Nghiên Cứu Hoạt Tính Sinh Học Và Thành Phần Hóa Học Từ Cây Cổ Yếm Lá Bóng (Gynostemma Laxum (Wall.) Cogn] Của Việt Nam

Header Page of 126 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT PHẠM THỊ NINH NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH SINH HỌC VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC TỪ CÂY CỔ YẾM LÁ BÓNG [GYNOSTEMMA LAXUM (WALL.) COGN.] CỦA VIỆT NAM Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số : 60 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học GS TSKH TRẦN VĂN SUNG Hà nội, năm 2013 Footer Page 1Số of hóa 126.bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Header Page of 126 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng tôi, số liệu kết nghiên cứu nêu luận văn trung thực, đồng tác giả cho phép sử dụng chưa công bố công trình khác Tác giả luận văn Phạm Thị Ninh Footer Page 2Số of hóa 126.bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Header Page of 126 LỜI CẢM ƠN Luận án thực Phòng Tổng hợp Hữu cơ, Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt nam Với lòng biết ơn sâu sắc xin chân thành cảm ơn GS.TSKH Trần Văn Sung, người thầy trực tiếp tận tình hướng dẫn giúp đỡ suốt thời gian làm việc Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể cán khoa học Phòng Tổng hợp Hữu – Viện Hoá học – Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ, hướng dẫn suốt trình thực đề tài Tôi xin cảm ơn cán phòng Hóa sinh ứng dụng, phòng phổ IR, phổ NMR phổ khối MS – Viện Hoá học thực thử hoạt tính đo loại phổ giúp Xin cảm ơn nhiệt tình giảng dạy quý thầy cô giáo suốt trình học tập Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến người thân gia đình bạn bè động viên giúp đỡ suốt trình học tập nghiên cứu Tác giả luận văn Phạm Thị Ninh Footer Page 3Số of hóa 126.bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Header Page of 126 MỤC LỤC Trang Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu Phƣơng pháp nghiên cứu 4.1 Các phƣơng pháp nghiên cứu lý thuyết 4.2 Các phƣơng pháp nghiên cứu thực nghiệm .3 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Bố cục luận văn CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN Họ Cucurbitaceae chi Gynostemma 1.1 Họ Cucurbitaceae 1.2 Chi Gynostemma 1.3 Cổ yếm bóng 1.3.1 Tên gọi .5 1.3.2 Môi trƣờng sống 1.3.3 Tính vị tác dụng Hoạt tính sinh học cổ yếm bóng Thành phần hóa học .8 3.1 Các carotenoid .8 3.2 Các polysaccharid 3.3 Các sterol .9 3.4 Các flavonoid 10 Footer Page 4Số of hóa 126.bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Header Page of 126 3.5 Các saponin 11 CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 XỬ LÝ MẪU THỰC VẬT VÀ CÁC PHƢƠNG PHÁP CHIẾT TÁCH PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC 19 2.1.1.Mẫu thực vật .19 2.1.2 Các phƣơng pháp sắc ký để phân lập chất 20 2.1.3 Các phƣơng pháp xác định cấu trúc hóa học .20 2.2 CÁC PHƢƠNG PHÁP THỬ HOẠT TÍNH 20 2.2.1 Thử hoạt tính chống oxy hóa .20 2.2.2 Thử hoạt tính chống ung thƣ .21 2.2.3 Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 21 CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM .22 3.1 HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ PHƢƠNG PHÁP 22 3.1.1 Hóa chất thiết bị nghiên cứu 22 3.1.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 23 3.2 CHIẾT TÁCH VÀ TINH CHẾ CÁC CHẤT TỪ CÂY CỔ YẾM LÁ BÓNG GYNOSTEMMMA LAXUM (WALL.) COGN 27 3.2.1 Xử lý mẫu thực vật .27 3.2.2 Chiết tách chất từ dịch chiết etyl acetat .28 3.2.3 Chiết tách chất từ dịch chiết n-BuOH 30 3.3 THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC 32 3.3.1.Thử hoạt tính chống oxy hóa 32 3.3.2 Thử hoạt tính gây độc tế bào 32 3.3.3 Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 33 Footer Page 5Số of hóa 126.bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Header Page of 126 CHƢƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 4.1 Giới thiệu 34 4.2 Kết thử hoạt tính sinh học .34 4.2.1 Hoạt tính chống oxy hóa .34 4.2.2 Hoạt tính gây độc tế bào .35 4.2.3 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 36 4.3 Xác định cấu trúc chất phân lập đƣợc 37 4.3.1 chất 43 (GCLB17): quercetin .37 4.3.2.Chất 44 (GCL14.2): ombuim 46 4.3.3.Chất 45 (GCLB.3N): ombuosid 53 4.3.4.Chất 46 (GCL2.2): 4,7- dimethoxy kaempferol 61 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 74 - KẾT LUẬN 74 - TÀI LIỆU THAM KHẢO .76 Footer Page 6Số of hóa 126.bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Header Page of 126 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN VĂN br : Broad (NMR) d : Doublet (NMR) δ : Độ chuyển dịch hoá học (NMR) DEPT : Distortionless enhancement by polarisation transfer DMSO : Dimethyl sulfoxide D2O : Nƣớc đƣợc đơteri hoá EI : Electronic impact EtOAc : Ethyl acetate FT : Fourier transform HMBC : Heteronuclear multiple bond correlation HMQC : Heteronuclear multiple quantum coherence COSY : Correlation Spectroscopy IR : Infrared J : Hằng số tƣơng tác (NMR) m : Multiplet (NMR) Me : Methyl MeOH : Methanol MS : Mass spectrometry NMR : Nuclear magnetic resonance ppm : Parts per million Rf : Retention factor s : Singlet (NMR) t : Triplet (NMR) UV : Ultraviolet dd: double of double IC50: The half maximal inhibitory concentration LD50: Lathal dose 50% HPLC: High performance liquid chromatography Footer Page 7Số of hóa 126.bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Header Page of 126 LDL: Low density lipoprotein VLDL: Very low density lipoprotein HDL: High density lipoprotein G Gynostemma Ara: α -L-arabinopyranosyl Rha: α -L-rhamnopyranosyl Glu: β-D-glucopyranosyl Xyl: β-D-xylopyranosyl Lyx: β-L-lyxopyranosyl SKBM: sắc ký mỏng DANH MỤC CÁC BẢNG Số hiệu Tên bảng bảng Trang 4.1 Kết thử hoạt tính kháng oxy hóa 33 4.2 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào 34 4.3 Kết thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 36 4.4 Số liệu phổ 1H 13C-NMRcủa chất 43; 44; 45 46 38 4.5 Các chất phân lập từ Cổ yếm bóng 72 Footer Page 8Số of hóa 126.bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Header Page of 126 DANH MỤC CÁC HÌNH Số hiệu hình Tên hình Trang 1.1 Ảnh số loài thuộc chi Gynostemma 2.1 Ảnh Gynostemma laxum (Wall.) Cogn thu hái Hoà Bình 18 3.2.2 3.2.3 Sơ đồ chiết mẫu tách chất từ dịch chiết EtOAc cổ yếm bóng Sơ đồ chiết mẫu tách chất từ dịch chiết EtOAc cổ yếm bóng 28 30 4.1 Phổ IR chất 43 41 4.2 Phổ 1H-NMR chất 43 42 4.3 Phổ 1H-NMR chất 43 (giãn rộng) 43 4.4 Phổ 13C-NMR chất 43 44 4.5 Phổ DEPT 13C-NMR chất 43 45 4.6 Phổ 1H-NMR chất 44 47 4.7 Phổ 1H-NMR chất 44 (giãn rộng) 48 4.8 Phổ 13C-NMR chất 44 49 4.9 Phổ 13C-NMR chất 44 (giãn rộng) 50 4.10 Phổ DEPT 13C-NMR chất 44 51 4.11 Phổ MS chất 44 52 4.12 Phổ 1H-NMR chất 45 54 4.13 Phổ 1H-NMR chất 45 (giãn rộng) 55 4.14 Phổ 1H-NMR chất 45 (giãn rộng) 56 Footer Page 9Số of hóa 126.bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Header Page 10 of 126 4.15 Phổ 13C-NMR chất 45 57 4.16 Phổ 13C-NMR chất 45 58 4.17 Phổ 13C-NMR chất 45 59 4.18 Phổ DEPT 13C-NMR chất 45 60 4.19 Phổ 1H-NMR chất 46 62 4.20 Phổ 1H-NMR chất 46 (giãn rộng) 63 4.21 Phổ 13C-NMR chất 46 64 4.22 Phổ 13C-NMR chất 46 65 4.23 Phổ DEPT 13C-NMR chất 46 66 4.24 Phổ HSQC chất 46 67 4.25 Phổ HSQC chất 46 68 4.26 Phổ HMBC chất 46 69 4.27 Phổ HMBC chất 46 70 4.28 Phổ HMBC chất 46 (giãn rộng) 71 Footer Page 10 126 Sốofhóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Header Page 75 of 126 66 Hình 4.21 Phổ 13C-NMR chất 46 Footer Page 75 of 126 66 Header Page 76 of 126 67 Hình 4.22 Phổ 13C-NMR chất 46 Footer Page 76 of 126 67 Header Page 77 of 126 68 Hình 4.23 Phổ DEPT 13C-NMR chất 46 Footer Page 77 of 126 68 Header Page 78 of 126 69 Hình 4.24 Phổ HSQC chất 46 Footer Page 78 of 126 69 Header Page 79 of 126 70 Hình 4.25 Phổ HSQC chất 46 Footer Page 79 of 126 70 Header Page 80 of 126 71 Hình 4.26 Phổ HMBC chất 46 Footer Page 80 of 126 71 Header Page 81 of 126 72 Hình 4.27 Phổ HMBC chất 46 Footer Page 81 of 126 72 Header Page 82 of 126 73 Hình 4.28 Phổ HMBC (giãn rộng) chất 46 Footer Page 82 of 126 73 Header Page 83 of 126 74 Bảng 4.5: Các chất phân lập từ Cổ yếm bóng [Gynostemma laxum (Wall.) Cogn.] Việt Nam Chất Công thức cấu tạo Tên chất 43 Quercetin Ombuin 44 (4’,7-dimethoxy quercetin) 45 Ombuosid R=β-D-Glc-(1-6)-α-L-Rham 4’7-dimethoxy kaempferol 46 Footer Page 83 of 126 74 Header Page 84 of 126 75 V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận: Đã điều chế đƣợc dịch chiết n-hexan, etyl acetat n-butanol từ Cổ yếm bóng Đã tách tinh chế đƣợc chất nhóm flavonoid từ dịch chiết etyl acetat nbutanol, quercetin (43); 4‟,7-dimethoxy quercetin (ombuin 44); 4‟,7dimethoxy quercetin -3-O-rutinosid (ombuiosid 45); 4,‟7-dimethoxy kaempferol (46) có hai chất lần đƣợc tách từ (Gynostemma laxum) Việt Nam Cấu trúc chất đƣợc khẳng định phƣơng pháp phổ IR, NMR, MS Các số liệu phù hợp với liệu công bố Thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hóa, kháng vi sinh vật kiểm định kháng tế bào ung thƣ ngƣời cho kết nhƣ sau; • Dịch chiết etyl acetat cho hoạt tính kháng oxy hóa tốt (EC50=16,6µg/ml); dịch chiết n-butanol n-hexan có khả kháng oxy hóa gần tƣơng đƣơng (EC50 =97.56 96.0) • Cả dịch chiết từ (Gynostemma laxum) hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định • Dịch chiết etyl acetat có hoạt tính ức chế tất dòng tế bào ung thƣ ngƣời đƣợc thử nghiệm Đó dòng KB (ung thƣ biểu mô), HepG2 (ung thƣ gan), Lu (ung thƣ phổi) MCF-7 (ung thƣ vú) với giá trị IC50 4,6 ; 13.48; 18.10;30.58µg/ml tƣơng ứng • Dịch chiết n-butanol hoạt tính phép thử: kháng oxi hoá, kháng vi sinh vật kiểm định, kháng tế bào ung thƣ Điều gợi ý rằng: Footer Page 84 of 126 75 Header Page 85 of 126 76 hoạt tính sinh học (Gynostemma laxum) không nằm phần phân cực cao 5.2 Kiến nghị - Tiếp tục nghiên cứu thành phần khác (Gynostemma laxum) Footer Page 85 of 126 76 Header Page 86 of 126 77 TÀI LIỆU THAM KHẢO Võ Văn Chi, Sách tra cứu tên cỏ Việt Nam (2007), NXB Giáo dục, 285 Võ Văn Chi, Từ điển thuốc Việt Nam (1997), NXB y học, tập 2, 308 Phạm Hoàng Hộ, Cây cỏ Việt Nam (1999), NXB Trẻ, I, 563 – 576 Bộ môn Thực vật, trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, Thực tập thực vật nhận biết thuốc (2004), Trung tâm thông tin – thƣ viện, Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội Bộ môn Dƣợc liệu, trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, Thực tập dược liệu– Phần hoá học (2002) Bùi Thanh Mai, Chiết xuất phân lập saponin dƣợc liệu Giảo cổ lam Gynostemma pentaphylum (Thumb.), khóa luận tốt nghiệp dƣợc sĩ đại học- Trƣờng đại học dƣợc Hà Nội (2009) Phạm Tuấn Anh, “Nghiên cứu thành phần hoá học số tác dụng sinh học Giảo cổ lam thu hái Sapa”, Luận văn Thạc sỹ Dƣợc học – Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội (2008) Phạm Phƣơng Anh, “Nghiên cứu thành phần hóa học loài Gynostemma laxum (Wall.) Cogn.”, Khóa luận tốt nghiệp Dƣợc sĩ Đại học - Đại học Dƣợc Hà Nội (2011) Phạm Thanh Kỳ, Phạm Tuấn Anh, Phạm Phƣơng Anh, Tạp chí Dược liệu (2011), 16(4), 253-256 10 Dictionary of Natural Products, (2009) version 18 :1, Copyright 1982-2009, Chapman Hall/CRC 11 Razmovski-Naumovski V., Huang T H., Tran V H., Li G Q., Duke C C., Roufogalis B.D., "Chemistry and pharmacology of Gynostemma pentaphyllum", Phytochem Rev (2005), 4, 197-219 12 Liu H L., Kao T H., Chen B H., "Determination of carotenoids in the Chinese medical herb jiaogulan (Gynostemma pentaphyllum Makino) by liquid chromatography", Chromatographia (2004), 60, 411–417 13 Huang S C., Hung C F., Wub W B., Chen B H, "Determination of chlorophylls and their derivatives in Gynostemma pentaphyllum Makino by liquid chromatography– mass spectrometry", J Pharm Biomed Anal (2008), 48,105–112 Footer Page 86 of 126 77 Header Page 87 of 126 78 14 Yang X., Zhao Y., Yang Y., Ruan Y., "Isolation and characterization of immunostimulatory polysaccharide from an herb tea, Gynostemma pentaphyllum Makino", J Agri Food Chem (2008), 56, 6905–6909 15 Akihisa T., Shirnizu N., Tamura T., Matsumoto T., "Structures of three new 24,24dimethyl-Δ7-sterols from Gynostemma pentaphyllum", Lipids (1986), 21,515-517 16 Akihisa T., Tamura J T., Matsumoto T., Kokke W C M C., Yokota T., "Isolation of acetylenic sterols from a higher plant Further evidence that marine sterols are not unique", J Org Chem (1989), 54, 606-610 17 Yin F., Hu L.-H, Pan R., "Novel dammarane-type glycosides from Gynostemma pentaphyllum", Chem Pharm Bull (2004), 52, 1440-1444 18 Cuia J F., Enerotha P, Bruhn J.G., “Gynostemma pentaphyllum: identification of major sapogenins and differentiation from Panax species”, Eur J Pharm Sci.(1999), 8, 187-191 19 Hu L., Chen Z., Xie Y., "New triterpenoid saponins from Gynostemma pentaphyllum", J Nat Prod (1996), 59, 1143-1145 20 Liu X., Ye W., Mo Z., Yu B., Zhao S., Wu H., Che C., Jiang R., Mak T C W., Hsiao W L W., "Five new ocotillone-type saponins from Gynostemma pentaphyllum", J Nat Prod (2004), 67, 1147-1151 21 Liu X., Yu R M., Hsiao W L., Zhao S X., Ye W C., "Three new dammarane glycosides from Gynostemma pentaphyllum", Chin Chem Lett (2004), 15, 46-48 22 Norberg A., Nguyen H K., Liepinsh E., Dao P V., Nguyen T D., Jörnvall H., Sillard R., Östenson C.-G., "A novel insulin-releasing substance, phanoside, from the plant Gynostemma pentaphyllum", J Biol Chem (2004), 279, 41361–41367 23 Yin F., Hu L.-H., "Six new triterpen saponins with a 21,23 lactone skeleton from Gynostemma pentaphyllum", Helv Chim Acta (2005), 88, 1126-1134 24 Huang T H., Razmovski-Naumovski V , Salam N K., Duke R K., Tran V H., Duke C C., Roufogalis B D., "A novel LXR-α activator identified from the natural product Gynostemma pentaphyllum", Biochem Pharmacol (2005), 70, 1298–1308 25 Yin F., Zhang Y N., Yang Z Y., Hu L H., "Nine new dammarane saponins from Gynostemma pentaphyllum", Chem Biodiv (2006), 3, 771-782 26 W Huang T H., Li Y., Razmovski-Naumovski V., Tran V H., Li G Q., Duke C C., Roufogalis B D., "Gypenoside XLIX isolated from Gynostemma pentaphyllum Footer Page 87 of 126 78 Header Page 88 of 126 79 inhibits nuclear factor-kB activation via a PPAR-alphadependent pathway", J Biomed Sci (2006), 13, 535–548 27 Attawish A., Chivapat S., Phadungpat S., Bansiddhi J., Techadamrongsin Y., Mitrijit O., Chaorai B., Chavalittumrong P., "Chronic toxicity of Gynostemma pentaphyllum", Fitoterapia (2004), 75, 539– 551 28 Aktan F., Henness S., Roufogalis B D., Ammit A J., "Gypenosides derived from Gynostemma pentaphyllum suppress NO synthesis in murine macrophages by inhibiting iNOS enzymatic activity and attenuating NF-kB mediated iNOS protein expression", Nitric Oxide (2003), 8, 235–242 29 Hu L., Chen Z., Xie Y., "Dammarane-type glycosides from Gynostemma pentaphyllum", Phytochemistry (1996), 44, 667–670 30 Rossi M H., Guiherme M J., Maia S., “Neolignans, styrylpyrones and flavonoids from an Aniba species‟‟, Phytochemistry (1997), 45(6) 1263-1269 31 Pham Thanh Ky, Pham Tuan Anh, Phan Van Kiem, Chau Van Minh, Nguyen Xuan Nhiem, Bui Huu Tai, Nguyen Thi Thanh Ngan, Tran Hong Quang, Nguyen Phuong Thao, and Young Ho Kim, Benzyl Glycosides from the Aertal Parts of Gynostemma laxum and Their NF- kB Inhibitory Activity HepG2- Cells‟‟, Chem Bull Korean Chem Soc (2011), 32, No 10, 3763-3766 32 Ky P T , Hƣơng P T , Kieu My T., Tuan Anh P., Kiem P V., Minh C V., Cƣơng N X., Phuong Thao N., Xuan Nhiem N., Hyum J H , Kang H K., Kim J H., Dammarane-type saponins from Gynostemma pentaphyllum, Phytochemmistry (2010), 71, 994-1001 33 Ning Li , Chun-Fu Wu, Xin-Yue Xu , Zhen-Yang Liu, Xian Li , Yu-Qing Zhao, Triterpenes possessing an unprecedented skeleton isolated from hydrolyzate of total saponins from Gynostemma pentaphyllum European Journal of Medicinal Chemistry (2012), 50, 173-178 34 Kuwahara, M., et al, "Dammarane saponins of Gynostemma pentaphyllum Makino and isolation of malonylginsenosides-Rb1, -Rd, and malonylypenoside V," Chemical & Pharmaceutical Bulletin (1989), 37(1), 135-139 35 Jang L Y., Qian Z Q., Gu Z G., Wang C., Zhao G.F., “Polyploid origins in Gynostemma pentaphyllum (Cucurbitaceae) inferred from multiple gene sequences‟‟, Mol Phylogenet Evol (2009), 52, 183-191 Footer Page 88 of 126 79 Header Page 89 of 126 80 36 Wang X W., Zhang H P., Chen F., Wang X., Wen W Y., „‟A new lignan from Gynostemma pentaphyllum” Chin Chem Lett (2009), 20, 589-591 37 Marino A., Elberti M.G., Cataldo A., “Sterols from the gynostemma pentaphyllum”, Bollettino Societa Italiana Biologia Sperimentale (1989) 65(4): 317-320 38 Fang Z P., Zeng X Y., “Isolation and identification of flavonoids and organic acids from Gynostemma pentaphyllum Makino”, Zhongguo Zhong Yao Za Zhi (1989), 14(11), 676-8, 703 Footer Page 89 of 126 80 ... Thử hoạt tính sinh học dịch chiết - Phân lập xác định cấu trúc hóa học chất từ dịch chiết - Xác định thành phần hóa học từ cổ yếm bóng Mục tiêu nghiên cứu - Nghiên cứu hoạt tính sinh học thành phần. .. sở khoa học cho việc sử dụng Cổ yếm bóng làm thuốc đề tài: Nghiên cứu hoạt tính sinh học thành phần hóa học từ Cổ yếm bóng [Gynostemma laxum (Wall.) Cogn.] Việt Nam ” đƣợc thực với nội dung... thành phần hóa học cổ yếm bóng (Gynostemma laxum) Việt Nam Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu - Các dịch chiết mẫu Cổ yếm bóng Việt Nam dung môi có độ phân cực khác - Thử hoạt tính sinh học dịch chiết