,0, 4,5 Hz, H-3), 0,75 (d, J = 11,5 Hz, H-5), 1,47 (H6a), 1,54 (H-6b), 1,25 (H-7a), 1,56 (H-7b), 1,30 (H-9), 1,51 (H-11a), 1,63 (dd, J = 13,0, 4,5 Hz, H-11b), 1,54 (H-12a), 1,80 (H-12b), 1,25 (H-15a), 2,14 (H-15b), 3,91 (H-16), 1,53 (H-18), 1,22 (H-19a), 2,40 (t, J = 13,0 Hz H-19b), 1,20 (H-21a), 2,11 (H-21b), 1,31 (H22a), 2,07 (H-22b), 1,09 (s, H-23), 0,89 (s, H-24), 0,92 (s, H-25), 1,17 (s, H-26), 1,25 (s, H-27), 3,14 (d, J = 7,5 Hz, H-28a), 3,52 (d, J = 7,5 Hz, H-28b), 0,97 (s, H-29), 0,93 (s, H30), 4,52 (d, J = 8,0 Hz, H-1′), 3,96 (dd, J = 8,0, 9,0 Hz, H-2′), 4,08 (t, J = 9,0 Hz, H-3′), 3,64 (t, J = 9,0 Hz, H-4′), 3,83 (H-5′), 4,87 (H-1′′), 3,22 (t, J = 9,0 Hz, H-2′′), 3,38 (H-3′′), 3,09 (t, J = 9,0 Hz, H-4′′), 3,42 (H- C-5′′), 3,54 (H-6′′a), 3,90 (H-6′′b), 5,19 (d, J = 7,5 Hz, H-1′′′), 3,78 (H-2′′′), 3,82 (H-3′′′), 3,76 (H-4′′′), 3,56 (H-5′′′), 3,69 (H-6′′′a), 3,83 (H-6′′′b), 5,43 (s, H-1′′′′), 3,96 (H-2′′′′), 3,82 (H-3′′′′), 3,40 (H-4′′′′), 4,10 (H-5′′′′), 1,29 (d, J = 6,0 Hz, H-6′′′′), 4,99 (s, H-1′′′′′), 4,00 (dd, J = 3,0, 1,5 Hz, H-2′′′′′), 3,71 (H-3′′′′′), 3,40 (H-4′′′′′), 3,73 (H-5′′′′′), 1,29 (d, J = 6,0 Hz, H-6′′′′′); 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δC (ppm): 40,22 (C-1), 27,14 (C-2), 92,27 (C-3), 40,68 (C-4), 56,79 (C-5), 18,72 (C-6), 35,18 (C-7), 43,27 (C-8), 51,36 (C-9), 37,82 (C-10), 19,84 (C-11), 32,13 (C-12), 88,37 (C-13), 45,37 (C-14), 37,07 (C-15), 77,93 (C-16), 45,29 (C-17), 52,35 (C-18), 39,82 (C-19), 32,39 (C-20), 37,37 Footer Page of 148 Header Page 10 of 148 (C-21), 33,32 (C-22), 28,31 (C-23), 16,75 (C-24), 16,75 (C-25), 18,80 (C-26), 19,95 (C27), 78,73 (C-28), 33,89 (C-29), 24,95 (C-30), 105,77 (C-1′), 79,03 (C-2′), 81,06 (C-3′), 71,71 (C-4′), 76,61 (C-5′), 172 (C-6′), 102,64 (C-1′′), 76,06 (C-2′′), 78,08 (C-3′′), 72,54 (C-4′′), 78,16 (C-5′′), 63,54 (C-6′′), 100,85 (C-1′′′), 75,85 (C-2′′′), 76,06 (C-3′′′), 71,66 (C4′′′), 76,93 (C-5′′′), 62,78 (C-6′′′), 100,92 (C-1′′′′), 79,78 (C-2′′′′), 72,15 (C-3′′′′), 74,13 (C4′′′′), 70,26 (C-5′′′′), 17,95 (C-6′′′′), 103,81 (C-1′′′′′), 72,02 (C-2′′′′′), 72,30 (C-3′′′′′), 74,06 (C-4′′′′′), 70,19 (C-5′′′′′), 17,89 (C-6′′′′′) 3.5.8 Hợp chất UGW2: Ardisiacrispin B Chất bột màu trắng; mp 245–247 oC; CTPT C53H86O22; M = 1074; 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δH (ppm): 0,98 (H-1a), 1,78 (H-1b), 1,75 (H-2a), 1,89 (H-2b), 3,16 (dd, J = 11,5, 4,5 Hz, H-3), 0,75 (d, J = 11,5 Hz, H-5), 1,45 (H-6a), 1,54 (H-6b), 1,23 (H-7a), 1,58 (H7b), 1,27 (H-9), 1,52 (H-11a), 1,63 (H-11b), 1,29 (H-12a), 2,14 (H-12b), 1,25 (H-15a), 2,10 (H-15b), 3,95 (H-16), 1,12 (H-18), 2,53 (t, J = 13,0 Hz, H-19), 1,99 (d, J = 11,5 Hz, H-19), 1,93 (H-21a), 2,17 (H-21b), 1,39 (dt, J = 13,5, 5,5 Hz, H-22a), 1,85 (H-22b), 1,07 (s, H-23), 0,85 (s, H-24), 0,92 (s, H-25), 1,16 (s, H-26), 1,30 (s, H-27), 3,01 (d, J = 7,5 Hz, H-28a), 3,51 (d, J = 7,5 Hz, H-28b), 1,00 (s, H-29), 9,43 (s, H-30), 4,52 (d, J = 4,5 Hz, H1′), 3,87 (H-2′), 3,89 (H-3′), 4,06 (s, H-4′), 4,08 (d, J = 10,0 Hz, H-5′), 3,58 (d, J = 10,0 Hz, H-5′), 4,62 (d, J = 7,5 Hz, H-1′′), 3,47 (H-2′′), 3,45 (H-3′′), 3,31 (H-4′′), 3,28 (H-5′′), 3,68 (H-6′′a), 3,87 (H-6′′b), 5,29 (s, H-1′′′), 3,96 (H-2′′′), 3,78 (dd, J = 9,5, 3,0 Hz, H-3′′′), 3,40 (H-4′′′), 4,14 (H-5′′′), 1,32 (d, J = 6,0 Hz, H-6′′′), 4,64 (d, J = 8,0 Hz, H-1′′′′), 3,21 (dd, J = 9,5, 8,0 Hz, H-2′′′′), 3,42 (H-3′′′′), 3,31 (H-4′′′′), 3,33 (H-5′′′′), 3,68 (H-6′′′′a), 3,87 (H6′′′′b); 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δC (ppm): 40,21(C-1), 27,19 (C-2), 90,93 (C-3), 40,43 (C-4), 56,79 (C-5), 18,76 (C-6), 35,12 (C-7), 43,40 (C-8), 51,34 (C-9), 37,83 (C-10), 19,79 (C-11), 33,18 (C-12), 88,17 (C-13), 45,34 (C-14), 37,03 (C-15), 77,87 (C-16), 44,75 (C-17), 53,98 (C-18), 33,99 (C-19), 49,63 (C-20), 30,97 (C-21), 32,77 (C-22), 28,55 (C23), 16,76 (C-24), 16,70 (C-25), 18,80 (C-26), 20,12 (C-27), 78,45 (C-28), 24,28 (C-29), 209,27 (C-30), 105,12 (C-1′), 79,61 (C-2′), 72,70 (C-3′), 76,53 (C-4′), 64,80 (C-5′), 103,89 (C-1′′), 79,03 (C-2′′), 78,84 (C-3′′), 71,62 (C-4′′), 77,62 (C-5′′), 62,76 (C-6′′), 101,83 (C1′′′), 72,05 (C-2′′′), 72,20 (C-3′′′), 74,42 (C-4′′′), 70,31 (C-5′′′), 18,27 (C-6′′′), 104,59 (C1′′′′), 76,36 (C-2′′′′), 77,87 (C-3′′′′), 71,84 (C-4′′′′), 77,87 (C-5′′′′), 62,80 (C-6′′′′) 3.5.9 Hợp chất UGLW1: (Z)-3-Hexenyl-1-O-β-D-glucopyranoside Chất dầu không màu; [ ]D -35,0 (c 0,6, CH3OH); ESI-MS: m/z 263,4 [M+H]+, 20 297,3 [M-H+2H2O]-; CTPT C12H22O6; M = 262; 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δH (ppm): 3,56 (td, J = 9,5, 7,5 Hz, H-1a), 3,90 (H-1b), 2,40 (dt, J = 7,5, 7,5 Hz, H-2), 5,41 (m, H-3), 5,47 (m, H-4), 2,10 (dq, J = 7,5, 7,5 Hz, H-5), 0,99 (t, J = 7,5 Hz, H-6), 4,29 (d, J = 7,5 Hz, H-1′), 3,19 (dd, J = 8,0, 7,5 Hz, H-2′), 3,38 (t, J = 8,0 Hz, H-3′), 3,32 (H-4′), 3,30 (H-5′), 3,69 (dd, J = 12,0, 5,5 Hz, H-6′a), 3,87 (H-6′b); 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δC (ppm): 70,4 (C-1), 28,8 (C-2), 125,8 (C-3), 134,5 (C-4), 21,5 (C-5), 14,6 (C-6), 104,3 (C-1′), 75,1 (C-2′), 78,1 (C-3′), 71,6 (C-4′), 77,9 (C-5′), 62,7 (C-6′) 3.5.10 Hợp chất UGLW3: Grandionoside A (chất mới) Chất bột màu trắng; [ ]D -20,8 (c 0,1, MeOH); HR-ESI-MS: m/z 411,1989 [M+Na]+ 20 (tính toán lý thuyết cho công thức C19H32O8Na 411,1995), 799,4064 [2M+Na] + (tính Footer Page 10 of 148 Header Page 14 of 148 3.5.23 Hợp chất UFE4A: Daucosterol Chất bột màu trắng; mp 283–286 oC; CTPT C35H60O6; M = 576; 1H-NMR (500 MHz, CDCl3 & CD3OD) δH (ppm): 3,58 (m, H-3), 2,26 (m, H-4a), 2,40 (m, H-4b), 5,37 (br.s, H6), 0,68 (s, H-18), 1,01 (s, H-19), 0,92 (d, J = 6,5 Hz, H-21), 0,83 (H-26), 0,82 (H-27), 0,85(H-29), 4,41 (d, J = 8,0 Hz, H-1), 3,28 (m, H-2), 3,45 (H-3), 3,47 (H-4), 3,31 (m, H-5), 3,77 (dd, J = 12,0, 4,5 Hz, H-6a), 3,84 (dd, J = 12,0, 3,0 Hz, H-6b); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3 & CD3OD) δC (ppm): 37,4 (C-1), 29,7 (C-2), 79,3 (C-3), 38,8 (C-4), 140,4 (C-5), 122,3 (C-6), 32,0 (C-7), 32,1 (C-8), 50,3 (C-9), 36,9 (C-10), 21,2 (C-11), 39,9 (C-12), 42,5 (C-13), 56,9 (C-14), 24,4 (C-15), 28,4 (C-16), 56,2 (C-17), 11,9 (C-18) 3.5.24 Hợp chất UFE5B: Ufaside (Chất mới) Chất bột không màu; IR (KBr) νmax: 3356 (OH), 2947 (CH), 1659, 1435 (vòng thơm), 1033 cm-1; UV (MeOH) λmax (nm): 207, 236, 273; HR-ESI-MS: m/z 591,2437 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho công thức C28H40O12Na 591,2417), 1159,4928 [2M+Na] + (tính toán lý thuyết cho công thức C56H80O24Na 1159,4937); CTPT C28H40O12; M = 568; 1HNMR (500 MHz, CD3OD) δH (ppm): 6,30 (s, H-2/6), 2,60 (dd, J = 13,5, 8,5 Hz, H-7a), 2,66 (dd, J = 13,5, 6,5 Hz, H-7b), 2,11 (m, H-8), 3,39 (dd, J = 10,0, 6,5 Hz, H-9a), 3,84 (dd, J = 10,0, 6,0 Hz, H-9b), 6,32 (s, H-2/6), 2,54 (dd, J = 13,5, 9,0 Hz, H-7a), 2,75 (dd, J = 13,5, 6,0 Hz, H-7b), 1,95 (m, H-8), 3,52 (dd, J = 11,0, 7,5 Hz, H-9a), 3,77 (H-9b), 4,69 (br.s, H-1″), 3,86 (dd, J = 3,5, 1,5 Hz, H-2″), 3,72 (dd, J = 10,0, 3,5 Hz, H-3″), 3,41 (dd, J = 10,0, 9,0 Hz, H-4″), 3,67 (m, H-5″), 1,28 (d J = 6,0 Hz, H-6″), 3,76 (s, 3/5-OMe), 3,77 (s, 3′/5′-OMe); 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δC (ppm): 132,8 (C-1), 107,1 (C-2), 149,0 (C-3), 134,4 (C-4), 149,0 (C-5), 107,1 (C-6), 36,8 (C-7), 40,9 (C-8), 69,5 (C-9), 133,0 (C-1′), 107,2 (C-2′), 149,0 (C-3′), 134,5 (C-4′), 149,0 (C-5′), 107,2 (C-6′), 36,5 (C7′), 44,2 (C-8′), 62,9 (C-9′), 102,3 (C-1″), 72,4 (C-2″), 72,6 (C-3″), 73,9 (C-4″), 70,2 (C5″), 18,0 (C-6″), 56,6 (3/5-OMe), 56,7 (3′/5′-OMe) 3.5.25 Hợp chất UFE7A: Catechin Chất bột màu nâu nhạt; mp 175–177 oC; CTPT C15H14O6; M = 290; 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δH (ppm): 4,58 (d, J = 7,5 Hz, H-2), 3,99 (ddd, J = 8,0, 7,5, 5,5 Hz, H-3), 2,53 (dd, J = 16,0, 8,0 Hz, H-4a), 2,87 (dd, J = 16,0, 5,5 Hz, H-4b), 5,95 (d, J = 2,0 Hz, H6), 5,88 (d, J = 2,0 Hz, H-8), 6,86 (d, J = 2,0 Hz, H-2), 6,78 (d, J = 8,0 Hz, H-5), 6,74 (dd, J = 8,0, 2,0 Hz, H-6); 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δC (ppm): 82,9 (C-2), 68,8 (C3), 28,5 (C-4), 157,6 (C-5), 96,3 (C-6), 157,8 (C-7), 95,5 (C-8), 156,9 (C-9), 100,8 (C-10), 132,2 (C-1′), 115,3 (C-2′), 146,3 (C-3′), 146,2 (C-4′), 116,1 (C-5′), 120,0 (C-6′) 3.6 Hoạt tính sinh học cao chiết chất tinh khiết từ loài Bù dẻ tía, Bù dẻ lớn Bù dẻ râu Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào in vitro cao chiết từ loài Bù dẻ tía, Bù dẻ lớn Bù dẻ râu Hoạt tính gây độc tế bào in vitro cao chiết MeOH từ phần mặt đất loài Bù dẻ tía, Bù dẻ râu, thân loài Bù dẻ lớn thử nghiệm Footer Page 14 of 148 12 Header Page 15 of 148 dòng tế bào ung thư (MDA-MB-231, LU-1, KB, Hep-G2, MKN-7 SW-480) Kết thử nghiệm thể Bảng 4.1 Bảng 4.1 Kết sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào in vitro cao chiết từ loài Bù dẻ tía, Bù dẻ lớn Bù dẻ râu IC50 (μg/mL) Loài Bù dẻ tía Bù dẻ lớn Bù dẻ râu Cao chiết Ug−M Ug−H Ug−C Ug−E Ug−B Ug−W UcT−M UcL−M UcL−H UcL−C UcL−E UcL−B UcL−W Uf−M Ellipticine MDAMB-231 0,62 3,27 0,97 8,44 22,72 60,92 41,96 17,82 37,75 1,67 LU-1 KB Hep-G2 MKN-7 SW-480 6,86 1,67 7,51 4,15 37,77 15,88 0,52 0,85 0,20 1,02 46,69 21,54 1,73 43,58 15,96 27,41 18,51 47,47 1,65 69,04 1,64 0,89 3,42 1,31 8,08 18,77 52,48 26,37 15,63 0,71 0,83 0,13 1,09 44,41 25,72 1,54 31,37 17,01 29,52 1,26 Ug: Uvaria grandiflora, Uc: Uvaria cordata, Uf: Uvaria fauveliana, L: lá, T: thân M: Methanol, H: n-Hexane, C: Chloroform, E: Ethyl acetate, B: n-Butanol, W: Nước 4.2 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất đƣợc phân lập từ loài Bù dẻ tía, Bù dẻ lớn Bù dẻ râu Bằng cách kết hợp phương pháp sắc ký, tổng cộng có 25 hợp chất phân lập xác định cấu trúc từ loài Bù dẻ tía (10 hợp chất), Bù dẻ lớn (9 hợp chất) Bù dẻ râu (6 hợp chất) bao gồm: terpenoid (UGC9, UCC11, UCC12, UCE3BII, UCE4I, UFC1), hợp chất đa oxy hóa cyclohexene (UGC4, UGC5, UGC6, UGC8, UGLE1), steroid (UCC10, UFC3B1, UFE4A), alkaloid (UCE8, UCE9, UFE3A), glycoside (UGLW1, UGLW3, UFE5B), saponin triterpenoid (UGW1, UGW2), flavonoid (UFE7A), hợp chất thơm (UCC5, UCC6) Đặc biệt, bốn hợp chất UGLE1, UGLW3, UCC5 UFE5B chất nhiều hợp chất phân lập lần từ chi Uvaria (UGW1, UGW2, UGLW1, UCC6, UCC11, UCC12 UFC3B1) Cấu trúc hóa học chúng Hình 4.1–4.3 Footer Page 15 of 148 13 Header Page 16 of 148 Hình 4.1 Cấu trúc hóa học hợp chất phân lập từ phần mặt đất loài Bù dẻ tía Hình 4.2 Cấu trúc hóa học hợp chất phân lập từ Bù dẻ lớn Hình 4.3 Cấu trúc hóa học hợp chất phân lập từ phần mặt đất loài Bù dẻ râu Footer Page 16 of 148 14 Header Page 17 of 148 Bảng 4.32 Thống kê hợp chất phân lập từ loài Bù dẻ tía, Bù dẻ lớn Bù dẻ râu STT Ký hiệu Hợp chất Lớp chất UGLE1 UGC4 UGC5 UGC6 UGC8 UGC9 UGW1 UGW2 UGLW1 PC PC PC PC PC Triterpenoid Saponin Saponin Hexenyl glycoside 10 UGLW3 ()-3-O-Debenzoylzeylenone Pipoxide chlorohydrin ()-Zeylenone ()-Zeylenol ()-Pipoxide Lupeol Sakurasosaponin Ardisiacrispin B (Z)-3-Hexenyl-1-O-β-Dglucopyranoside Grandionoside A 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 UCC5 UCC6 UCC10 UCC11 UCC12 UCE3BII UCE4I UCE8 UCE9 UFC1 UFC3B1 22 23 24 25 UFE3A UFE4A UFE5B UFE7A Cordauvarin A Cyathoviridine β-Sitosterol palmitate ()-Spathulenol 5,6-Epoxyalnusane-3-ol Glutin-5-en-3α-ol Taraxerol Velutinam Aristolactam A Ia 5-Glutinen-3-one (22E,24R)-Ergosta-4,6,8(14),22tetraen-3-one Oxoanolobine Daucosterol Ufaside Catechin Megastigmane glycoside Hợp chất thơm Hợp chất thơm Steroid Sesquiterpenoid Triterpenoid Triterpenoid Triterpenoid Alkaloid Alkaloid Triterpenoid Steroid Alkaloid Steroid Lignan glycoside Flavonoid Tính Mới # # # Mới Mới # # # # Mới PC (polyoxygenated cyclohexene): Hợp chất đa oxy hóa cyclohexene, #phân lập lần từ chi Uvaria  Dưới trình bày chi tiết phương pháp xác định cấu trúc hóa học hợp chất từ loài Bù dẻ tía: 4.2.1 Hợp chất UGLE1: ()-3-O-Debenzoylzeylenone Hợp chất UGLE1 tách dạng tinh thể không màu, mp 123–124 oC, [ ]20 D -13,8 (c 0,4, CHCl3) Phổ UV (MeOH) (Hình 4.6) đề nghị có mặt nhân thơm (λmax 268 nm) enone (λmax 235 nm) Píc ion giả phân tử m/z 301,0679 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho công thức C14H14O6Na 301,0688) Footer Page 17 of 148 15 Header Page 18 of 148 phổ HR-ESI-MS (Hình 4.7) cho phép xác định CTPT hợp chất UGLE1 C14H14O6 Phổ 1H-NMR (CDCl3) (Hình 4.8) hợp chất tín hiệu đặc trưng proton thơm δH 7,41–7,95 (5H), proton olefin [δH 6,14 (dd, J = 10,5, 2,0 Hz, H-5) 6,91 (dd, J = 10,5, 3,5 Hz, H-4)], proton nhóm oxymethylene [δH 4,60 (d, J = 11,5 Hz, H-7a) 4,78 (d, J = 11,5 Hz, H-7b) proton nhóm oxymethine [δH 3,98 (d, J = 5,5 Hz, H-2) 4,69 (m, H-3)] Phổ 13C-NMR (Hình 4.10), DEPT (Hình 4.11) HSQC (Hình 4.12) 14 tín hiệu gồm carbon carbonyl (δC 195,4, 166,9), carbon thơm (δC 128,5, 129,1, 129,9, 133,6), carbon olefin (δC 126,9, 148,2), carbon nhóm oxymethylene (δC 64,1), carbon nhóm oxymethine (δC 68,1, 74,2) carbon bậc bốn gắn với oxy (δC 76,3) Tín hiệu proton thơm δH 7,41 (t, J = 8,0 Hz, H2-3′/5′), 7,56 (tt, J = 8,0, 1,0 Hz, H-4′) 7,95 (dd, J = 8,0, 1,0 Hz, H2-2′/6′) với tương tác HMBC (Hình 4.5) H2-2′/6′ (δH 7,95) C-7′ (δC 166,9) đề nghị diện hợp phần benzoyl Mặt khác, tương tác 1H−1H COSY H-3 (δH 4,69) H-2 (δH 3,98)/H-4 (δH 6,91), H-4 (δH 6,91) H-5 (δH 6,14) tương tác HMBC H-2 (δH 3,98) C-3 (δC 68,1)/C-4 (δC 148,2)/C-6 (δC 195,4), H4 (δH 6,91) C-2 (δC 74,2)/C-6 (δC 195,4), H-5 (δH 6,14) C-1 (δC 76,3)/C3 (δC 68,1) chứng tỏ hợp chất UGLE1 sở hữu hợp phần trioxycyclohexenone với nối đôi C-4/C-5 nhóm ketone C-6 Phân tích chi tiết phổ HSQC, HMBC (Hình 4.13) COSY (Hình 4.14) cho thấy proton nhóm oxymethylene H7a (δH 4,60) H-7b (δH 4,78) tương tác với C-1 (δC 76,3)/C-2 (δC 74,2)/C-6 (δC 195,4)/C-7′ (δC 166,9) Dữ kiện chứng tỏ C-1 nhóm benzoyloxy liên kết trực tiếp với C-7 Hình 4.4 Cấu trúc hóa học hợp chất UGLE1 hợp chất tham khảo Footer Page 18 of 148 16 Header Page 19 of 148 Bảng 4.2 Số liệu phổ NMR hợp chất UGLE1 hợp chất tham khảo C δC#, a 76,3 74,0 68,0 147,9 129,0 195,2 64,1 δCa, b 76,3 74,2 68,1 148,2 126,9* 195,4 64,1 DEPT C CH CH CH CH C CH2 1′ 2′/6′ 3′/5′ 4′ 7′ 126,9 129,9 128,5 133,6 166,9 129,1* 129,9 128,5 133,6 166,9 C CH CH CH C δHa, c (J, Hz)  3,98 d (5,5) 4,69 m 6,91 dd (10,5, 3,5) 6,14 dd (10,5, 2,0)  4,60 d (11,5) 4,78 d (11,5)  7,95 dd (8,0, 1,0) 7,41 t (8,0) 7,56 tt (8,0, 1,0)  HMBC (H→C) − 3, 4, 2, 2, 1, − 1, 2, 6, 7′ 1, 2, 6, 7′ C ()-3-O-debenzoylzeylenone [157], *giá trị gán lại phổ 2D-NMR, ađo CDCl3, b125 MHz, 500 MHz # c Cấu hình tương đối hợp chất UGLE1 xác định qua phân tích số tương tác kiện phổ NOESY (Hình 4.15) Cụ thể, số tương tác H-2 (δH 3,98) H-3 (δH 4,69) (J2,3 = 5,5 Hz) đề nghị quan hệ axial/pseudoaxial chúng quan hệ 2,3-anti-dihydroxy [126] Trên phổ NOESY, tương tác mạnh H-2 (δH 3,98) H-7a (δH 4,60)/H-7b (δH 4,78) thiếu vắng tương tác H-2 (δH 3,98) H-3 (δH 4,69), H-3 (δH 4,69) H7a (δH 4,60)/H-7b (δH 4,78) khẳng định có mặt nhóm 1,2-syn-dihydroxy Hình 4.5 Tương tác HMBC, COSY NOESY hợp chất UGLE1 Hình 4.17 Cấu trúc nhiễu xạ tia X hợp chất UGLE1 Các kiện phổ (UV, MS, NMR) xác nhận hợp chất UGLE1 có cấu trúc phẳng cấu hình tương đối hoàn toàn giống với hợp chất ()-3-Odebenzoylzeylenone, tách từ loài U purpurea [157] Mặt khác, suất quay cực hợp chất UGLE1 ( [ ]D -13,8 (c 0,4, CHCl3)) ngược dấu với hợp 20 Footer Page 19 of 148 17 Header Page 20 of 148 chất ()-3-O-debenzoylzeylenone ( [ ]D +11,7 (c 0,36, CHCl3) [157], [ ]D +12,5 (c 0,4, CHCl3) [126]) Hơn nữa, phổ CD hợp chất UGLE1 (Hình 4.16) hiệu ứng Cotton âm  233 nm ([] -10433) tương tự hợp chất ()-zeylenone [(1S,2S,3R)-1,2-dihydroxy-3-benzoyloxy-6-oxocyclohex-4-en-1-ylmethyl benzoate] [156] gợi ý hai hợp chất có cấu hình tuyệt đối giống Do vậy, hợp chất UGLE1 xác định đối quang ()-3-Odebenzoylzeylenone với danh pháp khoa học (1S,2S,3R)-1,2,3-trihydroxy-6oxocyclohex-4-en-1-ylmethyl benzoate Sau cùng, cấu trúc hóa học hợp chất UGLE1 xác nhận lại cách chắn phương pháp nhiễu xạ tia X (Hình 4.17) (Phụ lục 2) 4.2.2 Hợp chất UGLW3: Grandionoside A Hình 4.34 Cấu trúc hóa học hợp chất UGLW3 hợp chất tham khảo Hợp chất UGLW3 tách dạng chất bột màu trắng, [ ]20 D -20,8 (c 0,1, MeOH) Trên phổ HR-ESI-MS (Hình 4.35), píc ion giả phân tử ghi nhận m/z 411,1989 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho công thức C19H32O8Na 411,1995) Do vậy, công thức phân tử hợp chất UGLW3 xác định C19H32O8 Phổ 1H-NMR (Hình 4.36) UGLW3 tín hiệu đặc trưng sau: nhóm methyl δH 0,83 (3H, s), 1,13 (3H, s), 2,29 (3H, s) 0,99 (3H, d, J = 6,5 Hz); proton anomer δH 4,39 (1H, d, J = 8,0 Hz); proton trans-olefin δH 6,07 (1H, d, J = 16,0 Hz) 6,71 (1H, dd, J = 16,0, 10,0 Hz) Phổ 13C-NMR (Hình 4.39) DEPT (Hình 4.40) tín hiệu 19 carbon 13 carbon gán cho aglycone carbon gán cho hexose Phần aglycone hợp chất UGLW3 gồm nhóm methyl (δC 17,1, 24,0, 26,9 32,2), nhóm methylene (δC 45,2), nhóm methine (δC 32,5 58,4), nhóm oxymethine (δC 70,1 88,1), nối đôi (δC 134,3 151,1), carbon bậc bốn (δC 34,3) nhóm carbonyl (δC 201,0) Các tín hiệu carbon khác δC 105,8, 75,3, 78,0, 71,3, 77,7 Footer Page 20 of 148 18 Header Page 21 of 148 62,4 đề nghị có mặt đơn vị β-D-glucopyranosyl [141] Việc xác định đường tiếp tục thực sau: Hợp chất UGLW3 (1,0 mg) hòa tan hỗn hợp H2SO4 5%/1,4-dioxane (1:1, v/v, 1,0 mL) Dung dịch đun nóng 90 oC Sau chiết với EtOAc, lớp nước trung hòa Amberlite IRA-400 cô đặc áp suất thấp Phần cắn hòa tan pyridine (0,1 mL) bổ sung L-cysteine methyl ester hydrochloride (0,5 mg) đun nóng 60 oC Thêm dung dịch o-tolylisothiocyanate (0,5 mg) pyridine (0,1 mL) vào dung dịch tiếp tục đun nóng 60 oC Hỗn hợp phản ứng phân tích HPLC [159] Tiến hành phân tích tương tự cho mẫu D-glucose L-glucose chuẩn Bằng cách so sánh thời gian lưu dẫn xuất tolylthiocarbamoyl thiazolidine mẫu phân tích (tR = 32,8 phút) với mẫu chuẩn [tR = 32,8 phút (D-glucose), 29,5 phút (L-glucose)], phần đường hợp chất UGLW3 xác định D-glucose (Hình 4.49) Nhìn chung, kiện phổ 1DNMR đề nghị hợp chất UGLW3 megastigmane glucopyranoside Hình 4.49 Sắc ký đồ HPLC dẫn xuất tolylthiocarbamoyl thiazolidine D-glucose, L-glucose phần đường hợp chất UGLW3 Footer Page 21 of 148 19 Header Page 22 of 148 Tương tác COSY H-2 (δH 1,54 1,79)/H-3 (δH 4,23)/H-4 (δH 3,25)/H-5 (δH 2,13)/H-6 (δH 1,79)/H-7 (δH 6,71)/H-8 (δH 6,07) cho phép thiết lập trật tự liên kết C-2/C-3/C-4/C-5/C-6/C-7/C-8 Các tương tác HMBC H-7 (δH 6,71)/H-8 (δH 6,07)/H-10 (δH 2,29) C-9 (δC 201,0), H-6 (δH 1,79)/C-8 (δC 134,3) tương tác COSY H-6 (δH 1,79)/H-7 (δH 6,71) xác nhận nhánh but-3-one-1enyl C-6 Tương tác HMBC H-11 (δH 1,13)/H-12 (δH 0,83) C-1 (δC 34,3)/C-2 (δC 45,2)/C-6 (δC 58,4) chứng tỏ nhóm methyl (C-11, C-12) định vị C-1 Tương tác HMBC H-13 (δH 0,99) C-4 (δC 88,1)/C-5 (δC 32,5)/C-6 (δC 58,4) tương tác COSY H-13 (δH 0,99)/H-5 (δH 2,13) chứng tỏ nhóm methyl lại (C-13) định vị C-5 Đặc biệt, tương tác HMBC H-1′ (δH 4,39)/C-4 (δC 88,1) đề nghị phần β-D-glucopyranosyl C-4 aglycone (Hình 4.50) Hình 4.50 Tương tác HMBC, COSY NOESY hợp chất UGLW3 Hóa lập thể hợp chất UGLW3 xác định dựa vào việc phân tích phổ NOESY số tương tác J Các kiện phổ 1H-NMR NOESY (Hình 4.47) xác nhận hợp chất tồn cấu dạng ghế (Hình 4.50) Giá trị số tương tác nhỏ H-2 (δH 1,54, 1,79) H-3 (δH 4,23) (J2a,3 = 3,5 Hz, J2e,3 = 3,0 Hz), H-3 (δH 4,23) H-4 (δH 3,25) (J3,4 = 3,5 Hz) vắng mặt tương tác NOESY H-3 (δH 4,23) H-11 (δH 1,13)/H-12 (δH 0,83) chứng tỏ H-3 định hướng equatorial Trên phổ NOESY, H-5 (δH 2,13) có tương tác mạnh với H-11 (δH 1,13) không tương tác với H-12 (δH 0,83) chứng tỏ H-5 C-11 định hướng axial Tương tác NOESY mạnh H-7 (δH 6,71) H-11 (δH 1,13) khẳng định C-7 định hướng equatorial Đặc biệt, tương tác NOESY H-4 (δH 3,25) với H-3e (δH 4,23), H-6a (δH 1,79), H-13 (δH 0,99) số tương tác (J3e,4 = 3,5 Hz, J4,5a = 11,0 Hz) xác nhận định hướng axial H-4 Footer Page 22 of 148 20 Header Page 23 of 148 Bảng 4.16 Số liệu phổ NMR hợp chất UGLW3 hợp chất tham khảo C δ C# 34,5 41,8 δCa, b 34,3 45,2 DEPT C CH2 10 11 12 13 1′ 2′ 3′ 4′ 5′ 6′ 68,5 80,7 30,7 52,6 152,8 134,2 201,1 26,8 24,0 32,3 17,5 102,8 75,0 78,3 71,9 78,0 63,0 70,1 88,1 32,5 58,4 151,1 134,3 201,0 26,9 24,0 32,2 17,1 105,8 75,3 78,0 71,3 77,7 62,4 CH CH CH CH CH CH C CH3 CH3 CH3 CH3 CH CH CH CH CH CH2 δHa, c (J, Hz)  1,54 dd (15,0, 3,5) (H2a) 1,79* (H-2e) 4,23 ddd (3,5, 3,5, 3,0) 3,25 dd (11,0, 3,5) 2,13 m 1,79* 6,71 dd (16,0, 10,0) 6,07 d (16,0)  2,29 s 1,13 s (H-11a) 0,83 s (H-12e) 0,99 d (6,5) 4,39 d (8,0) 3,29* 3,38* 3,38* 3,29* 3,71 dd (12,0, 5,0) 3,84 dd (12,0, 2,5) HMBC (HC)  1, 4, 11 1, 3, 4, 6, 11, 12 1, 5, 13, 1′ 1, 2, 5, 7, 8, 11, 12 5, 6, 6, 9, 10  7, 8, 1, 2, 6, 12 1, 2, 6, 11 4, 5, C lasianthionoside C [155], ađo CD3OD, b125 MHz, c500 MHz, *tín hiệu chập # Các kiện phổ (NMR, MS) hợp chất UGLW3 nhìn chung tương tự phổ công bố hợp chất lasianthionoside C [(3S,4S,5S,6S,7E)-3,4dihydroxymegastigman-7-en-9-one-4-O-β-D-glucopyranoside] [155] Tuy nhiên, cấu hình tuyệt đối C-4 xác định R độ dịch chuyển hóa học C-4 (δC 88,1) số tương tác H-4 (J = 3,5, 11,0 Hz) hợp chất UGLW3 khác biệt rõ rệt so với giá trị tương ứng hợp chất lasianthionoside C [C-4 (C 80,7), H-4 (br.s)] Ngoài ra, thay đổi mạnh độ dịch chuyển hóa học C-6 (δC 58,4), C-1 (δC 105,8) hợp chất UGLW3 so với giá trị tương ứng lasianthionoside C [C-6 (δC 52,6), C-1 (δC 102,8)] góp phần giải thích khác biệt cấu hình C-4 Do vậy, hợp chất UGLW3 kết luận (3S,4R,5S,6S,7E)-3,4-dihydroxymegastigman-7-en-9-one-4-O-β-Dglucopyranoside Đây hợp chất đặt tên grandionoside A Footer Page 23 of 148 21 Header Page 24 of 148 4.3 Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào in vitro hợp chất đƣợc phân lập từ loài Bù dẻ tía, Bù dẻ lớn Bù dẻ râu 4.3.1 Hoạt tính gây độc tế bào in vitro hợp chất dòng tế bào ung thƣ LU-1 Hoạt tính gây độc tế bào in vitro 20/25 hợp chất tinh khiết từ Bù dẻ tía, Bù dẻ lớn Bù dẻ râu thử nghiệm trước hết với dòng tế bào LU-1 dựa kết sàng lọc sơ cao chiết tham khảo kết công bố Kết thử nghiệm trình bày Bảng 4.33 Bảng 4.33 Hoạt tính gây độc tế bào in vitro chất phân lập từ Bù dẻ tía, Bù dẻ lớn Bù dẻ râu dòng tế bào LU-1 STT 10 11 Hợp chất UGC4 UGC5 UGC6 UGC8 UGC9 UGW1 UGW2 UGLE1 UGLW1 UCC5 UCC6 IC50 (µg/mL) 37,44 37,63 45,62 26,19 ND 44,84 1,52 1,30 43,47 53,44 43,56 STT 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Hợp chất UCC10 UCC11 UCE8 UCE9 UCE3BII UFC3B1 UFE3A UFE5B UFE7A IC50 (µg/mL) 33,11 35,01 16,66 20,25 ND 10,21 9,22 >100 >100 21 Ellipticine 0,67 ND (not determined): Không xác định Các hợp chất velutinam (UCE8), (22E,24R)-ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-one (UFC3B1) oxoanolobine (UFE3A) thể hoạt tính trung bình với giá trị IC50 16,66, 10,21 9,22 µg/mL Đặc biệt, hai hợp chất ()-3-Odebenzoylzeylenone (UGLE1) ardisiacrispin B (UGW2) có tác dụng ức chế mạnh với giá trị IC50 1,30, 1,52 µg/mL Do vậy, hai hợp chất ưu tiên lựa chọn để tiếp tục thử nghiệm dòng tế bào ung thư khác (mục 4.3.2) 4.3.2 Hoạt tính gây độc tế bào in vitro hợp chất UGLE1 UGW2 dòng tế bào khác Hoạt tính gây độc tế bào in vitro ()-3-O-debenzoylzeylenone (UGLE1) ardisiacrispin B (UGW2) tiếp tục thử nghiệm nhiều dòng tế bào khác Kết thể Bảng 4.34 Theo đó, hợp chất ()-3-O-debenzoylzeylenone (UGLE1) có khả gây độc mạnh dòng tế bào KB, Hep-G2, MKN-7, SW-480, HL-60 SK-Mel-2 với giá trị IC50 1,01–3,71µg/mL Ngoài ra, hợp chất Footer Page 24 of 148 22 Header Page 25 of 148 thể hoạt tính mạnh dòng tế bào HeLa (IC50 = 2,31 µg/mL), PANC-1 (IC50 = 3,42 µg/mL) PSN-1 (IC50 = 2,03 µg/mL) Đáng lưu ý hợp chất UGLE1 thể độc tính thấp dòng tế bào thường 3T3 (IC50 = 7,19 µg/mL), TIG-3 (IC50 = 4,03 µg/mL) so với chất đối chứng Hợp chất ardisiacrispin B (UGW2) thể hoạt tính mạnh dòng tế bào KB, Hep-G2, MKN-7, SW-480 với giá trị IC50 tương ứng 1,72, 1,65, 1,37 1,33 µg/mL So với chất đối chứng, ardisiacrispin B (UGW2) cho thấy độc tính thấp dòng tế bào thường 3T3 với giá trị IC50 8,22 µg/mL Bảng 4.34 Hoạt tính gây độc tế bào in vitro hợp chất UGLE1 UGW2 dòng tế bào khác Dòng tế bào KB MDA-MB-231 LNCaP Hep-G2 MKN-7 SW-480 HL-60 SK-Mel-2 3T3 A549# HeLa# PANC-1# PSN-1# TIG-3# IC50 (µg/mL) UGW2 1,72 12,64 10,43 1,65 1,37 1,33 24,27 UGLE1 3,71 17,81 12,63 3,65 2,40 3,13 1,73 1,01 7,19 9,92 2,31 3,42 2,03 4,03 8,22 Ellipticine 0,98 0,79 0,79 0,86 0,94 0,78 0,72 0,28 0,31 5-F 0,30 0,75 1,17 1,03 1,26 Thử nghiệm Đại học Toyama, Nhật Bản; 5-F: 5-Fluorouracil # KẾT LUẬN Lần Việt Nam, thành phần hóa học hoạt tính sinh học loài Bù dẻ tía (Uvaria grandiflora Roxb ex Hornem), Bù dẻ lớn (Uvaria cordata (Dun.) Wall ex Alston.) Bù dẻ râu (Uvaria fauveliana (Fin & Gagnep.) Ast.) nghiên cứu cách có hệ thống Tổng cộng có 25 hợp chất phân lập có hợp chất hợp chất phân lập lần từ chi Uvaria; hợp chất thể hoạt tính gây độc tế bào ung thư có hợp chất có tác dụng mạnh nhiều dòng tế bào khác Các lớp chất phân lập từ loài phù hợp với hóa thực vật chi Uvaria công bố trước Footer Page 25 of 148 23 Header Page 26 of 148 Thành phần hóa học loài Bù dẻ: i Từ phần mặt đất loài Bù dẻ tía phân lập xác định cấu trúc hóa học hợp chất đa oxy hóa cyclohexene mới, ()-3-Odebenzoylzeylenone, megastigmane glycoside mới, grandionoside A, hợp chất gồm: pipoxide chlorohydrin, ()-zeylenone, ()-zeylenol, ()-pipoxide, lupeol, (Z)-3-hexenyl-1-O-β-D-glucopyranoside, sakurasosaponin ardisiacrispin B ii Từ Bù dẻ lớn phân lập xác định cấu trúc hóa học hợp chất thơm mới, cordauvarin A, hợp chất gồm: cyathoviridine, β-sitosterol palmitate, ()-spathulenol, 5β,6β-epoxyalnusane-3αol, glutin-5-en-3α-ol, taraxerol, velutinam aristolactam A Ia iii Từ phần mặt đất loài Bù dẻ râu phân lập xác định cấu trúc hóa học lignan glycoside mới, ufaside, hợp chất gồm: 5glutinen-3-one, (22E,24R)-ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-one, oxoanolobine, daucosterol catechin iv Bảy hợp chất gồm (Z)-3-hexenyl-1-O-β-D-glucopyranoside, sakurasosaponin, ardisiacrispin B, cyathoviridine, ()-spathulenol, 5β,6β-epoxyalnusane-3α-ol (22E,24R)-ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-one phân lập lần từ chi Uvaria Hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro cao chiết: i Cao chiết MeOH từ phần mặt đất loài Bù dẻ tía thể hoạt tính ức chế tốt dòng tế bào ung thư thử nghiệm (Hep-G2, KB, LU-1, MKN-7, MDA-MB-231, SW-480) với giá trị IC50 từ 0,62–7,51 µg/mL Cao chiết MeOH từ Bù dẻ lớn có hoạt tính tốt dòng tế bào với giá trị IC50 từ 15,63–18,51 µg/mL ii Các cao chiết phân đoạn [n-hexane, chloroform, ethyl acetate, n-butanol] từ phần mặt đất loài Bù dẻ tía có tác dụng ức chế tế bào ung thư thử nghiệm với mức độ khác (IC50: 0,97–22,72 µg/mL MDA-MB-231; 1,31– 18,77 µg/mL MKN-7), phân đoạn chloroform n-hexane thể hoạt tính mạnh với giá trị IC50 thấp Tương tự, ngoại trừ phân đoạn nước, phân đoạn lại Bù dẻ lớn thể hoạt tính mạnh dòng tế bào LU-1 MKN-7 với giá trị IC50 từ 0,13–1,09 µg/mL Footer Page 26 of 148 24 Header Page 27 of 148 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro chất tinh khiết phân lập: i Các hợp chất velutinam, (22E,24R)-ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-one oxoanolobine thể hoạt tính trung bình dòng tế bào LU-1 với giá trị IC50 16,66, 10,21 9,22 µg/mL ii Hợp chất ardisiacrispin B thể hoạt tính mạnh dòng tế bào gồm LU-1, KB, Hep-G2, MKN-7 SW-480 với giá trị IC50 tương ứng 1,52, 1,72, 1,65, 1,37 1,33 µg/mL; thể hoạt tính trung bình dòng tế bào gồm MDA-MB-231 (IC50 = 12,64 µg/mL) LNCaP (IC50 = 10,43 µg/mL) iii Hợp chất ()-3-O-debenzoylzeylenone có khả gây độc mạnh 10 dòng tế bào LU-1, KB, Hep-G2, MKN-7, SW-480, HL-60, SK-Mel-2, HeLa, PANC-1 PSN-1 với giá trị IC50 1,30, 3,71, 3,65, 2,40, 3,13, 1,73, 1,01, 2,31, 3,42 2,03 µg/mL; gây độc mức trung bình dòng tế bào gồm MDA-MB-231 (IC50 = 17,81 µg/mL), LNCaP (IC50 = 12,63 µg/mL) A549 (IC50 = 9,92 µg/mL) KIẾN NGHỊ Các kết nghiên cứu loài Bù dẻ tía, Bù dẻ lớn Bù dẻ râu dẫn đến việc phân lập xác định nhiều hợp chất có cấu trúc lý thú có hoạt tính ức chế mạnh nhiều dòng tế bào ung thư Tuy nhiên, dược liệu chưa nghiên cứu ứng dụng nhiều Vì vậy, tương lai, hoá thực vật hoạt tính sinh học chúng cần tiếp tục nghiên cứu sâu rộng nhằm khám phá cấu trúc hóa học hoạt tính mới, làm sáng tỏ chế tác dụng mối quan hệ cấu trúc hóa học hoạt tính sinh học hoạt chất Với chất có hoạt tính tốt cần tiếp tục nghiên cứu tổng hợp toàn phần, bán tổng hợp định hướng ứng dụng vào sống Footer Page 27 of 148 25 Header Page 28 of 148 CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ Duc Viet Ho, Takeshi Kodama, Hien Thi Bich Le, Kiem Van Phan, Thao Thi Do, Tai Huu Bui, Anh Tuan Le, Nwet Nwet Win, Hiroshi Imagawa, Takuya Ito, Hiroyuki Morita, Hoai Thi Nguyen (2015), A new polyoxygenated cyclohexene and a new megastigmane glycoside from Uvaria grandiflora, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 25 (16), 3246–3250 Thi Hoai Nguyen, Viet Duc Ho, Thi Thao Do, Huu Tai Bui, Van Kiem Phan, Katrin Sak, and Ain Raal (2015), A new lignan glycoside from the aerial parts and cytotoxic investigation of Uvaria rufa, Natural Product Research, 29 (3), 247–252 Hồ Việt Đức, Lê Thị Hồng Oanh, Nguyễn Thị Hoài, Phan Văn Kiệm, Đỗ Thị Thảo (2013), Tác dụng gây độc tế bào ung thư dịch chiết Uvaria cordata (Dun.) Wall ex Alston – Annonaceae, Tạp chí Dược liệu, 18 (2), 77–82 Nguyễn Thị Hoài, Hồ Việt Đức, Nguyễn Thị Hoài Ly, Phan Văn Kiệm (2013), Thành phần hoá học Bù dẻ lớn (Uvaria cordata (Dun.) Wall ex Alston), Tạp chí Dược liệu, 18 (4), 254–258 Hồ Việt Đức, Lê Thị Bích Hiền, Phan Văn Kiệm, Đỗ Thị Thảo, Nguyễn Thị Hoài (2013), Tác dụng gây độc tế bào ung thư dịch chiết phân đoạn hợp chất polyoxygenated cyclohexen từ Bù dẻ tía (Uvaria grandiflora), Tạp chí Dược học, 446, 7–12 Nguyễn Thị Hoài, Nguyễn Thị Hoài Ly, Hồ Việt Đức, Phan Văn Kiệm (2013), Tác dụng gây độc tế bào cao chiết phân đoạn alkaloid phân lập từ Bù dẻ lớn (Uvaria cordata (Dun.) Wall ex Alston), Tạp chí Dược học, 447, 29–34 Nguyễn Thị Hoài, Hồ Việt Đức, Phan Văn Kiệm (2013), Hai saponin glycosid phân lập từ Bù dẻ tía (Uvaria grandiflora Roxb ex Hornem), Tạp chí Dược học, 452, 35–40 Nguyễn Thị Hoài, Hồ Việt Đức, Phan Văn Kiệm (2013), Hợp chất thơm từ Bù dẻ lớn (Uvaria cordata), Tạp chí Hoá học, 51 (6), 736–739 Footer Page 28 of 148 26 ... hoạt tính sinh học nước giới Từ lí trên, đề xuất đề tài: Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học số loài thuộc chi Uvaria L - họ Na (Annonaceae) Đối tƣợng nghiên cứu nội dung luận án -. .. MDA-MB-231 (ung thư vú), Hep-G2 (ung thư gan), SW-480 (ung thư ruột kết) MKN-7 (ung thư dày) Hơn nữa, loài Uvaria grandiflora, Uvaria cordata Uvaria fauveliana nghiên cứu thành phần hóa học hoạt. .. 0,72 0,28 0,31 5-F 0,30 0,75 1,17 1,03 1,26 Thử nghiệm Đại học Toyama, Nhật Bản; 5-F: 5-Fluorouracil # KẾT LUẬN Lần Việt Nam, thành phần hóa học hoạt tính sinh học loài Bù dẻ tía (Uvaria grandiflora