VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT PHẠM THỊ NINH NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH SINH HỌC VÀ THÀNH PHẦN Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số
Trang 1VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
PHẠM THỊ NINH
NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH SINH HỌC VÀ THÀNH PHẦN
Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm
Mã số : 60 42 01 14
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Người hướng dẫn khoa học
GS TSKH TRẦN VĂN SUNG
Hà nội, năm 2013
Trang 2LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu và kết quả nghiên cứu nêu trong luận văn là trung thực, được đồng tác giả cho phép sử dụng và chưa từng được công bố trong bất kỳ một công trình nào khác
Tác giả luận văn
Phạm Thị Ninh
Trang 3LỜI CẢM ƠN
Luận án này được thực hiện tại Phòng Tổng hợp Hữu cơ, Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt nam
Với lòng biết ơn sâu sắc tôi xin chân thành cảm ơn GS.TSKH Trần Văn Sung, người thầy đã trực tiếp tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm việc
Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể cán bộ khoa học Phòng Tổng hợp Hữu
cơ – Viện Hoá học – Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài
Tôi cũng xin được cảm ơn các cán bộ phòng Hóa sinh ứng dụng, phòng phổ IR, phổ NMR và phổ khối MS – Viện Hoá học đã thực hiện thử hoạt tính và
đo các loại phổ giúp tôi Xin được cảm ơn sự nhiệt tình giảng dạy của quý thầy
cô giáo trong suốt quá trình học tập
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến những người thân trong gia đình và bạn bè đã động viên giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu
Tác giả luận văn
Phạm Thị Ninh
Trang 4MỤC LỤC
Trang
1 Đặt vấn đề 1
2 Mục tiêu nghiên cứu 2
3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2
4 Phương pháp nghiên cứu 2
4.1 Các phương pháp nghiên cứu lý thuyết 2
4.2 Các phương pháp nghiên cứu thực nghiệm 3
5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3
6 Bố cục của luận văn 3
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 4
1 Họ Cucurbitaceae và chi Gynostemma 4
1.1 Họ Cucurbitaceae 4
1.2 Chi Gynostemma 4
1.3 Cổ yếm lá bóng 4
1.3.1 Tên gọi 5
1.3.2 Môi trường sống 5
1.3.3 Tính vị và tác dụng 5
2 Hoạt tính sinh học của cây cổ yếm lá bóng 7
3 Thành phần hóa học 8
3.1 Các carotenoid 8
3.2 Các polysaccharid 9
3.3 Các sterol 9
3.4 Các flavonoid 10
Trang 53.5 Các saponin 11
CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19
2.1 XỬ LÝ MẪU THỰC VẬT VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP CHIẾT TÁCH PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC 19
2.1.1.Mẫu thực vật 19
2.1.2 Các phương pháp sắc ký để phân lập chất 20
2.1.3 Các phương pháp xác định cấu trúc hóa học 20
2.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP THỬ HOẠT TÍNH 20
2.2.1 Thử hoạt tính chống oxy hóa 20
2.2.2 Thử hoạt tính chống ung thư 21
2.2.3 Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 21
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM 22
3.1 HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP 22
3.1.1 Hóa chất và thiết bị nghiên cứu 22
3.1.2 Phương pháp nghiên cứu 23
3.2 CHIẾT TÁCH VÀ TINH CHẾ CÁC CHẤT TỪ CÂY CỔ YẾM LÁ BÓNG GYNOSTEMMMA LAXUM (WALL.) COGN 27
3.2.1 Xử lý mẫu thực vật 27
3.2.2 Chiết tách các chất từ dịch chiết etyl acetat 28
3.2.3 Chiết tách các chất từ dịch chiết n-BuOH 30
3.3 THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC 32
3.3.1.Thử hoạt tính chống oxy hóa 32
3.3.2 Thử hoạt tính gây độc tế bào 32
3.3.3 Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 33
Trang 6CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34
4.1 Giới thiệu 34
4.2 Kết quả thử hoạt tính sinh học 34
4.2.1 Hoạt tính chống oxy hóa 34
4.2.2 Hoạt tính gây độc tế bào 35
4.2.3 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 36
4.3 Xác định cấu trúc của các chất phân lập được 37
4.3.1 chất 43 (GCLB17): quercetin 37
4.3.2.Chất 44 (GCL14.2): ombuim 46
4.3.3.Chất 45 (GCLB.3N): ombuosid 53
4.3.4.Chất 46 (GCL2.2): 4,7- dimethoxy kaempferol 61
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 74
- KẾT LUẬN 74
- TÀI LIỆU THAM KHẢO 76
Trang 7DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN VĂN
br : Broad (NMR)
d : Doublet (NMR)
δ : Độ chuyển dịch hoá học (NMR)
DEPT : Distortionless enhancement by polarisation transfer DMSO : Dimethyl sulfoxide
D2O : Nước đã được đơteri hoá
EI : Electronic impact
EtOAc : Ethyl acetate
FT : Fourier transform
HMBC : Heteronuclear multiple bond correlation
HMQC : Heteronuclear multiple quantum coherence
COSY : Correlation Spectroscopy
IR : Infrared
J : Hằng số tương tác (NMR)
m : Multiplet (NMR)
Me : Methyl
MeOH : Methanol
MS : Mass spectrometry
NMR : Nuclear magnetic resonance
ppm : Parts per million
Rf : Retention factor
s : Singlet (NMR)
t : Triplet (NMR)
UV : Ultraviolet
dd: double of double
IC50: The half maximal inhibitory concentration
LD50: Lathal dose 50%
HPLC: High performance liquid chromatography
Trang 8LDL: Low density lipoprotein
VLDL: Very low density lipoprotein
HDL: High density lipoprotein
G Gynostemma
Ara: α -L-arabinopyranosyl
Rha: α -L-rhamnopyranosyl
Glu: β-D-glucopyranosyl
Xyl: β-D-xylopyranosyl
Lyx: β-L-lyxopyranosyl
SKBM: sắc ký bản mỏng
DANH MỤC CÁC BẢNG
Số hiệu
4.1 Kết quả thử hoạt tính kháng oxy hóa 33 4.2 Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào 34 4.3 Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 36 4.4 Số liệu phổ 1
H và 13C-NMRcủa chất 43; 44; 45 và 46 38 4.5 Các chất phân lập từ cây Cổ yếm lá bóng 72
Trang 9DANH MỤC CÁC HÌNH
Số hiệu
1.1 Ảnh một số loài thuộc chi Gynostemma 6 2.1 Ảnh Gynostemma laxum (Wall.) Cogn thu hái ở Hoà Bình 18
3.2.2 Sơ đồ chiết mẫu và tách chất từ dịch chiết EtOAc của cây cổ
3.2.3 Sơ đồ chiết mẫu và tách chất từ dịch chiết EtOAc của cây cổ
4.2 Phổ 1H-NMR của chất 43 42 4.3 Phổ 1H-NMR của chất 43 (giãn rộng) 43 4.4 Phổ 13C-NMR của chất 43 44 4.5 Phổ DEPT và 13C-NMR của chất 43 45 4.6 Phổ 1H-NMR của chất 44 47 4.7 Phổ 1H-NMR của chất 44 (giãn rộng) 48 4.8 Phổ 13C-NMR của chất 44 49 4.9 Phổ 13C-NMR của chất 44 (giãn rộng) 50 4.10 Phổ DEPT và 13C-NMR của chất 44 51
4.12 Phổ 1H-NMR của chất 45 54 4.13 Phổ 1H-NMR của chất 45 (giãn rộng) 55 4.14 Phổ 1H-NMR của chất 45 (giãn rộng) 56
Trang 104.15 Phổ 13C-NMR của chất 45 57 4.16 Phổ 13C-NMR của chất 45 58 4.17 Phổ 13C-NMR của chất 45 59 4.18 Phổ DEPT và 13C-NMR của chất 45 60 4.19 Phổ 1H-NMR của chất 46 62 4.20 Phổ 1H-NMR của chất 46 (giãn rộng) 63 4.21 Phổ 13C-NMR của chất 46 64 4.22 Phổ 13C-NMR của chất 46 65 4.23 Phổ DEPT và 13C-NMR của chất 46 66
4.28 Phổ HMBC của chất 46 (giãn rộng) 71
Trang 111
MỞ ĐẦU
1 Đặt vấn đề
Việt Nam là nước có nguồn thực vật phong phú với khoảng 12.000 loài, trong
đó đã điều tra được 3.850 loài được sử dụng làm thuốc thuộc 309 họ Đa phần các cây mọc tự nhiên và chưa được nghiên cứu một cách đầy đủ, có hệ thống về mặt khoa học cũng như hoạt tính sinh học Từ nhiều năm qua, thảo dược luôn giữ vai trò quan trọng trong việc bảo vệ sức khỏe con người đã được các Lương Y và Đông Y sử dụng trong những bài thuốc gia truyền Ngày nay, người ta còn chiết xuất các hợp chất từ thảo dược để làm thuốc, thực phẩm chức năng nhằm để hỗ trợ và điều trị các bệnh như bệnh ung thư, tiểu đường, giảm cân, tăng cường hệ miễn dịch cơ thể, hạ huyết áp …
Ưu điểm của các loại thảo dược là có tác dụng tốt vào nhiều bộ phận cơ thể hơn là Âu dược, không gây nghiện và không gây tác dụng phụ
Trong số 2 loài thuộc chi Gynostemma Blume (họ Bí Cucurbitaceae) có mặt
tại Việt Nam, Giảo cổ lam là dược liệu quý đuợc nhóm nghiên cứu của Phạm Thanh
Kỳ phát hiện lần đầu tiên vào năm 1997 Từ đó cho tới nay, nhiều nghiên cứu trên loài dược liệu này đã được tiến hành, làm sáng tỏ thành phần hoá học, tác dụng dược
lý và từ đó, đưa vào khai thác và sử dụng nguồn dược liệu quý hiếm này phục vụ
chăm sóc sức khoẻ cộng đồng Trong số 2 loài còn lại, Gynostemma laxum (Wall.)
Cogn (hay còn gọi là cây Cổ yếm lá bóng) là dược liệu được người dân ở Trung Quốc sử dụng tương tự như Giảo cổ lam, với tác dụng điều trị viêm khí quản mạn tính, viêm gan truyền nhiễm, viêm thận, loét dạ dày hành tá tràng, phong thấp và đau nhức khớp, bệnh về tim, béo phì, điều trị chức năng thần kinh Tuy nhiên, cho tới nay,
ở Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu về hoạt tính sinh học và thành phần hoá học, tác dụng dược lý cũng như độc tính của loài này