Nghiên cứu hoạt tính sinh học và một số tính chất của quercetin tách từ hành tây Allium cepa L.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --- Nguyễn Cửu Nguyệt Huế NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH SINH HỌC VÀ MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA QUERCETIN TÁCH TỪ HÀNH TÂY Allium cepa L... Đ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Nguyễn Cửu Nguyệt Huế

NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH SINH HỌC VÀ MỘT SỐ TÍNH CHẤT

CỦA QUERCETIN TÁCH TỪ HÀNH TÂY Allium cepa L

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2016

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Nguyễn Cửu Nguyệt Huế

NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH SINH HỌC VÀ MỘT SỐ TÍNH CHẤT

CỦA QUERCETIN TÁCH TỪ HÀNH TÂY Allium cepa L.

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Nguyễn Quang Huy

Hà Nội - 2016

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn trên, em đã may mắn nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu cả

về vật chất, tinh thần cũng như kiến thức chuyên môn, kinh nghiệm của các thầy cô, gia đình, bạn

bè Trước tiên, em xin gửi lời cảm ơn trân trọng nhất tới T Ng y n Quang Huy, ngươ i Thày giúp đỡ em rất nhiều trong việc phát triển tư d y khoa học, luôn tận tình chỉ bảo em về chuyên môn, kinh nghiệm làm việc cũng như động vi n, giúp đỡ em rất nhiều trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu khoa học,thực hiện luận văn

m in gư i lơ i ca m ơn sâu să c tơ i ca c thâ y cô gia o trong bộ môn Sinh lý thực vật và hóa sinh, đặc biệt TS Lê Hồng Điệp luôn quan tâm, động viên và tạo mọi điều kiện để em thực hiện thí nghiệm

Trong suốt quá trình học em đã tiếp th được các kiến thức chuyên sâu của các thầy cô thuộc khoa inh ho c, trươ ng Đa i ho c hoa ho c Tư nhiên đa nhi t ti nh gia ng da y

Tiếp đến, em xin gửi lời cảm ơn sâ sắc tới NC L H y Hoàng, người đa luôn nhi t

ti nh, theo sa t va chi dâ n ca c thao ta c thi nghi m Em xin cảm ơn các chị, em trong nhóm thí nghiệm thuộc bộ môn Sinh lý thực vật và hóa sinh đã l ôn b n cạnh và hỗ trợ trong quá trình thực hiện đề tài

m gư i lơ i ca m ơn tơ i phòng Đào tạo sa Đại học, trường Đại học Khoa học Tự Nhiên

đã tạo điều kiện và đáp ứng nhu cầu,nguyện vọng của em và hoàn thành chương trình học tập của khóa học

Cuối cùng con xin gửi lời gia đình, bạn bè đã l ôn động viên, cổ vũ và tạo môi trường tinh thần thuận lợi nhất cho tôi trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu vừa qua

1 2 ăm 2016

Học viên cao học

t Huế

MỤC LỤC

Trang

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 Tổng quan về polyphenol 2

1.1.1 Định nghĩa 2

1.1.2 Phân loại 2

1.1.3 Một số phương pháp chiết xuất hợp chất phenol 3

1.2 Quercetin và tính chất đặc trưng 8

1.2.1 Định danh và đặc tính của quercetin 8

1.2.2 Đặc tính chống oxi hóa của Quercetin 9

1.3 Một số ứng dụng của Quercetin 13

1.3.1 Tác dụng chống lão hóa 13

1.3.2 Chống dị ứng 13

1.3.3 Đặc tính bảo vệ hệ tuần hoàn 14

1.3.4 Chống ung thư 14

1.3.5 Chống viêm 14

1.3.6 Ngăn ngừa béo phì 15

1.3.7 Điều trị viêm khớp 15

1.3.8 Giảm nguy cơ mắc hen suyễn 16

1.3.9 Điều trị bệnh đái tháo đường 16

1.3.10 Tăng cường thể lực 17

1.4 Dẫn xuất Quercetin trong hành tây và phương pháp chiết suất 17

1.4.1 Đặc điểm hành tây (Allium cepa L.) 17

1.4.2 Hàm lượng Quercetin trong một số loại rau quả 18

1.4.3 Các dẫn xuất Quercetin trong hành tây 20

1.4.4 Tác dụng chống vi khuẩn gây hại của dịch chiết hành tây 21

CHƯƠNG 2 23

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Nguyên liệu 23

2.1.1 Mẫu thực vật 23

2.1.2 Mẫu vi sinh vật 23

2.2 Hoá chất 23

2.3 Thiết bị thí nghiệm 24

2.3.1 Thiết bị tách chiết hợp chất 24

2.3.2 Thiết bị nuôi cấy vi vi sinh 24

2.4 Phương pháp nghiên cứu 24

2.4.1 Quá trình chiết thực vật 24

2.4.2 Các phương pháp chiết quercetin từ hành tây 26

2.4.3 Các phản ứng định tính 1 số chất trong hành tây 29

2.4.4 Phương pháp định lượng Flavonoid trong dịch chiết các phần hành tây 30

2.4.5 Phân lập các hợp chất và tinh chế quercetin 31

2.4.6 Phương pháp thử hoạt tính sinh học 32

2.4.7 Phương pháp thử hoạt tính thu dọn gốc tự do DPPH 34

2.4.8 Phương pháp thống kê 35

CHƯƠNG 3 36

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36

3.1 Kết quả thử nghiệm phương pháp chiết suất quercetin từ hành tây 36

3.1.1 Kết quả thử nghiệm phương pháp chiết 1 36

3.1.2 Kết quả thử nghiệm phương pháp chiết 2 37

3.1.3 Khảo sát độ tinh sạch của quercetin đối chiếu với quercetin chuẩn 39

3.2 Kết quả định tính, định lượng hoạt chất sinh học trong dịch chiết hành tây

42

3.2.1 Kết quả định tính flavonoid trong hành tây 42

3.2.2 Kết quả định lượng flavonoid trong hành tây 43

3.3.3 Kết quả định tính glycoside trong hành tây 44

3.3 Kết quả thử hoạt tính sinh học Quercetin tách chiết từ hành tây 45

3.3.1 Kết quả thử hoạt tính sinh học với vi khuẩn của Quercetin đối chứng 45 3.3.2 Kết quả thử hoạt tính sinh học kháng khuẩn của các dịch chiết hành tây 47

3.3.3 Ảnh hưởng của hoạt tính sinh học kháng khuẩn của quercetin chiết từ

hành tây 48

3.3.4 Kết quả thử hoạt tính chống gốc tự do 51

3.4 Xác định độ tinh sạch Quercetin tách chiết từ hành tây 52

3.4.1 Kết quả sắc ký điều chế Quercetin từ các mẫu hành tây 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Phân loại các hợp chất phenol theo Harborne 3

Bảng 1.2 So sánh các phương pháp chiết thực vật 5

Bảng 1.3 Định danh và đặc tính của quercetin 9

Bảng 1.4 Quercetin trong một số thực phẩm 18

Bảng 1.5 Hàm lượng polyphenol trong hành tây 20

Bảng 2.1 Mức độ hấp thụ OD quercetin 415nm 31

Bảng 3.1 Khối lượng cao tương ứng với dung môi chiết hành tây (g) 36

Bảng 3.2 Kết quả thủy phân phân rutin tạo quercetin 38

Bảng 3.3 Tối ưu hệ dung môi chạy sắc ký 39

Bảng 3.4 Tách chiết Quercetin từ hành tây với các nồng độ EtOH khác nhau 41

Bảng 3.5 Phản ứng định tính flavonoid trong các dịch chiết hành tây 43

Bảng 3.6 Định lượng Flavonoid trong mẫu hành tây 43

Bảng 3.7 Kết quả định tính glycoside trong các mẫu hành tây 45

Bảng 3.8 Nồng độ các mẫu thử hoạt tính 46

Bảng 3.9 Đường kính vòng kháng khuẩn (cm) của các mẫu Quercetin đối chiếu 46

Bảng 3.10 Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn các dịch chiết hành tây 47

Bảng 3.11 Đường kính vòng kháng khuẩn (cm) của các mẫu quercetin tách chiết 49 Bảng 3.12 Kết quả thử hoạt tính chống gốc tự do DPPH 51

Bảng 3.13 Kết quả chạy sắc ký bản mỏng điều chế mẫu hành tây tím (21) 53

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Các phương pháp chiết chất trong dung môi 4

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của quercetin 8

Hình 1.3 Quá trình loại bỏ gốc oxi hóa (R) bởi flavonoids 10

Hình 1.4 Vị trí thực hiện liên kết với gốc oxi hóa tự do tại vòng A, B 11

Hình 1.5 Hành tây (Allium cepa) 17

Hình 1.6 Cấu trúc của các dẫn xuất chủ yếu quercetin trong hành tây 20

Hình 2.1 Các bước ngâm chiết quercetin trong các hệ dung môi phân cực tăng dần 27

Hình 2.2 Các bước thủy phân trực tiếp dẫn xuất trong hành tây thu quercetin 28

Hình 2.3 Đường chuẩn nồng độ quercetin 31

Hình 2.4 Cách xác định đường kính vòng kháng khuẩn 34

Hình 3.1 Kết quả TLC các mẫu cao chiết hành tây trong các dung môi khác nhau 37

Hình 3.2 Kết quả chạy sắc ký Quercetin đối chiếu với Quercetin chuẩn 40

Hình 3.3 Ảnh sắc ký bản mỏng so sánh quercetin thu nhận đối chiếu với quercetin chuẩn 42

Hình 3.4 Ảnh định tính glycoside trong các mẫu hành tây vàng (HTV) và hành tây tím (HTT) được chiết trong EtOH 80% 45

Hình 3.5 Vòng kháng khuẩn 4 chủng vi khuẩn của các mẫu dịch chiết hành tây 48

Hình 3.6 Hình ảnh kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn ở 1 số vi khuẩn 50

Hình 3.7 Kết quả hoạt tính chống gốc tự do DPPH 52

Hình 3.8 Sắc ký điều chế Quercetin từ mẫu hành tây chiết số 21 53

BẢNG KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Viết đầy đủ

DPPH : 2,2 - Diphenyl-1-picrylhydrazyl

HPLC : (High Performance Liquid Chromatography) Sắc ký lỏng hiệu

năng cao

PCR : (Polymerase Chain Reaction) – phản ứng khuếch đại gen

TLC : (thin layer chromatography) – Sắc ký bản mỏng

Vit C/ E : Vitamin C/ E

w/v : (weight/volume) Khối lượng mẫu/ thể tích dung môi

w/w : (weight/weight) Khối lượng mẫu/ Khối lượng hệ dung môi – mẫu

MỞ ĐẦU

Hợp chất Flavonoids là polyphenols có rất nhiều trong các loại quả, rau

củ, và ngũ cốc Flavonoids được chia thành nhiều nhóm khác nhau bao gồm các anthocyanidins, nhóm tạo các màu đỏ và xanh trái cây; nhóm catechin có nhiều trong lá trà; nhóm flavonone và flavanone glycosides, tìm thấy trong cam quýt

và mật ong và các flavon, flavonols và flavonol glycosides có nhiều trong lá trà, trái cây, rau củ Hợp chất flavonoid được biết đến với khả năng chống oxy hóa, tạo phức với các ion kim loại hoá trị 2 Các nhóm chất này đã và đang được quan tâm nghiên cứu do chúng mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe con người như hoạt tính chống oxi hóa, ngăn chặn và điều trị một số bệnh mãn tính

Trong nhóm hợp chất flavonoids, nhóm chất quercetin đã được nghiên cứu rộng rãi với trên 14 loại tác dụng chính đã được công bố [29] Quercetin hiện đang được sử dụng dưới dạng thực phẩm chức năng hay thuốc bổ sung cần thiết cho sức khoẻ con người Quercetin tồn tại với hàm lượng lớn trong thực vật

so với các nhóm hợp chất thứ sinh khác đặc biệt trong các cây chè, táo, hành tây

[29] Hành tây (Allium cepa L) là loại thực phẩm được sử dụng hàng ngày, có

giá trị lợi ích cao về dinh dưỡng và gia vị, tuy nhiên hiện nay chưa có nghiên cứu sâu và đầy đủ về hợp chất Quercetin có trong hành tây Để góp phần đánh giá hàm lượng cũng như vai trò của Quercetin trong hành tây, chúng tôi lựa

chọn thực hiện đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu hoạt tính sinh học và một số

tính chất của quercetin tách từ hành tây Allium cepa L.” với mục tiêu là tách

tinh sạch Quercetin từ hành tây và xác định một số hoạt tính sinh học trong đó

có hoạt tính quét gốc tự do DPPH và hoạt tính kháng khuẩn

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt

1 Kiều Mai Dung (2007), Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng rutin

trong hòe hoa, (Khóa luận dược sĩ khóa 1997-2002), tr 8-9

2 Nguyễn Văn Đậu (2003), “Ứng dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

pha ngược (RP-HPLC) để phân tích định lượng nhanh các hợp chất

Phenol trong thực vật”, Hội nghị hóa học toàn quốc lần thứ IV, tr.96-110

3 Nguyễn Văn Đậu (2001), “Đóng góp vào việc nghiên cứu Flavonoid trong nụ

Hòe”, Tạp chí dược học, số 304, tr 13-14

4 Phan Tuấn Nghĩa (2012), Giáo trình hóa sinh học thực nghiệm, NXB Giáo

dục Việt Nam

5 Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, NXB

Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh

6 Hoàng Văn Tuấn, Phạm Hương Sơn, Nguyễn Thị Hiền, Nguyễn Đình Luyện,

hoạt tính sinh học của dịch chiết flavonoid từ cây diếp cá (Houttuynia

cordata thunberg) thu hái tại Hà Nội”, Tạp chí sinh học, 35 (3), tr 183

-187

7 Viện dược liệu, Kỹ thuật chiết xuất dược liệu, (2012) Bộ giáo dục và đào tạo

Tài liệu tiếng Anh

8 Ansari, M.A.; Hafiz, M.A.; Joshi, G.; Opii, W.O (2009), “Butterfield, D.A

Protective effect of quercetin in primary neurons against Aβ (1-42):

relevance to Alzheimer's disease”, J Nutr Biochem., 20, pp 269-275

9 Ansari MA, Ahmed SP, Haider S, Ansari NL: Nigella sativa, (2006), “A

nonconventional herbal option for the management of seasonal allergic

rhinitis”, Pak J Pharm , 23, pp.31–35

10 Arts, M.J.T.J.; Dallinga, J.S.; Voss, H.P., Haenen, G.R.M.M.; Bast, A

11 Aruona, O (1998), “Free radicals, oxidative stress, and antioxidants in

human health and disease”, Journal of the American Oil Chemists

Society, 75,pp 199 – 212

12 Augusti, K (1996), “Therapeutic values of onion and garlic”, Indian Journal

of Experimental Biology, 34,6 pp.634-640

13 Bast, A.; Haenen, G.R.M.M (2002), “The toxicity of antioxidants and their

metabolites”, Environ Toxicol Pharmacol., 11, pp.251-258

14 Bae, S.C.; Jung, W.J.; Lee, E.J., Yu, R., Sung, M.K., (2009), ”Effects of

antioxidant supplements intervention on the levelof plasma inflammatory

molecules and disease severity of rheumatoid arthritis patients” J Am

Coll Nutr., 28, pp 56-62

15 Begum, A.N., Terao J., (2002), “Protective effect of quercetin against

cigarette tar extract induced impairment of erythrocyte deformability”, J

Nutr Biochem., 13, pp 265-272

16 Celestino Santos-Buelga, Williamson Gary (2003), “Methods in Polyphenol

Analysis”, The Royal Society of Chemistry, UK, 1, pp 11-12

17 Chang C C., Yang M H., Chern J C., (2002) ”Estimation of total flavonoid

content in Propolis by two complementary colorimetric methods”, Journal

of Food and Drug Analysis, 10(3), pp.178-182

18 Chirumbolo, S (2011), “Quercetin as a potential anti-allergic drug: which

perspectives?” Iran J Allergy Asthma Immunol., 10, pp 139-140

19 Chirumbolo (2013), “S Quercetin in cancer prevention and therapy”, Integr

Cancer Ther., 12, pp.97-102

20 Chondrogianni N., Kapeta S., Chinou I., Vassilatou K., Papassideri I., Gonos,

E.S (2010), “Anti-ageing and rejuvenating effects of quercetin”, Exp

Gerontol., 45, pp.763-771

21 Cushnie T.P., Lamb A.J, (2005), “Antimicrobial activity of flavonoids”, Int

J Antimicrob Agents, 26, pp 343-356

22 Dajas F., (2012), “Life or death: neuroprotective and anticancer effects of

quercetin”, J Ethnopharmacol, 143, pp.383-396

23 D Procházková, Boušová, N Wilhelmová (2011), “Antioxidant and

prooxidant properties of flavonoids”, Fitoterapia, 82, pp 513 -523

24 De Souza R.F., De Giovani W.F, (2004), “Antioxidant properties of

complexes of flavonoids with metal ions”, Redox Rep., 9, pp 97-104

25 Erdogrul O.T., (2002), “Antibacterial activities of some plant extracts used in

folk medicine”, Pharm Biol, 40, pp 269–273

26 Fan J., Chen, J., (1999), “Inhibition of aflatoxinproducing fungi by Welsh

onion extracts”, Journal of Food Protection 62(4), pp 414-417

27 Freddy Remos, Yoshihisa Takaishi, Miki Shirotori, Yousuke Kawaguchi,

Koichiro Tsuchiya, Hirofumi Shibata, Tomihiko Higuti, Tetsuo Tadokoro, Minoru Takeuchi, (2006), “Antibacterial and Antioxidant Activities of

Quercetin Oxidation Products from Yellow Onion (Allium cepa) Skin”,

Journal of agricultural and food chemistry, 54, pp 3551−3557

28 Frei B, Higdon J.V., (2003), “Antioxidant activity of tea polyphenols in

vivo:evidence from animal studies”, J Nutri, 133(S32), pp.75–84

29 Gabriele D.Andrea, (2015), “A flavonol with multifaceted therapeutic

applications?”, Fitoterapia, S0367-326X(15)30092-7

B.,(2002), “Onions global benefit to health”, Phytother Res., 16, pp

603-615

31 Goodwin Avery C., Steele-Moore Lynn, Schwalbe Richard (2007),

“Antimicrobial Susceptibility Testing Protocols”, CRC Press USA, (3)

pp.59-72

32 Haenen, G.R.M.M., Paquay J.B., Korthouwer R.E., (1997), “A Peroxynitrite

scavenging byflavonoids”, Biochem Biophys Res Commun., 236,